Одноклеточное разрешение Трехмерная визуализация нетронутых органоидов

Развитие новых методов культуры, таких как органоидные технологии, позволило культуры органов в блюдо¹. Органоиды вырастают в трехмерные (3D) структуры, которые перемешивают их ткани происхождения, поскольку они сохраняют фенотипические и функциональные черты. Органоиды в настоящее время играют важную роль для решения фундаментальных^{биологических вопросов 2},^{моделирование заболеваний, включая рак 3}, и разработка^{персонализированных стратегий лечения 4,,5,,6,,7}. С момента первого протокола для генерации органоидов, полученных из кишечных^{взрослых стволовых клеток 8}, органоидная технология расширилась, чтобы включить широкий спектр здоровых и раковых тканей, полученных из^{органов, включая простату 9,мозг 10,печень 11,12},^{желудок 13},^{грудь 14,15},^{эндометрий 16},^{16слюнная железа 17},^{вкусовые рецепторы 18},^{поджелудочная железа 19}, и почки 20 .

Развитие органоидов согласилось с ростом новых методов объемной микроскопии, которые могут визуализировать архитектуру цельной ткани крепления в 3D^{21,,22,,23,,24}. 3D-изображение превосходит традиционную визуализацию секции 2D тканей в визуализации сложной организации биологических образцов. 3D-информация оказывается необходимой для понимания клеточного состава, формы клеток, решений клеточной судьбы и клеточного взаимодействия нетронутых биологических образцов. Неразрушающие методы оптического сечения, такие как конфокальные или мультифотонные лазерные сканирующие микроскопии (CLSM и MLSM) и флуоресценционная микроскопия светового листа (LSFM), теперь позволяют комбинированную визуализацию как мелких деталей, так и общей архитектуры тканей, в рамках одного биологического образца. Этот мощный подход к визуализации дает возможность изучить структурную сложность, которую^{можно смоделировать с помощью органоидов 25, и} составить карту пространственного распределения, фенотипической идентичности и клеточного состояния всех отдельных клеток, составляя эти 3D-структуры.

Недавно мы опубликовали подробный протокол для 3D-изображения с высоким разрешением фиксированных и очищенных органоидов²⁶. Этот протокол специально разработан и оптимизирован для обработки тонких органоидных структур, в отличие от методологий для больших нетронутых^{тканей,}таких как DISCO^27,28,CUBIC^29,,30,,31и CLARITY^32,33. Таким образом, этот метод, как правило, применимы к широкому спектру органоидов, отличающихся по происхождению, размеру и форме и клеточному содержанию. Кроме того, по сравнению с другими протоколами объемной визуализации, которые часто требуют значительного времени и усилий, наш протокол является нетребовамой и может быть завершен в течение 3 дней. Мы применили наш 3D протокол визуализации для визуализации архитектуры и клеточного состава недавно разработанных органоидных систем, полученных из различных тканей, в том числе^{дыхательных путей человека 34},^{почки 20},^{печени 11}, и рак молочной железы^{человека органоидов 15}. В сочетании с разноцветной флуоресцентной линии отслеживания, этот метод также был использован для выявить биопотенность базальных клеток в мыши молочных^{органоидов 14}.

Здесь мы уточняем протокол, вводя нетоксический клиринговый агент FUnGI³⁵. Очистка FUnGI достигается одним инкубационный шаг, легче монтируется из-за его вязкости, и лучше сохраняет флуоресценцию во время хранения. Кроме того, мы вводим додекил-сульфат натрия (SDS) в буфер стирки для повышения ядерных окрашивания, а также силиконовый метод монтажа для легкой подготовки слайда до микроскопии. На рисунке 1 представлен графический обзор протокола(рисунок 1A)и примеры органоидов с 3D-изображением(рисунок 1БХД). Короче говоря, органоиды восстанавливаются из их 3D-матрицы, фиксированной и иммунолабельной, оптически очищены, изображения с помощью конфокальная микроскопия, а затем 3D, оказываемых с программного обеспечения визуализации.

Использование органоидов, полученных мышью, соответствовало нормативным стандартам и было одобрено Комитетом по этике животных Института Уолтера и Элизы Холл (WEHI). Все человеческие органоидные образцы были извлечены из биобанков с помощью органоидной технологии Хубрехта (HUB, www.hub4organoids.nl). Разрешения были получены Медицинским этическим комитетом UMC Utrecht (METC UMCU) по просьбе HUB для обеспечения соблюдения Голландского закона о медицинских исследованиях с участием людей и информированное согласие было получено от доноров, когда это необходимо.

1. Подготовка реагентов

1. Для подготовки 4% (w/v) параформальдегида (PFA), тепла 400 мл фосфат-буферного солевого раствора (PBS) до чуть менее 60 градусов по Цельсию в водяной бане. Добавьте 20 г порошка PFA и растворите с помощью мешалки.
   1. Затем добавьте несколько капель 10 M NaOH. Дайте остыть на льду и добавьте несколько капель 10 M HCl, чтобы настроить рН до 7,4. Пополнить с PBS до 500 мл и aliquot (хранить при -20 градусов по Цельсию на срок до 2 месяцев).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не нагревайте выше 60 градусов по Цельсию, чтобы избежать деградации PFA. Время приготовления 4 ч.
2. Для подготовки PBS с Tween-20 (PBT) (0,1% v/v), добавьте 1 мл Tween-20 до 1 L PBS (хранить при 4 КК на срок до 4 недель).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время приготовления 10 мин.
3. Для приготовления 100 мл этилендиаминтетраатетической кислоты (ЭДТА) добавьте 18,6 г ЭДТА и 2,5 г naOH до 80 мл dH 2 O._{Отрегулируйте рН до}8 с 1 М НаОХ и заполните до 100 мл_{ДЛ 2}О.
4. Чтобы подготовить 500 мл 1 M Tris, растворите 60,55 г Трис с 42 мл концентрированной (36-38%) HCl в 300 мл dH₂O. Отрегулируйте рН до 8 и заполните до 500 мл.
5. Для подготовки органоидного стирального буфера (OWB) добавьте 1 мл triton X-100, 2 мл 10% (w/v) SDS и 2 г бивейного альбуминового альбумин (BSA) до 1 л PBS (хранить при 4 градусах по Цельсию до 2 недель).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время приготовления 10 мин.
6. Чтобы сделать 220 мл FUnGI, смешайте 110 мл глицерола с 20 мл_{dH 2}O, 2,2 мл буфера Tris (1 м, рН 8,0) и 440 МЛ ЭДТА (0,5 М). Добавить 50 г фруктозы и перемешать при комнатной температуре (РТ) в темноте до растворения. Когда ясно, добавить 49 г фруктозы и перемешать до растворения. Затем добавьте 33,1 г мочевины и перемешайте до растворения (храните при 4 градусах Цельсия в темноте).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не нагревайте, как фруктоза карамелизируется при более высоких температурах. FUnGI состоит из 50% (v/v) глицерола, 9,4% (v/v) dH2O, 10,6 м3 трис базы, 1,1 м EDTA, 2,5 М фруктозы и 2,5 м мочевины. Время приготовления - 1 день.
7. Для приготовления PBS-BSA (1% ж/в) растворите 1 г BSA в 100 мл PBS (хранить при 4 градусах до 2 недель).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время приготовления 10 мин.

2. Органоидное восстановление

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги применяются к органоидам, выращенным в экстракте мембраны подвала (BME), которые были выращены в пластине 24 хорошо с размером от 100 до 500 мкм.

1. Аспирировать культуру среды и мыть 1x с ледяной PBS. Избегайте нарушения 3D матрицы.
2. Положите пластину на лед и добавьте 1 мл раствора для восстановления холодных клеток(таблица материалов) ккаждой хорошо. Инкубировать 30-60 мин при 4 градусов по Цельсию на горизонтальном шейкере (40 об/мин).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Капли 3D-матрицы должны быть полностью растворены.
3. Пальто 1 мл пипетки отзыв с BSA путем погружения в 1% PBS-BSA и трубопроводов вверх и вниз 2x. Это покрытие предотвратит прилипание органоидов к кончику. Чтобы покрыть внутреннюю сторону конической трубки 15 мл, заполните 5 мл 1% PBS-BSA, инвертировать 2'3x и отказаться от PBS-BSA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это покрытие необходимо для всех пластиковых расходных материалов до фиксации (шаг 3.3).
4. Используя наконечник с покрытием, аккуратно переусердствуйте с содержанием колодеца в 5–10 раз и перенесите органоиды в трубки с покрытием 15 мл. Органоиды из разных скважин с одинаковой идентичностью могут быть слились в ту же трубку.
5. Добавьте 1 мл ледяного 1% PBS-BSA к каждой культуре хорошо, чтобы промыть и собрать все органоиды.
6. Добавить холодный PBS до 10 мл и спина вниз в течение 3 мин при 70 х г и 4 градусов по Цельсию, чтобы получить жесткие гранулы без видимого слоя 3D-матрицы. Аккуратно удалите супернатант.

3. Фиксация и блокирование

1. Тщательно повторно использовать органоиды в 1 мл ледяной PFA с помощью покрытием 1 мл наконечник.
2. Исправить при 4 градусов по Цельсию в течение 45 мин. Аккуратно resuspend органоидов на полпути через время фиксации с помощью покрытием 1 мл отзыв для обеспечения даже фиксации среди всех органоидов.
3. Добавить 10 мл ледяного PBT в трубку, аккуратно перемешать путем инвертирования трубки, инкубировать в течение 10 минут и спина вниз на 70 х г, как при 4 градусов по Цельсию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С этого шага дальше покрытие советы, как правило, не требуется, поскольку большинство органоидных типов не прилипают к кончику после фиксации. Тем не менее, некоторые органоиды могут потребовать покрытием пластмассы даже после фиксации.
4. Блокируйте органоиды путем повторного перерасхода гранул в ледяном OWB (не менее 200 МКЛ OWB на колодец) и перенесите органоиды на 24 хорошо подвесной пластины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды из одной большой гранулы могут быть разделены на несколько скважин для выполнения различных окрашивания.
5. Инкубационный при 4 градусах Цельсия, по крайней мере 15 мин.

4. Иммунолабеля

1. Pipette 200 йл OWB в пустой колодец, чтобы служить в качестве эталона хорошо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунолабелирование также может быть выполнено в 48- или 96-колодцев пластин для снижения использования антител. Тем не менее, пользователь должен знать, что как окрашивание и стиральная производительность может быть уменьшена из-за меньшего объема.
2. Позвольте органоидам осесть в нижней части пластины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно проверить с помощью стереомикроскопа и облегчается с помощью темного фона.
3. Наклоните пластину на 45 градусов и удалите OWB, оставляя органоиды в 200 МКЛ OWB (используйте эталонный колодец для оценки 200 йл).
4. Добавьте 200 МЛ OWB с первичными антителами 2x концентрированными (например, E-кадерин (1:400) и Ki67 (1:200) для результатов на рисунке 1; кератин 5 (1:500), кератин 8/18 (1:200), MRP2 (1:50) и Ki67 (1:200) для результатов на рисунке 2) и инкубируют на ночь при 4 градусах цельсия, при этом слегка качаются/трясутся (40 об/мин на горизонтальном шейкере).
5. На следующий день добавьте 1 мл OWB.
6. Разрешить органоидов поселиться в нижней части пластины в течение 3 мин. Удалите OWB оставляя 200 йл в пластине. Добавить 1 мл OWB и промыть 2 ч с мягким качания / встряхивания.
7. Повторите шаг 4.6 еще два раза.
8. Разрешить органоидов поселиться в нижней части пластины в течение 3 мин. Удалите OWB оставляя 200 йл в колодец.
9. Добавьте 200 МЛ OWB со вторичными антителами, конъюгированными антителами и красителями 2x концентрированными (например, DAPI (1:1000), крыса-AF488 (1:500), мышь-AF555 (1:500), poidhallin-AF647 (1:100) для результатов на рисунке 1; DAPI (1:1000), крыса-AF488 (1:500), кролик-AF555 (1:500), мышь-AF555 (1:500), фаллоидин-AF647 (1:100) для результатов на рисунке 2; DAPI (1:1000), фаллоидин-AF647 (1:100) для результатов на рисунке 3) и инкубировать на ночь при 4 градусов по Цельсию, при этом слегка качаясь/встряхивая.
10. На следующий день повторите шаги 4,5–4,7.
11. Перенесите органоиды в трубку 1,5 мл и вращайся вниз при 70 x g в течение 3 мин.

5. Оптическая очистка органоидов

1. Удалите как можно больше OWB путем пипетки, не нарушая органоидов.
2. Добавьте FUnGI (по крайней мере 50 йл, RT) с помощью наконечника 200 йл с отрезанием конца и осторожно расходуйтесь, чтобы предотвратить образование пузырьков. Инкубировать на RT в течение 20 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптическая очистка FUnGI может привести к незначительной усадки тканей. Это не повлияет на общую морфологию однослойных и многослойных органоидов; однако сферические однослойные органоиды с большими люменами могут рухнуть. Протокол можно приостановить здесь, а образцы можно хранить при 4 градусах по Цельсию (не менее 1 недели) или при -20 градусов по Цельсию (не менее 6 месяцев).

6. Подготовка слайда для конфокальных изображений

1. Приготовьте шприц 10 мл с силиконовым герметиком(Таблица материалов). Прикрепите наконечник 200 МКЛ и отрежьте конец, чтобы нежный поток вязкого силикона после нажатия шприца. Используйте шприц, чтобы нарисовать прямоугольник 1 см х 2 см в середине слайда.
2. Отрежьте конец кончика 200 йл и перенесите органоиды в FUnGI на середину прямоугольника.
3. Поместите крышку сверху. Чтобы свести к минимуму захваченных пузырьков воздуха, поместите левую сторону крышки во-первых, а затем медленно опустите крышку слева направо, пока нет захваченного воздуха, а затем отпустите крышки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Спейсеры, которые являются одновременного размера органоидов могут быть использованы для предотвращения их повреждения.
4. Аккуратно нанесите давление на все края крышки, чтобы прочно прикрепить его к силиконовому герметикому. Слайд готов к визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь, и образец может храниться при 4 градусах по Цельсию (не менее 1 недели) или -20 градусов по Цельсию (не менее 6 месяцев).

7. Приобретение и обработка изображений

1. Использование конфокального лазерного сканирующего микроскопа(Таблица материалов), изображение слайда с мульти-погружения 25x или погружения в нефть 40x цель для конфокальных изображений.
   1. Используйте следующие настройки приобретения для 25x цели: рамка режима сканирования, размер кадра 1024 x 1024, размер voxel 332 нм х 332 нм х 1,2 мкм, пиксельное время жителя Lt;2, двунаправленное сканирование, усреднение числа 1, глубина бита 8. Чтобы уменьшить фотоотлив, используйте низкую мощность лазера (lt;5% в целом, lt;10% для слабого окрашивания).
   2. Используйте режим «К-стек» для определения нижних и верхних границ и определения оптимального размера шага. При изображении больших органоидных структур или нескольких органоидов вместе, используйте режим плитки с 10% перекрытия и указать область интереса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью этих параметров размер данных для типичного органоида диаметром 300 мкм составляет 1 ГБ.
2. Для наборов данных сканирования плитки, сшить файлы изображений в программном обеспечении сопровождаетсямикроскопом (Таблица материалов). В разделе обработки выберите Stitching в качестве метода, выберите New Output по параметрам и выберите файл для сшивания. Нажмите Применить, чтобы начать шить.
3. Получите 3D-представление изображения под вкладкой 3D View в программном обеспечении изображений(Таблица материалов)и впоследствии оптимизируйте яркость, контрастные и 3D-свойства рендеринга. Экспорт RGB снимки результатов, как TIFF файлов.

Визуализация органоидов в 3D позволяет очень подробно визуализировать архитектуру, клеточный состав, а также внутриклеточные процессы. Представленный метод является нетребовамым и, предположительно, может быть применен к широкому кругу органоидных систем, которые являются производными от различных органов или видов-хозяек.

Сила 3D-изображения по сравнению с 2D-изображением иллюстрируется изображениями органоидов молочной железы мыши, которые были созданы с помощью недавно опубликованныхметодов 14. Центральный слой этих органоидов состоит из колонно-образных K8/K18-положительных светящихся клеток, а внешний слой содержит удлиненные K5-постивные базальныеклетки (рисунок 2A), который резюмирует морфологию молочной железы in vivo. Эта поляризованная организация является сложной для оценки из 2D оптической секции того же органоида(рисунок 2B, средняя панель). Другим примером сложной структуры, которую невозможно интерпретировать без 3D-информации, является сеть MRP2-положительных canaliculi, которые облегчают сбор желчной жидкости органоидовпечени человека 11 (рисунок 2B). Это иллюстрирует, как наш метод позволяет визуализировать основные структурные особенности органоидов. Кроме того, полученное качество и разрешение позволяют полуавтоматической сегментации и анализа изображений. Таким образом, общее количество клеток и наличие маркеров можно количественно оценить в конкретных клеточных подтипах у целых органоидов. Мы иллюстрировать это, сегментации ядер всего органоида, содержащего 140 клеток, из которых 3 клетки отображают высокую положительность для маркера цикла клеток Ki67 (Рисунок 2C). Канал DAPI выбирается в качестве исходных каналов, а сегменты генерируются на основе порогового шага интенсивности и диаметра сферы 10 мкм. Трогательные объекты делятся по регионам, растущим из точек семян. Наконец, фильтр размера 10 воксельов применяется для удаления небольших сегментов шума индуцированных. Для каждого сегмента, представляющего ядро, средняя интенсивность канала Ki67 затем экспортируется для построения.

Недавно мы разработали оптический клиринговый агент FUnGI35, который мы теперь интегрированы в этот протокол для уточнения прозрачности органоидов. FUnGI прост в использовании, так как очистка легко достигается одним шагом инкубации после иммунофлуоресцентного окрашивания. Дополнительным преимуществом агента является его вязкость, что облегчает обработку образцов во время монтажа слайдов. Флуоресцентные образцы в FUnGI сохраняют свою флуоресценцию даже при хранимом в течение нескольких месяцев при -20 градусах Цельсия. Мы демонстрируем, что FUnGI превосходит неясные и фруктозы-глицерола в флуоресцентных качества сигнала глубоко в органоидов (Рисунок 3A,B), и что FunGI-очищены органоиды имеют общую повышенную интенсивность флуоресценции по сравнению с неясными органоидов (Рисунок 3C).

Таким образом, мы описываем нетребовательное, воспроизводимое 3D-метод изображения для получения объемных данных иммунолабелированных органоидов. Этот протокол может быть легко использован для изображения различных органоидов, включая мышиного и человеческого происхождения, из здоровых и болезней моделей. Простая подготовка образца может быть адаптирована для облегчения конфокальных, многофотонных и светлых флуоресцентных микроскопов для получения клеточного и субклеточного разрешения целых органоидов.

Рисунок 1: Схематический обзор протокола 3D-изображения с высоким разрешением. Органоиды восстанавливаются из их 3D-матрицы. Фиксация и блокирование выполняется до иммунолабеля антителами и красителями. Оптическая очистка достигается в один шаг с помощью клирингового агента FUnGI. 3D визуализация изображений может быть выполнена с помощью программного обеспечения для визуализации. (A)Схематический обзор процедуры. (B) Очищено цельно-монтировать 3D конфокальное изображение человека толстой кишки органоидного иммунолабеля для F-актина и E-кадхерин (E-cad) (25x нефтяной цели). Шкала бар 40 мкм. (C) Очищено цельно-монтировать 3D конфокальные изображения. Шкала бар 20 мкм. (D)Увеличенная оптическая секция человеческой толстой кишки органоидного иммунолабеля для F-актина, E-кадерин (E-cad) и Ki67 (25x цель масла). Шкала планки 5 мкм. Эта цифра была изменена с Dekkers et al.26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Объемная визуализация визуализирует сложную 3D архитектуру. Конфокальные изображения, представляющие наборы данных с цельной креплением (левая панель), 2D оптические секции (средняя панель) и 3D области увеличенной области (правая панель). (A) органоид, полученный из одной базальной клетки молочной железы мыши, иллюстрирующий 3D организацию удлиненных молочных базальных клеток, которые окружают светящиеся клетки или помечены для K8/18, K5 и F-actin (очистка фруктозы-глицерола; 25x масляная цель). Масштабные бары представляют собой 55 мкм (левая панель) и 40 мкм (средние и правые панели). (B)органоид печени плода человека со сложной 3D сетью MRP2-положительных canaliculi, помеченных для DAPI, MRP2 и F-actin (очистка фруктозы-глицерола; 40x масляная цель). Масштабные бары представляют собой 25 мкм (левая панель) и 8 мкм (средние и правые панели). (C) Confocal 3D цельно-монтажное изображение органоида печени плода человека помечены DAPI и Ki67 (левая панель) и сегментированные изображения на канале DAPI с помощью программного обеспечения изображений (средняя панель). Шкала бар 15 мкм. График, на графике представляющий означает интенсивность Ki67 во всех клетках (DAPI-сегментированных) всего органоида (140 клеток) (правая панель). Эта цифра была изменена с Dekkers et al.26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Оптическая очистка органоидов с помощью FUnGI. (A)Репрезентативные изображения человеческих органоидов толстой кишки, помеченных F-актином (зеленым) и DAPI (серый) и изображенных без очистки, очищенных фруктозой-глицеролом или очищенных с FUnGI (25x масляная цель). Левая панель: 3D рендеринг органоида. Правая панель: оптический сечение органоида на глубине 150 мкм. Для состояния «без очистки» яркость изображения должна была быть увеличена по сравнению с условиями «фруктоза-глицерол» и «Фунги» для визуализации органоида. Шкала планки 50 мкм. (B)Нелинейная регрессия подходит, показывающая снижение интенсивности DAPI с увеличением глубины з для различных методов оптической очистки. Значения представляют интенсивность отдельных клеток, обнаруженных сегментацией DAPI, и нормализуются до средней интенсивности DAPI первых 50 мкм органоида. Чтобы избежать недооценки зрения, вызванного более яркими клетками на более глубоких краях и начинающими структурами, были проанализированы только центральные области органоидов. (C)Три органоида на состояние аналогичного размера и глубины к крышке были изображены с использованием одинаковых параметров микроскопа. Полные наборы 3D-данных были сегментированы по сигналу DAPI для сравнения. График бара, показывающий среднюю интенсивность DAPI с различными методами очистки на полных сегментированных наборах данных. Данные изображаются как среднее ± SD. Значения являются интенсивности отдельных ячеек, обнаруженных при сегментации DAPI. - p lt; 0.0001, тест Kruskal-Wallis с двусторонним сравнением Данна после специального тестирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Авторов нечего раскрывать.