Мы описываем иммунофлуоресценцию и количественный метод ПЦР для локализации и количественной оценки бегомовирусов в тканях насекомых. Протокол иммунофлуоресценции может быть использован для колокализации вирусных и векторных белков. Количественный протокол ПЦР может быть распространен на количественную оценку вирусов в целых телах белокрылок и зараженных вирусом растениях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Локализация и количественная оценка бегомовирусов в тканях Whitefly с помощью иммунофлуоресценции и количественного ПЦР
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Бегомовирусы (род Begomovirus,семейство Geminiviridae) передаются белокрылками комплекса Bemisia tabaci в стойком, циркулятивном порядке. Учитывая значительный ущерб, наносимый бегомовирусами сельскохозяйственному производству во всем мире, крайне важно понять взаимодействие между бегомовирусами и их вектором белокрылки. Для этого крайне важно ею является локализация и количественная оценка вируса в векторных тканях. Здесь, используя томатный желтый лист локон вируса (TYLCV) в качестве примера, мы описываем подробный протокол для локализации begomoviruses в белокрыль midguts, первичных слюнных желез, и яичников иммунофлуоресценции. Метод основан на использовании специфических антител против белка вирусного пальто, красителя помечены вторичные антитела, и конфокальный микроскоп. Протокол также может быть использован для колокализации белок бегомовир и белокрылки. Мы далее описываем протокол для количественной оценки TYLCV в белокрылых мидгутах, первичных слюнных железах, гемолимфе и яичниках количественным ПЦР (qPCR). Используя праймеры, специально разработанные для TYLCV, протоколы количественной оценки позволяют сравнивать количество TYLCV в различных тканях белокрылки. Описанный протокол потенциально полезен для количественной оценки бегоговирусов в организме белокрылки и зараженного вирусом растения. Эти протоколы могут быть использованы для анализа путей циркуляции begomoviruses в белокрылки или в качестве дополнения к другим методам для изучения белокрыль-бегомовирусных взаимодействий.
Введение
В последние десятилетия, begomoviruses (род Begomovirus, семья Geminiviridae) нанесли серьезный ущерб производству многих овощей, клетчатки и декоративных культур во всем мире1. Begomoviruses передаются в постоянной манере белокрыли Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), который является сложным видом, содержащим более 35 загадочных видов2,3. Begomoviruses может прямо или косвенно повлиять на белокрыль физиологии и поведения, таких как плодовитость4, долговечность4, и хост предпочтения5<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Whitefly, Вирус, Растения, и приобретение вируса
- Задние белокрылки (MEAM1) на хлопке (Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) в насекомых-доказательных клетках в теплице при 26 и 1 кв с 14:10 светлым:темным циклом и 60 и 10% относительной влажностью.
- Выполните обычные ПЦР на основе белокрыльми митохондриальной цитохромной оксидазы i гена для определения чистоты популяции белокрылки.
- Соберите 20 взрослых белых мух и перенесите их индивидуально в трубку ПЦР, содержащую 30 л люсис-буфера (10 мм Трис, рН, 8,4, 50 мМ KCl, 0,45% «wt/vol» Tween-20, 0.2% «wt/vol» желатин, 0,45%
- Добавьте 5–7 керамических бусин (2 мм в диаметре) в....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В качестве примера были использованы белокрылки MEAM1 комплекса B. tabaci и TYLCV. Обзор процедур иммунофлуоресценции и вирусной количественной оценки, описанный в данной рукописи, показан на рисунке 1. На рисунке 2 показаны репрезентативные результаты обнаружения иммунофлуоресценции TYLCV и DAPI окрашивания в PSGs, midguts, и яичники, что свидетельствует о том, что TYLCV накопил больше в PSGs и midguts, и меньше в яичниках. На рису.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описываем протокол для локализации и количественной оценки бегомовируса в тканях его белокрыльного вектора иммунофлюоресценцией и qPCR. Рассечение представляет собой первый шаг к локализации и количественной оценки вируса в тканях белокрылки. Тело белокрылки около 1 мм в длину, что означает, что ткани очень малы, и трудно вскрыть их. Кроме того, между тканями существуют прочные связи. Например, яичники тесно связаны с бактериоцитами, что затрудняет их изоляцию. Здесь, учитывая характеристики и расположение разли.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана Национальной ключевой программой исследований и разработок (Грант номер: 2017YFD0200600), целевой фонд для Китая сельскохозяйственной исследовательской системы (грант номер: CARS-23-D07) и Билл и Мелинда Гейтс Фонд (Инвестиционный ID OPP11497777 ). Мы благодарим профессора Цзянь-Сян Ву за предоставление антител TYLCV CP.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 4% параформальдегид | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-диамидино-2-phé nylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Бычья сыворотка альбумин (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Система обнаружения ПЦР в реальном времени | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Конфокальная микроскопия | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat антимышиный Earthox | E032310-02 | Вторичное антитело | |
| моноклональное антитело (MAb 1C4) | Первичное антитело | ||
| фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Стереомикроскоп | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB зеленый премикс Ex Taq (Tli РНКаза H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR мастер-микс |
| Термоциклер | Thermofisher | A41182 | |
| Тканевый лизер | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI для медико-биологических наук | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI для медико-биологических наук | 9005-64-5 |
Ссылки
- Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
