Создание острого инфаркта понтий в Крысах электрической стимуляцией

С 1980-х годов, средняя мозговая артерия окклюзии (MCAO) модель индуцированных силиконовые нити был широко используется в фундаментальных исследований инсульта¹. Были также использованы другие методы (т.е. засеивание одной ветви MCA² и фотохимически индуцированный очаговой инфаркт). Эти модели были названы MCA основе моделей инсульта и в значительной степени способствовали исследованиям патофизиологических механизмов, лежащих в основе инсульта и потенциальных терапевтических средств. Хотя Есть ограничения этих экспериментальных моделей^3,4, эти методы были использованы многие лаборатории^5,6. Модели штрихов на основе MCA представляют собой штрих в передней циркуляции; однако, несколько рапортов исследовали модели имитируя ход в задней циркуляции^7.

Существуют значительные различия между этиологией, механизмами, клиническим проявлением, и прогнозом между передними и задними ходами циркуляции^8. Таким образом, результаты, полученные из передней циркуляции образцов инсульта не могут быть применены к задней циркуляции инсульта. Например, время реперфузии для передней циркуляции было расширено до 6 ч, с небольшой частью исследований, простирающихся до 24 ч на основе изображений выводы⁹. Тем не менее, временное окно для заднего кровообращения может быть больше, чем 24 ч, в соответствии с предыдущими докладами¹⁰ и наш собственный клинический опыт. Это удлиненное временное окно реперфузии должно быть дополнительно изучено и подтверждено в экспериментальных моделях.

Что касается задней инсульта циркуляции, понтийского инфаркта является наиболее распространенным подтипом, на долю которого приходится 7% всех случаев ишемического инсульта^11,12. Согласно рельефу инфаркта, инфарктные инфаркты делятся на изолированные и неизолированные инфаркты понтийского инфаркта^13. Изолированные инфаркты понтийского типа делятся на три типа на основе основных механизмов: крупное заболевание артерий (LAD), заболевания ветротехнотных артерий (BABD) и мелкой болезни артерий (САД). Знание механизмов, проявления и прогноза инфаркта понтийского инфаркта было получено из клинических исследований¹⁴случаев. Тем не менее, модель грызунов, имитирующих инфаркт понтийского образца, была менее исследована.

В предыдущих исследованиях, диффузный мозг tegmentum травмы с участием пон была изучена⁷. Одна группа попыталась создать модель инфаркта понтийки через перевязку базилярной артерии (BA)^15. Другая группа использовала 10-0 нейлона монофильтра шов выборочно ligate четыре точки проксимальной BA выборочно¹⁶. Эта модель имитирует LAD, но большинство инфарктов понтийов являются результатом BABD и SAD. Кроме того, селективная перевязка БА является сложной операцией и имеет высокий уровень смертности.

Здесь представлен подробный протокол для легкой в исполнении, легко воспроизводится и успешная крысиная модель острого инфаркта понтий с помощью электрической стимуляции.

Протокол был рассмотрен и одобрен Комитетом по уходу за животными и использованием Института Второй аффилированной больницы Гуанчжоу, учреждения, аккредитованного AAALACi. Крысы были предоставлены Центром животных южного медицинского университета.

1. Животное

1. Используйте взрослых самцов крыс Sprague-Dawley весом 250 и 10 г.
2. При транспортировке, дом крыс, по крайней мере 1 неделю до операции в контролируемых условиях окружающей среды с температурой окружающей среды 25 градусов по Цельсию, относительная влажность 65%, и 12 ч / 12 ч света / темный цикл.
3. Обеспечить питание и воду объявление libitum.

2. Создание инфаркта в понс

1. Взвешивать крыс до операции и оценить неврологические показатели в соответствии с поведенческими тестами, описанными ниже (раздел 3).
2. Разогреть грелку непосредственно перед анестезией.
3. Прикрепите сверло черепа к держателю на стереотакксивной раме.
4. Интраперитонально вводят крыс 50 мг/кг кетамина и 5 мг/кг ксилазина. Проверьте отсутствие реакции на щипать.
5. Установите крысу на стереотаксическую рамку в склонном положении. Расположите ушные решетки над ушным каналом, чтобы обезопасить голову. Убедитесь, что череп хранится горизонтально, чтобы избежать каких-либо перекос инъекций.
6. Поддерживайте анестезию изофлураном (100% кислорода, 2,5% изофлуран) с помощью стереотаксического крепления носового конуса для крыс с входными и выходными портами. Поддерживайте температуру на уровне 37 градусов по Цельсию с помощью грелемка и следите за температурой на протяжении всей процедуры.
7. Используйте глазную мазь, чтобы предотвратить высыхание роговицы. Используйте щипцы, чтобы слегка ущипнуть лапы, чтобы убедиться, что нет боли ответ.
8. Побрить волосы черепа микро-бритвой. Применить хлоргексидин хирургический скраб в круговой моды, начиная с хирургического места разреза и вращающихся наружу.
9. Сделайте 3 см разреза средней линии скальпелем от линии двустороннего бокового canthus до 0,5 см позади задней фонтанеллы, которая должна быть отмечена хирургическим маркером пера.
10. Используйте ватный тампон, чтобы удалить кровь.
11. Поместите кусок хирургической ленты, размещенной на каждой стороне лоскута кожи, чтобы разоблачить кожу головы(Рисунок 1).
12. Аккуратно удалите соединительной ткани из кости черепа с помощью ватного тампона, окутого в 0,9% NaCl. Если не удалить, соединительной ткани будут попасть в дрель.
13. Определите брегму. Выбирай центральную точку брегмы в качестве отправной точки и отмечай ее с помощью тонкой наконечника черного хирургического маркера пера.
14. Поместите дрель на 6,0 мм AP, 2,0 мм ML (диапазон от 0,5-3,0 мм, рисунок 2A).
15. Выполняйте краниотомию (диаметр 1 мм) с помощью автоматического сверла. Продолжить осторожно, потому что эта точка близка к венозной пазухи.
16. Удалите дрель из стереотакксиной рамы.
17. Поместите 22-g зонд с изолированной оболочкой в стереотаксисной раме(рисунок 3A). Кончик зонда должен быть помещен на 2 мм над проксимальным концом окоты(рисунок 3A,B; Рисунок 2B).
18. Убедитесь, что цель входит в мозг 7 мм (7 мм DV, рисунок 2B; Рисунок 1С).
19. Заранее зонд вдоль шей(Рисунок 1D) до кончика зонда 9 мм ниже поверхности мозга (Рисунок 2D).
20. Подключите электроды к электрическому стимулятору(рисунок 3C). Подключите анод к зонду, как показано на рисунке 1D. Соедините катод с крысами (обычно к уху крыс).
21. Включите электрический стимулятор и настроите следующие параметры: одна ширина импульса - 4050 мс; напряжение 50 В; и ток 4 мА(рисунок 3C). Во время электрической стимуляции, крыса будет проявлять дрожь. В этом изучении, прибор не был включен для крыс группы управления используемого для поведенческих испытаний, MRI, и TTC.
22. Оставьте зонд в положении в течение 5 минут после стимуляции.
23. Удалите зонд из мозга(Рисунок 1F).
24. Используйте костный цемент для покрытия краниотомии. Дайте цементу высохнуть перед засеиванием раны.
25. Шов раны с 4-0 полиамидных шовов нити. После трех или четырех stiches, галстук 2-1-1 стандартных хирургических узлов.
26. Вводят крыс с пенициллином (0,25 мл, 80 МЕ, разбавленной в 4 мл солевого раствора) внутриперитонально, чтобы предотвратить инфекцию.
27. Вводят крыс подкожно с мелоксикам в дозе 2 мг/кг, а затем повторить его каждые 24 ч.
28. Мониторинг крыс каждые 15 минут, пока полностью не проснуться и вернуть их в клетку с грелкой. Обеспечить свободный доступ к пище и воде до жертвоприношения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны следовать асептическим хирургическим принципам. Перед операцией наденьте скраб сверху, хирургическую маску и стерильные перчатки после хирургического скраба рук. Поддерживайте стерильный шовный материал в стерильной полю в любое время.

3. Поведенческие тесты

1. Лонга оценка¹⁷
   1. Поместите крыс на поверхность стола.
   2. Рекордные баллы: 0 - отсутствие неврологического дефицита; 1 - неспособность полностью расширить контратеральная форепа, мягкий очаговой неврологический дефицит; 2 - кружить влево, умеренный очаговой неврологический дефицит; 3 - падение влево, серьезный фокусный дефицит; 4 - отсутствие спонтанной ходьбы и подавленного уровня сознания.
2. Бердерсон набрал^{18 очков}
   1. Держите крысу за хвост и дайте передним конечностю протянуть руку за стол. Запись баллов следующим образом: 0 - обе конечности достигли таблицы; 1 - только одна конечность достигает стола.
   2. Поместите животное на неровную поверхность. Запись баллов следующим образом: 0 - сильная хватка на грубой поверхности с хорошим сопротивлением при нажатии; 1 - небольшое сопротивление, наблюдаемое только в одной лапе; 2 - нет сопротивления при нажатии в одном направлении.
   3. Поместите крысу в закрытой области (18 в No 36 дюйма) и дайте ему свободно бродить. Запись баллов следующим образом: 0 - ходить по всей длине корпуса без кружения; 1 - прогулка по всей длине корпуса с кружащим; 2 - не может ходить по длине корпуса, но может кружить; 3 - не может двигаться много. Используйте сумму оценки баллов от каждой задачи в качестве окончательного оценки.
3. Тест луча^{баланса 19}
   1. Убедитесь, что аппарат состоит из 3 см в ширину и 70 см в длину пучка и 20 см над полом. Поместите затемненную коробку в дальнем конце балки с узким входом.
   2. Поместите белый генератор шума и яркий источник света в начале луча. Шум и свет были использованы, чтобы мотивировать крысы, чтобы пройти луч и войти в поле ворот.
   3. Прекратите стимулы, когда животные входят в затемненную коробку. Запишите задержку для достижения цели поле (в секундах) и hindlimb производительность крысы при прохождении луча.
   4. Запись баллов для каждого исполнения следующим образом: 0 - балансы с устойчивой осанкой; 1 - захватывает сторону луча; 2 - обнимает луч и 1 конечность падает с балки; 3 - объятия пучка и две конечности падают из пучка, или спины на балке после 4 - попытки сбалансировать на балке, но падает после того, как 5 - попытки сбалансировать на балке, но падает после того, как и 6 - падает, не пытаясь сбалансировать или повесить на луч после йтт;20 с.
4. Клей удаления соматосенсорный тест²⁰
   1. Поместите крыс в четкую коробку плексигласа и позвольте им исследовать новую среду в течение 2 или 3 мин.
   2. Поместите 10 мм диаметром зеленый цвет клей этикетки на внутренней поверхности каждого предилимы выше большого пальца и на запястье.
   3. Верните крыс в коробку с плексигласом.
   4. Запишите время для крысы, чтобы удалить первый лейбл и все другие этикетки, соответственно. Разрешить максимум 3 мин. Тест должен проводиться 2x в обучении.
5. Тест размещения конечностей
   1. Держите крыс в горизонтальном положении и предотвратить движение.
   2. Как только крыса теряет контакт с поверхностью стола (пассивное движение конечностей), применять тактильные и проприоцептивные стимулы к лапе с кромкой стола.
   3. Оцените расположение лапы (успех или неудача) на краю стола.
   4. Запись баллов следующим образом: 0 - без размещения; 0.5 - незаконченное и/или отсроченное размещение; 1 - немедленное и полное размещение.

4. Инфарктное подтверждение МРТ

1. Выполните МРТ 24 ч после операции.
2. Анестезировать крысу изофлуран (5% для индукции, 1%-1,5% для обслуживания).
3. Безопасный крысиной головы в катушке крысы мозга массива и в сочетании с передачей только объем катушки.
4. Поместите катушки и крысы в МРТ сканер. Безопасный крысы в колыбели с помощью зуба и ушные решетки.
5. Поддерживайте температуру тела на уровне 37 градусов по Цельсию и 0,5 градусов по Цельсию во время процедуры МРТ-сканирования с помощью замкнутой тепловой куртки.
6. Используйте пилотную последовательность для обеспечения правильной геометрии.
7. Соберите T2-взвешенное сканирование с помощью последовательности быстрого спина эхо: эхо время (TE) 33 мс; время повторения (TR) - 8000 мс; поле зрения - 30 мм x 30 мм; матрица приобретения No 512 и 512; 50 ломтиков; Толщиной 0,4 мм.
8. Соберите четыре выстрела спин-эхо планар изображения DWI сканирует: эхо время 30,5 мс; время повторения - 8000 мс; матрица No 96 и 96; поле зрения - 25 мм х 25 мм; три направления х, у, z; Значения B : 0 1000 с/мм² и 1000 с/мм^2; 50 смежных осевых ломтиков; Толщиной 0,4 мм.
9. Верните крыс в клетку.

5. Infarct подтверждение Окрашивания ТТК

1. Пожертвуйте крыс в точке времени в соответствии с экспериментальной конструкцией. В этом эксперименте мы пожертвовали крысами 24 ч после операции.
2. Подготовьте 2% TTC решение до жертвы. Добавьте 0,2 г порошка TTC в 10 мл 0,01 М PBS (рН 7,4). Перенесите разбавление в блюдо 10 см, покрытое серебряной бумагой и предварительно взмахав до 37 градусов по Цельсию на водяной бане.
3. Подвергать крысу до 5% изофлуранов до потери сознания. Затем подвергать крысу CO₂ (20%-30% от объема клетки в мин) до тех пор, пока дыхание не прекратится, а затем поддерживать 2 мин воздействия CO_2.
4. Используйте следующие признаки, чтобы подтвердить смерть: не рост и падение груди, не ощутимое сердцебиение, плохой цвет слизистой оболочки, нет реакции на щепотку ног, изменение цвета или непрозрачность в глазах.
5. Выполните вывих шейки матки.
6. Защитите животных, заклеив лапы на стерильной платформе. Создайте разрез средней линии от ключицы до гипогастрия и боковой разрез от ссифоида слева вдоль грудной клетки. Сделать разрез в диафрагме также вдоль грудной клетки и грудной разрез средней линии, чтобы разоблачить сердце.
7. Подключите кончик иглы (27 G) к перфузио-насосу, содержащему 0,01 M PBS при 4 градусах в левом желудочке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Заранее кончик вдоль левого края желудочка, чтобы избежать попадания в атриум. Включите перфузионный насос, чтобы убедиться, что кончик находится в левом желудочке и вырежьте правое предсердие. Если жидкость вытекает из ноздри, кончик находится в предсердии и нуждается в корректировке или восстановлении.
8. Используйте приблизительно 100 мл 0,01 M PBS, поддерживается при 4 градусах Цельсия для перфузии. Выключите насос перфузии, пока печень не станет белой.
9. Обезглавливать крыс и вскрывать весь мозг с помощью ножниц и щипцов. Удалите любую воду с поверхности мозга с помощью промокания бумаги.
10. Храните весь мозг при температуре -80 градусов по Цельсию в течение 1 мин (резка секций мозга легче после замораживания).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть пропущен, если разделы мозга могут быть сокращены хорошо без замораживания.
11. Поместите мозг в матрицу с спинной стороной вверх.
12. Определите отверстие в поверхности мозга, как показано на рисунке 1G и вставьте лезвие толщиной 0,21 мм из нержавеющей стали. Как правило, самая большая область инфаркта находится в плоскости зонда; таким образом, в этом регионе должно быть вставлено одно лезвие.
13. Вставьте другие лезвия с интервалом в 2 мм.
14. Одновременно удалите лезвия, все сразу, из матрицы и поместите весь мозг с лезвиями в раствор ТТК в блюдо. Удалите лезвия тщательно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, разделы мозга не были легко удалены из жидкости, потому что некоторые остаточные пиа матер в основе cranii мешали секции. Если какие-либо разделы остаются в матрице, используйте небольшой шпатель, чтобы передать их в блюдо.
15. Поместите блюдо с раствором TTC и секции мозга в водяной бане при 37 градусов по Цельсию.
16. Проверьте блюдо каждые 5 минут и убедитесь, что не перекрытия разделов.
17. Добавьте 10 мл 4% параформальдегида раствором, чтобы прекратить реакцию ТТК.
18. Ориентируйте секции от рострала до хвоста и фотографируйте.

6. Статистика

1. Используйте программное обеспечение для статистического анализа (например, GraphPad Prism) для выполнения тестастудента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все данные выражаются как средние и SE. Различия между tгруппами определяются с двуххвостыми тестами студента (p q lt; 0.05 определены как статистическая значимость).

Шесть животных были подвергнуты протоколу операции, описанному выше. Контрольная группа, как показано на рисунке 4, состояла из шести крыс. Ломтики мозга, показанные на рисунке 4, были получены из одной крысы на группу.

МРТ-сканирование показало, что инфаркт находится в основе пон(рисунок 4A). Так как зонд был введен 2 мм слева от средней линии, инфаркт был расположен позже. Это инфаркт имитирует антеротеранкутарные инфаркты у пациентов(рисунок 4A). Потому что изолированная оболочка была использована, не было инфаркта за кончиком зонда, включая кору головного мозга, и среднего мозга (Рисунок 4A). DWI изображения также показали острый инфаркт понтий(Рисунок 4A).

TTC окрашивание было использовано для подтверждения инфаркта 24 ч после операции(рисунок 4A). По сравнению с контрольной группой объем инфаркта был значительно выше(рисунок 4B).

Поведенческие баллы измерялись до и после операции. Оценки для групп моделей управления и инфракта до и после операции представлены в таблице 1. Из-за отсутствия конкретного поведенческого теста, предназначенного для инфаркта понтий, оценка Лонга, оценка Бердерсона, и тест луча баланса были использованы для оценки неврологического дефицита. Кроме того, клей удаления соматосенсорный тест для оценки функции сенсомотора, а также конечности размещения тест для оценки проприоцепции.

По сравнению с контрольной группой, крысы с инфарктом понтий окружают влево(рисунок 4A). Были значительные различия в оценках Лонга (2,67 и 0,52 против. 0, р-л; 0,05, рисунок 4C), Бердерсон оценка (2,67 й 0,52 против 0, р-lt; 0,05, Рисунок 4D), конечностей размещения тест (4,67 й 0,52 против 0, р-л; 0.05, Рисунок 4E), оценка баланса луча (118.33 й 2.66 против 10.17 й 1.47, р'lt; 0.05, Рисунок 4F), и объявление Удаление somatosensory тест оценка (2,33 й 0,52 против 12,0 й 0, р-л; 0,05, Рисунок 4G) между крысами с понтийным инфарктом и контрольной группы крыс.

Рисунок 1: Учреждение инфаркта. (A) Отверстие, сделанное в черепе. (B) Ока перемещается в отверстие. (C) Инъекция окотый. (D) Инъекция зонда. (E) Анод (красная стрелка) соединен. (F) Зонд удаляется. (G) Дыра (красная стрелка), оставленная на поверхности мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы загрузить.)

Рисунок 2: Расположение зонда. (A) Схематическая схема стереотаксичных локаций: стрелки указывают на опрокидывание кожных закрылков, участок Брегмы и позиционирование дрели. (B) Схематическая диаграмма окоты и зонда. (C) Расположение кончика око, помещенного в понс. (D) Расположение кончика зонда, помещенного в понс. (E) Экспериментальный дизайн. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы загрузить.)

Рисунок 3: Устройство, производящее поражение. (A) Отдельно от шей и зонда. (B) Зонд в оби сооте нитей. (C) синий электрод был анодом, который был подключен к хвостовой зонд; красный электрод был катодом. (D) Электрический стимулятор. (E) Хирургические инструменты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы загрузить.)

Рисунок 4: Результаты представительства. (A) Инфаркт был оценен МРТ сканирование с T2 и DWI последовательности in vivo и был подтвержден TTC окрашивания в пробирке 24 ч после операции. Острый инфаркт понтий, расположенный в правом атеролатеральной понсе (пунктирная линия). Поведенческий тест показал, что крыса кружила на контралатеральной стороне поражения. (B) Объем инфаркта. (C) Длинный счет. (D)Бедерсон оценка. (E) Лимб размещения теста. (F) Баланс пучка ходьбе тест. (G) Клей удаления соматосенсорный тест. Бары представляют собой среднее значение SD(p q lt; 0.05 против контрольной группы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы загрузить.)

Рисунок S1: Лакунарный инфаркт в понах. Длина наконечника зонда сокращается. МРТ сканирование показывает лакунарный инфаркт в правом понс. (A) T2 изображение. (B)изображение DWI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы загрузить.)

Таблица 1: Поведенческие баллы.

Конфликта интересов нет.