Method Article

Транскриптом-широкое профилирование белково-РНК-взаимодействий путем перекрестного связывания и иммунопреципиентации при посредничестве FLAG-Biotin Tandem Purification

DOI:

10.3791/60730

⸱

May 18th, 2020

 ,  , 
1Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, School of Medicine and School of Life Sciences, Tsinghua University, 2Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем модифицированный протокол CLIP-seq под названием FbioCLIP-seq с очисткой тандема FLAG-biotin для определения целей РНК-связывающих белков (RBPs) в клетках млекопитающих.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

РНК и РНК-связывающие белки (РБП) контролируют несколько биологических процессов. Пространственное и временное расположение РНК и РРБ лежит в основе деликатного регулирования этих процессов. Разработана стратегия под названием CLIP-seq (перекрестное связывание и иммунопреципиентация) для захвата эндогенных белково-РНК-взаимодействий с УФ-перекрестными соединениями с последующим иммунопреципитацией. Несмотря на широкое использование традиционного метода CLIP-seq в исследовании RBP, метод CLIP ограничен наличием высококачественных антител, потенциальными загрязняющими веществами из copurified RBPs, требованием манипуляции изотопами и потенциальной потерей информации во время утомительной экспериментальной процедуры. Здесь мы описываем модифицированный метод CLIP-seq под названием FbioCLIP-seq с использованием тандема FLAG-biotin. Благодаря тандемной очистке и строгим условиям мытья удаляются почти все взаимодействующие РНК-связывающие белки. Таким образом, рнк, взаимодействующие косвенно при посредничестве этих copurified RBPs, также сокращаются. Наш метод FbioCLIP-seq позволяет эффективно обнаруживать прямые РНК, связанные с белком, без процедур SDS-PAGE и мембранной передачи без изотопов и без белка.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

РНК и РНК-связывающие белки (РБП) контролируют различные клеточные процессы, включая сращивание, перевод, рибосомный биогенез, эпигенетическуюрегуляции и переход судьбы клеток 1,2,3,4,5,6. Тонкие механизмы этих процессов зависят от уникального пространственного и временного расположения РНК и РРБ. Поэтому важным шагом на пути к пониманию регулирования РНК на молекулярном уровне является выявление позиционной информации о связывающих участках РРБ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Строительство клеточной линии

  1. Клонировать ген интереса в PiggyBac вектор pPiggyBac-FLAG-био-"cDNA интереса" --(Hygromycin-устойчивый) плазмида, которая несет FLAG-биотин эпитоп13,21, чтобы выразить FLAG-биотин тег сплавленных RBP (FBRBP).
  2. Сотрансфект FBRBP, выражаюющий вектор с вектором pBase, в клеточную линию, выражают фермент BirA22.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании ген FBRBP был трансфицирован в эмбриональные стволовые клетки мыши (mESCs) с интегрированным вектором экспрессии BirA21. Кроме того, в....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схематичное представление процедуры FbioCLIP-seq показано на рисунке 1. По сравнению с FLAG-опосредовано или стрептавидин-опосредованное одноступенчатое очищение сродства, FLAG-биотин тандем очистки удалены почти все copurified белков, избегая загрязнения косвенных белков-РНК взаимодействий (Рисунок 2). Результаты представительов FbioCLIP-seq для LIN28 и WDR43 изображены на рисунке 3 и рису.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем модифицированный метод CLIP-seq под названием FbioCLIP-seq, воспользовавшись системой двойной маркировки FLAG-biotin для выполнения тандемной очистки белково-РНК-комплексов. Система двойной маркировки FLAG-biotin была показана, что была мощна в определять взаимодействия протеин-протеина ипротеина-ДНК 13,21. Здесь мы демонстрируем высокую специфичность и удобство этой системы в определении РНК, взаимодействующих с белками. Благодар.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Грантовая поддержка предоставляется Национальной программой фундаментальных исследований Китая (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), Национальным фондом естественных наук Китая (31630095) и Центром наук о жизни при Университете Цинхуа.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
UV сшивающий агентUVPHL-2000 HybrilLinker
Affinity Purification Beads
ANTI-FLAG beadsSigma-AldrichA2220
Streptavidin beadsInvitrogen112.06D
<стронг>Реагенты
10x PBSGibco70013032
3 M NaOAcAmbionAM9740
3 x FLAG пептидSigma-AldrichF4799
АТФSigma-AldrichA6559
Хлорид кальция (CaCl2)Буфер Sigma-AldrichC1016
CIPNEBM0290SCIP находится в той же упаковке.
DTTSigma-AldrichD0632
EDTASigma-AldrichE9884
EGTASigma-AldrichE3889
Набор для очистки гелемQIAGEN28704
ГликогенAmbionAM9510
Хлорид магния (MgCl2)Sigma-Aldrich449172
MNaseNEBM0247S
NP-40AmrescoM158-500ML
PMSFSigma-Aldrich10837091001
портеиназа KTAKARA9033
Коктейль ингибиторов протеазыSigma-AldrichP8340
Q5 High-Fidelity 2X Master MixNEB0492S
обратный транкриптаза ( SupperScriptIII)Инвитроген18080093
реагент для выделения РНК (Тризол)Ин15596018
гибитор ингибитора РНКазыThermoFisherEO0381
РНКазаOUTИнвитроген10777019
RQ1 DnasePromegaM6101
SDSSigma-Aldrich1614363
Хлорид натрияSigma-AldrichS9888
дезоксихолат натрияSigma-AldrichD6750
T4 PNKNEBM0201SPNK буфер находится в той же упаковке.
Т4 РНК лигаThermoFisherEL0021Т4 РНК лигаза буфер и БСА находятся в одной упаковке.
T4 RNA ligase2, усеченныйNEBM0242ST4 RNA ligase buffer и 50% PEG находятся в одной упаковке.
Трипсин-ЭДТАThermoFisher25200072
мочевинаСигма-Олдрич208884
<сильный>mESC питательная среда
DMEM (80%)Gibco11965126
2-меркаптоэтанолGibco21985023
FCS (15%)Гиклон
глутамакс (1%)Gibco35050061
ЛИФочищенный рекомбинантный белок; 10 000-кратное разведение
NEAA (1%)Gibco11140050
смесь нуклеозидов (1%)MilliporeES-008-D
пенициллин-стрептомицин (1%)Gibco15140122
Kit
DNA набор для экстракции геляQIAGEN28704

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
  2. Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

FLAG Biotin CLIP seqProtein RNA InteractionsCross Linking ImmunoprecipitationTandem PurificationRNA Binding ProteinsUV Cross LinkingStreptavidin BeadsFLAG BeadsRNA IsolationMotif Analysis

Related Articles