Method Article

Одноклеточное разрешение Трехмерная визуализация нетронутых органоидов

DOI:

10.3791/60709

⸱

June 5th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, 2Department of Cancer Research, Oncode Institute, Hubrecht Institute-KNAW Utrecht, 3Cancer Genomics Center (CGC), 4Hubrecht Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW) and University Medical Center (UMC) Utrecht

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вся 3D структура и клеточное содержание органоидов, а также их фенотипическое сходство с оригинальной тканью могут быть захвачены с помощью протокола 3D-изображения с разрешением одной клетки, описанного здесь. Этот протокол может быть применен к широкому кругу органоидов, меняющихся по происхождению, размеру и форме.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Органоидная технология, в пробирке 3D культивирования миниатюрных тканей, открыла новое экспериментальное окно для клеточных процессов, которые регулируют развитие органов и функции, а также болезни. Микроскопия флуоресценции сыграла важную роль в детальном характеристике их клеточного состава и демонстрации их сходства с тканью, из которого они происходят. В этой статье мы представляем всеобъемлющий протокол для 3D-изображения целых органоидов с высоким разрешением при иммунофлуоресцентной маркировке. Этот метод широко применим для визуализации органоидов, отличающихся по происхождению, размеру и форме. До сих пор мы применили метод дыхательных путей, толстой кишки, почек и печени органоидов, полученных из здоровых тканей человека, а также органоидов опухоли молочной железы человека и органоидов молочной железы мыши. Мы используем оптический клиринговый агент FUnGI, который позволяет приобрести целые 3D органоиды с возможностью одноклеточной количественной оценки маркеров. Этот трехдневный протокол от сбора органоидов до анализа изображений оптимизирован для 3D-изображения с использованием конфокальная микроскопия.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Развитие новых методов культуры, таких как органоидные технологии, позволило культуры органов в блюдо1. Органоиды вырастают в трехмерные (3D) структуры, которые перемешивают их ткани происхождения, поскольку они сохраняют фенотипические и функциональные черты. Органоиды в настоящее время играют важную роль для решения фундаментальныхбиологических вопросов 2,моделирование заболеваний, включая рак 3, и разработкаперсонализированных стратегий лечения 4,,5,,6,,7. С момента первого протокола для генерации органоидов, полученных из кишечныхвзрослых стволовых клеток 8, органоидная технология расширилась, чтобы включить широкий спектр здоровых и раковых тканей, полученных изорганов, включая простату 9,мозг 10,печень 11,12,желудок 13,грудь 14,15,эндометрий 16,16слюнная железа 17,вкусовые рецепторы 18,поджелудочная железа 19, и почки 20 .

Развитие органоидов согласилось с ростом новых методов объемной микроскопии, которые могут визуализировать архитектуру цельной ткани крепления в 3D21,,22,,23,,24. 3D-изображение превосходит традиционную визуализацию секции 2D тканей в визуализации сложной организации биологических образцов. 3D-информация оказывается необходимой для понимания клеточного состава, формы клеток, решений клеточной судьбы и клеточного взаимодействия нетронутых биологических образцов. Неразрушающие методы оптического сечения, такие как конфокальные или мультифотонные лазерные сканирующие микроскопии (CLSM и MLSM) и флуоресценционная микроскопия светового листа (LSFM), теперь позволяют комбинированную визуализацию как мелких деталей, так и общей архитектуры тканей, в рамках одного биологического образца. Этот мощный подход к визуализации дает возможность изучить структурную сложность, которуюможно смоделировать с помощью органоидов 25, и составить карту пространственного распределения, фенотипической идентичности и клеточного состояния всех отдельных клеток, составляя эти 3D-структуры.

Недавно мы опубликовали подробный протокол для 3D-изображения с высоким разрешением фиксированных и очищенных органоидов26. Этот протокол специально разработан и оптимизирован для обработки тонких органоидных структур, в отличие от методологий для больших нетронутыхтканей,таких как DISCO27,28,CUBIC29,,30,,31и CLARITY32,33. Таким образом, этот метод, как правило, применимы к широкому спектру органоидов, отличающихся по происхождению, размеру и форме и клеточному содержанию. Кроме того, по сравнению с другими протоколами объемной визуализации, которые часто требуют значительного времени и усилий, наш протокол является нетребовамой и может быть завершен в течение 3 дней. Мы применили наш 3D протокол визуализации для визуализации архитектуры и клеточного состава недавно разработанных органоидных систем, полученных из различных тканей, в том числедыхательных путей человека 34,почки 20,печени 11, и рак молочной железычеловека органоидов 15. В сочетании с разноцветной флуоресцентной линии отслеживания, этот метод также был использован для выявить биопотенность базальных клеток в мыши молочныхорганоидов 14.

Здесь мы уточняем протокол, вводя нетоксический клиринговый агент FUnGI35. Очистка FUnGI достигается одним инкубационный шаг, легче монтируется из-за его вязкости, и лучше сохраняет флуоресценцию во время хранения. Кроме того, мы вводим додекил-сульфат натрия (SDS) в буфер стирки для повышения ядерных окрашивания, а также силиконовый метод монтажа для легкой подготовки слайда до микроскопии. На рисунке 1 представлен графический обзор протокола(рисунок 1A)и примеры органоидов с 3D-изображением(рисунок 1БХД). Короче говоря, органоиды восстанавливаются из их 3D-матрицы, фиксированной и иммунолабельной, оптически очищены, изображения с помощью конфокальная микроскопия, а затем 3D, оказываемых с программного обеспечения визуализации.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование органоидов, полученных мышью, соответствовало нормативным стандартам и было одобрено Комитетом по этике животных Института Уолтера и Элизы Холл (WEHI). Все человеческие органоидные образцы были извлечены из биобанков с помощью органоидной технологии Хубрехта (HUB, www.hub4organoids.nl). Разрешения были получены Медицинским этическим комитетом UMC Utrecht (METC UMCU) по просьбе HUB для обеспечения соблюдения Голландского закона о медицинских исследованиях с участием людей и информированное согласие было получено от доноров, когда это необходимо.

1. Подготовка реагентов

  1. Для подготовки 4% (w/v) параформальдегида (PFA), тепла 400 мл фосфат-буферного солевого раствора (PBS) до чуть менее 60 градусов по Цельсию в водяной бане. Добавьте 20 г порошка PFA и растворите с помощью мешалки.
    1. Затем добавьте несколько капель 10 M NaOH. Дайте остыть на льду и добавьте несколько капель 10 M HCl, чтобы настроить рН до 7,4. Пополнить с PBS до 500 мл и aliquot (хранить при -20 градусов по Цельсию на срок до 2 месяцев).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не нагревайте выше 60 градусов по Цельсию, чтобы избежать деградации PFA. Время приготовления 4 ч.
  2. Для подготовки PBS с Tween-20 (PBT) (0,1% v/v), добавьте 1 мл Tween-20 до 1 L PBS (хранить при 4 КК на срок до 4 недель).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время приготовления 10 мин.
  3. Для приготовления 100 мл этилендиаминтетраатетической кислоты (ЭДТА) добавьте 18,6 г ЭДТА и 2,5 г naOH до 80 мл dH 2 O.Отрегулируйте рН до8 с 1 М НаОХ и заполните до 100 млДЛ 2О.
  4. Чтобы подготовить 500 мл 1 M Tris, растворите 60,55 г Трис с 42 мл концентрированной (36-38%) HCl в 300 мл dH2O. Отрегулируйте рН до 8 и заполните до 500 мл.
  5. Для подготовки органоидного стирального буфера (OWB) добавьте 1 мл triton X-100, 2 мл 10% (w/v) SDS и 2 г бивейного альбуминового альбумин (BSA) до 1 л PBS (хранить при 4 градусах по Цельсию до 2 недель).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время приготовления 10 мин.
  6. Чтобы сделать 220 мл FUnGI, смешайте 110 мл глицерола с 20 млdH 2O, 2,2 мл буфера Tris (1 м, рН 8,0) и 440 МЛ ЭДТА (0,5 М). Добавить 50 г фруктозы и перемешать при комнатной температуре (РТ) в темноте до растворения. Когда ясно, добавить 49 г фруктозы и перемешать до растворения. Затем добавьте 33,1 г мочевины и перемешайте до растворения (храните при 4 градусах Цельсия в темноте).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не нагревайте, как фруктоза карамелизируется при более высоких температурах. FUnGI состоит из 50% (v/v) глицерола, 9,4% (v/v) dH2O, 10,6 м3 трис базы, 1,1 м EDTA, 2,5 М фруктозы и 2,5 м мочевины. Время приготовления - 1 день.
  7. Для приготовления PBS-BSA (1% ж/в) растворите 1 г BSA в 100 мл PBS (хранить при 4 градусах до 2 недель).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время приготовления 10 мин.

2. Органоидное восстановление

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги применяются к органоидам, выращенным в экстракте мембраны подвала (BME), которые были выращены в пластине 24 хорошо с размером от 100 до 500 мкм.

  1. Аспирировать культуру среды и мыть 1x с ледяной PBS. Избегайте нарушения 3D матрицы.
  2. Положите пластину на лед и добавьте 1 мл раствора для восстановления холодных клеток(таблица материалов) ккаждой хорошо. Инкубировать 30-60 мин при 4 градусов по Цельсию на горизонтальном шейкере (40 об/мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Капли 3D-матрицы должны быть полностью растворены.
  3. Пальто 1 мл пипетки отзыв с BSA путем погружения в 1% PBS-BSA и трубопроводов вверх и вниз 2x. Это покрытие предотвратит прилипание органоидов к кончику. Чтобы покрыть внутреннюю сторону конической трубки 15 мл, заполните 5 мл 1% PBS-BSA, инвертировать 2'3x и отказаться от PBS-BSA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это покрытие необходимо для всех пластиковых расходных материалов до фиксации (шаг 3.3).
  4. Используя наконечник с покрытием, аккуратно переусердствуйте с содержанием колодеца в 5–10 раз и перенесите органоиды в трубки с покрытием 15 мл. Органоиды из разных скважин с одинаковой идентичностью могут быть слились в ту же трубку.
  5. Добавьте 1 мл ледяного 1% PBS-BSA к каждой культуре хорошо, чтобы промыть и собрать все органоиды.
  6. Добавить холодный PBS до 10 мл и спина вниз в течение 3 мин при 70 х г и 4 градусов по Цельсию, чтобы получить жесткие гранулы без видимого слоя 3D-матрицы. Аккуратно удалите супернатант.

3. Фиксация и блокирование

  1. Тщательно повторно использовать органоиды в 1 мл ледяной PFA с помощью покрытием 1 мл наконечник.
  2. Исправить при 4 градусов по Цельсию в течение 45 мин. Аккуратно resuspend органоидов на полпути через время фиксации с помощью покрытием 1 мл отзыв для обеспечения даже фиксации среди всех органоидов.
  3. Добавить 10 мл ледяного PBT в трубку, аккуратно перемешать путем инвертирования трубки, инкубировать в течение 10 минут и спина вниз на 70 х г, как при 4 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого шага дальше покрытие советы, как правило, не требуется, поскольку большинство органоидных типов не прилипают к кончику после фиксации. Тем не менее, некоторые органоиды могут потребовать покрытием пластмассы даже после фиксации.
  4. Блокируйте органоиды путем повторного перерасхода гранул в ледяном OWB (не менее 200 МКЛ OWB на колодец) и перенесите органоиды на 24 хорошо подвесной пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды из одной большой гранулы могут быть разделены на несколько скважин для выполнения различных окрашивания.
  5. Инкубационный при 4 градусах Цельсия, по крайней мере 15 мин.

4. Иммунолабеля

  1. Pipette 200 йл OWB в пустой колодец, чтобы служить в качестве эталона хорошо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунолабелирование также может быть выполнено в 48- или 96-колодцев пластин для снижения использования антител. Тем не менее, пользователь должен знать, что как окрашивание и стиральная производительность может быть уменьшена из-за меньшего объема.
  2. Позвольте органоидам осесть в нижней части пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно проверить с помощью стереомикроскопа и облегчается с помощью темного фона.
  3. Наклоните пластину на 45 градусов и удалите OWB, оставляя органоиды в 200 МКЛ OWB (используйте эталонный колодец для оценки 200 йл).
  4. Добавьте 200 МЛ OWB с первичными антителами 2x концентрированными (например, E-кадерин (1:400) и Ki67 (1:200) для результатов на рисунке 1; кератин 5 (1:500), кератин 8/18 (1:200), MRP2 (1:50) и Ki67 (1:200) для результатов на рисунке 2) и инкубируют на ночь при 4 градусах цельсия, при этом слегка качаются/трясутся (40 об/мин на горизонтальном шейкере).
  5. На следующий день добавьте 1 мл OWB.
  6. Разрешить органоидов поселиться в нижней части пластины в течение 3 мин. Удалите OWB оставляя 200 йл в пластине. Добавить 1 мл OWB и промыть 2 ч с мягким качания / встряхивания.
  7. Повторите шаг 4.6 еще два раза.
  8. Разрешить органоидов поселиться в нижней части пластины в течение 3 мин. Удалите OWB оставляя 200 йл в колодец.
  9. Добавьте 200 МЛ OWB со вторичными антителами, конъюгированными антителами и красителями 2x концентрированными (например, DAPI (1:1000), крыса-AF488 (1:500), мышь-AF555 (1:500), poidhallin-AF647 (1:100) для результатов на рисунке 1; DAPI (1:1000), крыса-AF488 (1:500), кролик-AF555 (1:500), мышь-AF555 (1:500), фаллоидин-AF647 (1:100) для результатов на рисунке 2; DAPI (1:1000), фаллоидин-AF647 (1:100) для результатов на рисунке 3) и инкубировать на ночь при 4 градусов по Цельсию, при этом слегка качаясь/встряхивая.
  10. На следующий день повторите шаги 4,5–4,7.
  11. Перенесите органоиды в трубку 1,5 мл и вращайся вниз при 70 x g в течение 3 мин.

5. Оптическая очистка органоидов

  1. Удалите как можно больше OWB путем пипетки, не нарушая органоидов.
  2. Добавьте FUnGI (по крайней мере 50 йл, RT) с помощью наконечника 200 йл с отрезанием конца и осторожно расходуйтесь, чтобы предотвратить образование пузырьков. Инкубировать на RT в течение 20 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптическая очистка FUnGI может привести к незначительной усадки тканей. Это не повлияет на общую морфологию однослойных и многослойных органоидов; однако сферические однослойные органоиды с большими люменами могут рухнуть. Протокол можно приостановить здесь, а образцы можно хранить при 4 градусах по Цельсию (не менее 1 недели) или при -20 градусов по Цельсию (не менее 6 месяцев).

6. Подготовка слайда для конфокальных изображений

  1. Приготовьте шприц 10 мл с силиконовым герметиком(Таблица материалов). Прикрепите наконечник 200 МКЛ и отрежьте конец, чтобы нежный поток вязкого силикона после нажатия шприца. Используйте шприц, чтобы нарисовать прямоугольник 1 см х 2 см в середине слайда.
  2. Отрежьте конец кончика 200 йл и перенесите органоиды в FUnGI на середину прямоугольника.
  3. Поместите крышку сверху. Чтобы свести к минимуму захваченных пузырьков воздуха, поместите левую сторону крышки во-первых, а затем медленно опустите крышку слева направо, пока нет захваченного воздуха, а затем отпустите крышки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Спейсеры, которые являются одновременного размера органоидов могут быть использованы для предотвращения их повреждения.
  4. Аккуратно нанесите давление на все края крышки, чтобы прочно прикрепить его к силиконовому герметикому. Слайд готов к визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь, и образец может храниться при 4 градусах по Цельсию (не менее 1 недели) или -20 градусов по Цельсию (не менее 6 месяцев).

7. Приобретение и обработка изображений

  1. Использование конфокального лазерного сканирующего микроскопа(Таблица материалов), изображение слайда с мульти-погружения 25x или погружения в нефть 40x цель для конфокальных изображений.
    1. Используйте следующие настройки приобретения для 25x цели: рамка режима сканирования, размер кадра 1024 x 1024, размер voxel 332 нм х 332 нм х 1,2 мкм, пиксельное время жителя Lt;2, двунаправленное сканирование, усреднение числа 1, глубина бита 8. Чтобы уменьшить фотоотлив, используйте низкую мощность лазера (lt;5% в целом, lt;10% для слабого окрашивания).
    2. Используйте режим «К-стек» для определения нижних и верхних границ и определения оптимального размера шага. При изображении больших органоидных структур или нескольких органоидов вместе, используйте режим плитки с 10% перекрытия и указать область интереса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью этих параметров размер данных для типичного органоида диаметром 300 мкм составляет 1 ГБ.
  2. Для наборов данных сканирования плитки, сшить файлы изображений в программном обеспечении сопровождаетсямикроскопом (Таблица материалов). В разделе обработки выберите Stitching в качестве метода, выберите New Output по параметрам и выберите файл для сшивания. Нажмите Применить, чтобы начать шить.
  3. Получите 3D-представление изображения под вкладкой 3D View в программном обеспечении изображений(Таблица материалов)и впоследствии оптимизируйте яркость, контрастные и 3D-свойства рендеринга. Экспорт RGB снимки результатов, как TIFF файлов.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуализация органоидов в 3D позволяет очень подробно визуализировать архитектуру, клеточный состав, а также внутриклеточные процессы. Представленный метод является нетребовамым и, предположительно, может быть применен к широкому кругу органоидных систем, которые являются производными от различных органов или видов-хозяек.

Сила 3D-изображения по сравнению с 2D-изображением иллюстрируется изображениями органоидов молочной железы мыши, которые были созданы с помощью недавно опубликованныхметодов 14. Центральный слой этих органоидов состоит из колонно-образных K8/K18-положительных светящихся клеток, а внешний слой содержит удлиненные K5-постивные базальныеклетки (рисунок 2A), который резюмирует морфологию молочной железы in vivo. Эта поляризованная организация является сложной для оценки из 2D оптической секции того же органоида(рисунок 2B, средняя панель). Другим примером сложной структуры, которую невозможно интерпретировать без 3D-информации, является сеть MRP2-положительных canaliculi, которые облегчают сбор желчной жидкости органоидовпечени человека 11 (рисунок 2B). Это иллюстрирует, как наш метод позволяет визуализировать основные структурные особенности органоидов. Кроме того, полученное качество и разрешение позволяют полуавтоматической сегментации и анализа изображений. Таким образом, общее количество клеток и наличие маркеров можно количественно оценить в конкретных клеточных подтипах у целых органоидов. Мы иллюстрировать это, сегментации ядер всего органоида, содержащего 140 клеток, из которых 3 клетки отображают высокую положительность для маркера цикла клеток Ki67 (Рисунок 2C). Канал DAPI выбирается в качестве исходных каналов, а сегменты генерируются на основе порогового шага интенсивности и диаметра сферы 10 мкм. Трогательные объекты делятся по регионам, растущим из точек семян. Наконец, фильтр размера 10 воксельов применяется для удаления небольших сегментов шума индуцированных. Для каждого сегмента, представляющего ядро, средняя интенсивность канала Ki67 затем экспортируется для построения.

Недавно мы разработали оптический клиринговый агент FUnGI35, который мы теперь интегрированы в этот протокол для уточнения прозрачности органоидов. FUnGI прост в использовании, так как очистка легко достигается одним шагом инкубации после иммунофлуоресцентного окрашивания. Дополнительным преимуществом агента является его вязкость, что облегчает обработку образцов во время монтажа слайдов. Флуоресцентные образцы в FUnGI сохраняют свою флуоресценцию даже при хранимом в течение нескольких месяцев при -20 градусах Цельсия. Мы демонстрируем, что FUnGI превосходит неясные и фруктозы-глицерола в флуоресцентных качества сигнала глубоко в органоидов (Рисунок 3A,B), и что FunGI-очищены органоиды имеют общую повышенную интенсивность флуоресценции по сравнению с неясными органоидов (Рисунок 3C).

Таким образом, мы описываем нетребовательное, воспроизводимое 3D-метод изображения для получения объемных данных иммунолабелированных органоидов. Этот протокол может быть легко использован для изображения различных органоидов, включая мышиного и человеческого происхождения, из здоровых и болезней моделей. Простая подготовка образца может быть адаптирована для облегчения конфокальных, многофотонных и светлых флуоресцентных микроскопов для получения клеточного и субклеточного разрешения целых органоидов.

figure-results-1
Рисунок 1: Схематический обзор протокола 3D-изображения с высоким разрешением. Органоиды восстанавливаются из их 3D-матрицы. Фиксация и блокирование выполняется до иммунолабеля антителами и красителями. Оптическая очистка достигается в один шаг с помощью клирингового агента FUnGI. 3D визуализация изображений может быть выполнена с помощью программного обеспечения для визуализации. (A)Схематический обзор процедуры. (B) Очищено цельно-монтировать 3D конфокальное изображение человека толстой кишки органоидного иммунолабеля для F-актина и E-кадхерин (E-cad) (25x нефтяной цели). Шкала бар 40 мкм. (C) Очищено цельно-монтировать 3D конфокальные изображения. Шкала бар 20 мкм. (D)Увеличенная оптическая секция человеческой толстой кишки органоидного иммунолабеля для F-актина, E-кадерин (E-cad) и Ki67 (25x цель масла). Шкала планки 5 мкм. Эта цифра была изменена с Dekkers et al.26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Объемная визуализация визуализирует сложную 3D архитектуру. Конфокальные изображения, представляющие наборы данных с цельной креплением (левая панель), 2D оптические секции (средняя панель) и 3D области увеличенной области (правая панель). (A) органоид, полученный из одной базальной клетки молочной железы мыши, иллюстрирующий 3D организацию удлиненных молочных базальных клеток, которые окружают светящиеся клетки или помечены для K8/18, K5 и F-actin (очистка фруктозы-глицерола; 25x масляная цель). Масштабные бары представляют собой 55 мкм (левая панель) и 40 мкм (средние и правые панели). (B)органоид печени плода человека со сложной 3D сетью MRP2-положительных canaliculi, помеченных для DAPI, MRP2 и F-actin (очистка фруктозы-глицерола; 40x масляная цель). Масштабные бары представляют собой 25 мкм (левая панель) и 8 мкм (средние и правые панели). (C) Confocal 3D цельно-монтажное изображение органоида печени плода человека помечены DAPI и Ki67 (левая панель) и сегментированные изображения на канале DAPI с помощью программного обеспечения изображений (средняя панель). Шкала бар 15 мкм. График, на графике представляющий означает интенсивность Ki67 во всех клетках (DAPI-сегментированных) всего органоида (140 клеток) (правая панель). Эта цифра была изменена с Dekkers et al.26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Оптическая очистка органоидов с помощью FUnGI. (A)Репрезентативные изображения человеческих органоидов толстой кишки, помеченных F-актином (зеленым) и DAPI (серый) и изображенных без очистки, очищенных фруктозой-глицеролом или очищенных с FUnGI (25x масляная цель). Левая панель: 3D рендеринг органоида. Правая панель: оптический сечение органоида на глубине 150 мкм. Для состояния «без очистки» яркость изображения должна была быть увеличена по сравнению с условиями «фруктоза-глицерол» и «Фунги» для визуализации органоида. Шкала планки 50 мкм. (B)Нелинейная регрессия подходит, показывающая снижение интенсивности DAPI с увеличением глубины з для различных методов оптической очистки. Значения представляют интенсивность отдельных клеток, обнаруженных сегментацией DAPI, и нормализуются до средней интенсивности DAPI первых 50 мкм органоида. Чтобы избежать недооценки зрения, вызванного более яркими клетками на более глубоких краях и начинающими структурами, были проанализированы только центральные области органоидов. (C)Три органоида на состояние аналогичного размера и глубины к крышке были изображены с использованием одинаковых параметров микроскопа. Полные наборы 3D-данных были сегментированы по сигналу DAPI для сравнения. График бара, показывающий среднюю интенсивность DAPI с различными методами очистки на полных сегментированных наборах данных. Данные изображаются как среднее ± SD. Значения являются интенсивности отдельных ячеек, обнаруженных при сегментации DAPI. - p lt; 0.0001, тест Kruskal-Wallis с двусторонним сравнением Данна после специального тестирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы выдвинули подробный протокол для 3D-изображения нетронутых органоидов с одноклеточным разрешением. Для успешного выполнения этого протокола необходимо предпринять некоторые важные шаги. В этом разделе мы подчеркиваем эти шаги и обеспечиваем устранение неполадок.

Первым важным шагом является удаление 3D-матрицы. Большинство органоидов распространяются в пробирке с использованием матриц, которые имитируют in vivo внеклеточной среды для повышения образования хорошо поляризованных 3D структур. Фиксация и последующее окрашивание в 3D-матрице возможно, но может быть невыгодным для проникновения антител или может генерировать высокий фоновый сигнал (данные не показаны). Эффективное удаление матриц может зависеть от типа матрицы, количества и размера органоидов и длительного культивирования. Поэтому оптимизация может потребоваться для различных культурных условий. Для органоидов, обученных в Matrigel или BME, достаточно 30-60-минутного шага в растворе восстановления холодных клеток, чтобы растворить матрицу, не повреждая органоиды. Кроме того, удаление поддерживающей 3D-матрицы может привести к потере местных структур и нарушению органоидных контактов с другими типами клеток, например, когда органоиды совместно культуры с фибробластов или иммунных клеток. Кроме того, оптимальная органоидная фиксация имеет решающее значение для сохранения архитектуры 3D тканей, антигенности белка и минимизации аутофторесценции. Фиксация в течение 45 мин с 4% PFA при 4 градусов по Цельсию, как правило, достаточно для маркировки широкого спектра органоидов и антигенов. Тем не менее, более длительный шаг фиксации, до 4 ч, как правило, более подходит для органоидов, выражаюющих флуоресцентные белки репортера, но потребует оптимизации для различных флюорофоров. Время фиксации короче 20 минут недостаточно, чтобы правильно маркировать F-актин с помощью фаллоидин зондов. Другой распространенной проблемой является потеря органоидов во время протокола. Поэтому важно (i) тщательно пальто пипетки советы и трубки с 1% BSA-PBS, как описано при обработке нефиксированных органоидов, чтобы предотвратить их от прилипания к пластмассам, (ii) использовать низкоприлипание или подвески пластин, чтобы предотвратить образец от прилипания к пластине, и (iii) позволяют достаточно времени для органоидов, чтобы поселиться в нижней части пластины, прежде чем тщательно удалить буферы. Трубопроводный вязкий FUnGI может ввести пузырьки. Обработка очищенного образца на RT снижает вязкость и улучшает простоту использования, тем самым минимизируя потерю органоидов. Хотя большинство органоидов просты в обращении, кистозные органоиды с увеличенным люменом имеют высокую тенденцию к коллапсу при фиксации с 4% PFA или при очищении с FUnGI. Этот эффект можно уменьшить, но не полностью предотвратить, используя различные фиксаторы (например, формалин или PFA-glutaraldehyde). Однако это потенциально может повлиять на аутофторесценцию, проникновение антител и доступность эпитопа. Когда кистозные органоиды появляются сложенными после очистки, рекомендуется пропустить шаг очистки и изображение с помощью мульти-фотон-микроскопии, которая меньше затрудняется рассеянием света. Наконец, получение всей 3D-структуры органоидов может быть сложной задачей и требует минимального расстояния между крышкой и органоидом. Кроме того, когда органоиды имеют место для перемещения в их монтаж агента, это может привести к X- и Y-сдвиги при записи данных в глубину. Использование менее силиконового герметика во время подготовки слайда может решить неоптимальный монтаж между крышкой и микроскоп слайд. Тем не менее, слишком мало силикона может привести к органоидного сжатия и потери их присущей 3D структуры. FUnGI улучшает управляемость для монтажа слайдов и стабильность органоидов во время визуализации, благодаря своей более высокой вязкости.

Хотя этот протокол может быть использован для широкого спектра приложений для углубленного изучения клеточного содержания и 3D-архитектуры нетронутых органоидов, следует учитывать определенные ограничения. Эта методология является довольно низкой пропускной способностью и трудоемкой. Действительно, пользователи должны иметь в виду, что визуализация больших нетронутых органоидов в 3D требует как плитки, так и приобретения образцов в Кью, что приводит к длительным временам приобретения. Более быстрая визуализация может быть достигнута с помощью микроскопа активов, в том числе резонансных или спиннинг сканер диска, или с помощью технологии светового листамикроскопа 26. Другое соображение заключается в том, что маркеры могут быть неоднородно выражены между различными органоидами из одного и того же образца. Таким образом, несколько органоидов должны быть приобретены, чтобы лучше захватить эту органоидную неоднородность в культуре. Наконец, в то время как полная влажная лабораторная процедура проста, постобработка данных требует навыков в программном обеспечении анализа изображений для 3D визуализации и количественной оценки, а также статистики для майнинга всей информации, присутствуют в наборе данных.

За последнее десятилетие область объемной визуализации значительно продвинулась вперед, благодаря как разработке широкого спектра оптических клиринговых агентов, так и усовершенствованию микроскопиии вычислительных технологий 27,,30,,31. В то время как в прошлом большинство исследований были сосредоточены на большой объем изображения органов или связанных с ними опухолей, в последнее время методы для небольших и более хрупких тканей, в томчисле органоидных структур, были разработаны 36,37,38. Недавно мы опубликовали простой и быстрый метод для визуализации цельно-монтажных органоидов различного происхождения, размера и формы на уровне одной клетки для последующего 3Dрендеринга и анализа изображений 26, который мы представили здесь с некоторыми улучшениями (например, FUnGI, силиконовый монтаж) и сопровождается видео-протоколом. Этот метод превосходит обычные 2D секционные изображения в расшифровке сложной морфологии клеток иархитектуры тканей (рисунок 2) и прост в реализации в лабораториях с конфокальцатором. При небольшой адаптации к протоколу, образцы могут быть совместимы с, супер-разрешение конфокальных, мульти-фотон, а также свет изображения листа, что делает этот протокол широко применимы и предоставляет пользователям мощный инструмент, чтобы лучше понять многомерную сложность, которая может быть смоделирована с органоидами.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы очень благодарны за техническую поддержку со стороны Центра детской онкологии Принцессы Месима, а также Института Хубрехта и Зейсса за поддержку и сотрудничество в области визуализации. Все изображения были выполнены в центре визуализации принцессы Месима. Эта работа была финансово поддержана Центром детской онкологии Принцессы Месима. JFD была поддержана Глобальной стипендией Марии Кюри и грантом VENI от Нидерландской организации научных исследований (НВО). АКР была поддержана стартовым грантом Европейского совета (ЕКР).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 мл Safe-lock центрифугаEppendorfEP0030 120.094
мл Safe-lock центрифугаEppendorfEP0030 120.094
Бычья сыворотка Альбумин (BSA)Sigma AldrichA3059
Раствор для восстановления клетокCorning354253
Конфокальный микроскопZeissLSM880
Программное обеспечение для конфокального микроскопа ZENZeissZEN черный/синий
конические трубки 15 млGreiner Bio-One5618-8271
Покровное стекло #1.5 24x60ммMenzel-GlazerG418-15
Покровное стекло #1.5 48x60ммProSciTechG425-4860
DAPIThermoFisherD3571разведение 1:1000
Диссекция СтереомикроскопLeicaM205 FA
Двухсторонняя клейкая лента 12,7 мм 6,35 мСкотч 3M
Dulbecco's Фосфатно-солевой буфер (DPBS)Gibco141901441x
EDTAInvitrogen15576-028
Focus Clear CelExplorerFC-101
ФруктозаSigma AldrichF0127
Глицериноваястрела76050771.0500
Дифференцированная передаточная пипеткаSamco222-15
Горизонтальная тряскаVWR444-2900
Соляная кислота (HCl)Ajax Firechem.265.2.5L-PL10M стоковый раствор, коррозионный
Imaris программное обеспечениеBitplane
Микроскоп слайды SuperfrostThermoFisher10143352края земли, 90 градусов 26 мм ~ 76 мм
ПараформальдегидSigma AldrichP6148-500gОпасный
фаллоидин Alexa Fluor 647ThermoFisherA22287разведение 1:100-200
E-кадгеринThermoFisher13-1900разведение 1:400
Ki-67BD BiosciencesB56разведение 1:200
Кератин 5BioLegend905501разведение 1:500
Кератин 8/18DSHB (Университет Айовы)разведение 1:200
MRP2Abcamab3373разведение 1:50
Вторичный IgG крыс (H+L) Alexa Fluor 488ThermoFisherA-21208разведение 1:500
Вторичный мышиный IgG (H+L) Alexa Fluor 555ThermoFisherA-31570разведение 1:500
Вторичный кролик IgG (H+L) Alexa Fluor 555ThermoFisherA-31572разведение 1:500
Силиконовый герметикGriffonS-200
Додецилсульфат натрияThermoFisher28312
Гранулы гидроксида натрия (NaOH)Merck Millipore56753010 М стоковый раствор, коррозионная
суспензия клеточных культуральных планшетовGreiner Bio-One66210224-луночный
TrisFisher Scientific11486631
Triton X-100Sigma AldrichT8532Dangerous
Tween-20Sigma AldrichP1379
UltraPure Низкая температура плавления (LMP) AgaroseThermoFisher16520050
мочевинойSigma Aldrich51456
Рабочая станцияDell
2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sato, T., Clevers, H. Snapshot: Growing Organoids from Stem Cells. Cell. 161 (7), 1700(2015).
  2. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  3. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  4. Bartfeld, S., Stem Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
  5. Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
  6. Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), 84(2016).
  7. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
  8. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  9. Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  10. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  11. Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  12. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  13. Nanki, K., et al. Divergent Routes toward Wnt and R-spondin Niche Independency during Human Gastric Carcinogenesis. Cell. 174 (4), 856-869 (2018).
  14. Jamieson, P. R., et al. Derivation of a robust mouse mammary organoid system for studying tissue dynamics. Development. 144 (6), 1065-1071 (2017).
  15. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  16. Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  17. Maimets, M., et al. Long-Term In vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
  18. Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
  19. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  20. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
  21. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  22. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. SnapShot: Tissue Clearing. Cell. 171 (2), 496(2017).
  23. Rios, A. C., et al. Essential role for a novel population of binucleated mammary epithelial cells in lactation. Nature Communications. 7, 11400(2016).
  24. Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
  25. Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
  26. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  27. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  28. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  29. Kubota, S. I., et al. Whole-Body Profiling of Cancer Metastasis with Single-Cell Resolution. Cell Reports. 20, 236-250 (2017).
  30. Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21 (4), 625-637 (2018).
  31. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  32. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  33. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  34. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).
  35. Rios, A. C., et al. Intraclonal Plasticity in Mammary Tumors Revealed through Large-Scale Single-Cell Resolution 3D Imaging. Cancer Cell. 35 (4), 618-632 (2019).
  36. Chen, Y., et al. Application of three-dimensional imaging to the intestinal crypt organoids and biopsied intestinal tissues. The Scientific World Journal. 2013, 624342(2013).
  37. Costa, E. C., Silva, D. N., Moreira, A. F., Correia, I. J. Optical clearing methods: An overview of the techniques used for the imaging of 3D spheroids. Biotechnology and Bioengineering. 116 (10), 2742-2763 (2019).
  38. Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146, 166884(2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Organoid ImagingConfocal MicroscopyOptical ClearingFUnGI AgentImmunofluorescent Labeling3D ReconstructionSingle Cell ResolutionZ Stack AcquisitionTiling ModeSlide Preparation

Related Articles