Method Article

Локализация и количественная оценка бегомовирусов в тканях Whitefly с помощью иммунофлуоресценции и количественного ПЦР

DOI:

10.3791/60731

⸱

February 8th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogen and Insects, Institute of Insect Sciences, Zhejiang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем иммунофлуоресценцию и количественный метод ПЦР для локализации и количественной оценки бегомовирусов в тканях насекомых. Протокол иммунофлуоресценции может быть использован для колокализации вирусных и векторных белков. Количественный протокол ПЦР может быть распространен на количественную оценку вирусов в целых телах белокрылок и зараженных вирусом растениях.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бегомовирусы (род Begomovirus,семейство Geminiviridae) передаются белокрылками комплекса Bemisia tabaci в стойком, циркулятивном порядке. Учитывая значительный ущерб, наносимый бегомовирусами сельскохозяйственному производству во всем мире, крайне важно понять взаимодействие между бегомовирусами и их вектором белокрылки. Для этого крайне важно ею является локализация и количественная оценка вируса в векторных тканях. Здесь, используя томатный желтый лист локон вируса (TYLCV) в качестве примера, мы описываем подробный протокол для локализации begomoviruses в белокрыль midguts, первичных слюнных желез, и яичников иммунофлуоресценции. Метод основан на использовании специфических антител против белка вирусного пальто, красителя помечены вторичные антитела, и конфокальный микроскоп. Протокол также может быть использован для колокализации белок бегомовир и белокрылки. Мы далее описываем протокол для количественной оценки TYLCV в белокрылых мидгутах, первичных слюнных железах, гемолимфе и яичниках количественным ПЦР (qPCR). Используя праймеры, специально разработанные для TYLCV, протоколы количественной оценки позволяют сравнивать количество TYLCV в различных тканях белокрылки. Описанный протокол потенциально полезен для количественной оценки бегоговирусов в организме белокрылки и зараженного вирусом растения. Эти протоколы могут быть использованы для анализа путей циркуляции begomoviruses в белокрылки или в качестве дополнения к другим методам для изучения белокрыль-бегомовирусных взаимодействий.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние десятилетия, begomoviruses (род Begomovirus, семья Geminiviridae) нанесли серьезный ущерб производству многих овощей, клетчатки и декоративных культур во всем мире1. Begomoviruses передаются в постоянной манере белокрыли Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), который является сложным видом, содержащим более 35 загадочных видов2,3. Begomoviruses может прямо или косвенно повлиять на белокрыль физиологии и поведения, таких как плодовитость4, долговечность4, и хост предпочтения5<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Whitefly, Вирус, Растения, и приобретение вируса

  1. Задние белокрылки (MEAM1) на хлопке (Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) в насекомых-доказательных клетках в теплице при 26 и 1 кв с 14:10 светлым:темным циклом и 60 и 10% относительной влажностью.
  2. Выполните обычные ПЦР на основе белокрыльми митохондриальной цитохромной оксидазы i гена для определения чистоты популяции белокрылки.
    1. Соберите 20 взрослых белых мух и перенесите их индивидуально в трубку ПЦР, содержащую 30 л люсис-буфера (10 мм Трис, рН, 8,4, 50 мМ KCl, 0,45% «wt/vol» Tween-20, 0.2% «wt/vol» желатин, 0,45%
    2. Добавьте 5–7 керамических бусин (2 мм в диаметре) в....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В качестве примера были использованы белокрылки MEAM1 комплекса B. tabaci и TYLCV. Обзор процедур иммунофлуоресценции и вирусной количественной оценки, описанный в данной рукописи, показан на рисунке 1. На рисунке 2 показаны репрезентативные результаты обнаружения иммунофлуоресценции TYLCV и DAPI окрашивания в PSGs, midguts, и яичники, что свидетельствует о том, что TYLCV накопил больше в PSGs и midguts, и меньше в яичниках. На рису.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем протокол для локализации и количественной оценки бегомовируса в тканях его белокрыльного вектора иммунофлюоресценцией и qPCR. Рассечение представляет собой первый шаг к локализации и количественной оценки вируса в тканях белокрылки. Тело белокрылки около 1 мм в длину, что означает, что ткани очень малы, и трудно вскрыть их. Кроме того, между тканями существуют прочные связи. Например, яичники тесно связаны с бактериоцитами, что затрудняет их изоляцию. Здесь, учитывая характеристики и расположение разли.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальной ключевой программой исследований и разработок (Грант номер: 2017YFD0200600), целевой фонд для Китая сельскохозяйственной исследовательской системы (грант номер: CARS-23-D07) и Билл и Мелинда Гейтс Фонд (Инвестиционный ID OPP11497777 ). Мы благодарим профессора Цзянь-Сян Ву за предоставление антител TYLCV CP.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4% параформальдегидMultiSciencesF0001
4',6-диамидино-2-phé nylindole (DAPI)Abcamab104139
Бычья сыворотка альбумин (BSA)MultiSciencesA3828
CFX Connect Система обнаружения ПЦР в реальном времениBio-RAD185-5201
Конфокальная микроскопияZeissLSM800
Dylight 549-goat антимышиный EarthoxE032310-02Вторичное антитело
моноклональное антитело (MAb 1C4)Первичное антитело
фосфатно-солевой буферный раствор (PBS)Sangon BiotechB548119-0500
СтереомикроскопZeissStemi 2000-C
TB зеленый премикс Ex Taq (Tli РНКаза H Plus)TaKaRaRR820AqPCR мастер-микс
ТермоциклерThermofisherA41182
Тканевый лизерShaghai jingxinTissuelyser-48
Triton-X-100BBI для медико-биологических наук9002-93-1
Tween 20BBI для медико-биологических наук9005-64-5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
  2. De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Begomovirus LocalizationWhitefly Tissue DissectionImmunofluorescence ProtocolQuantitative PCRConfocal MicroscopyTYLCV DetectionStromal Vascular FractionHemolymph CollectionPrimary Salivary GlandsVirus Quantification

Related Articles