Method Article

Характеристика одномолекулярных конформационных изменений под стрижкой потока с флуоресценционной микроскопией

DOI:

10.3791/60784

⸱

January 25th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Lehigh University, 2Department of Materials Science and Engineering, Lehigh University, 3Department of Chemistry, Lehigh University, 4Department of Mechanical Engineering and Mechanics, Lehigh University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем протокол для иммобилизации отдельных макромолекулв в микрофлюидных устройствах и количественной изменения в их конформации при потоке сдвига. Этот протокол полезен для характеристики биомеханических и функциональных свойств биомолекул, таких как белки и ДНК в среде потока.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одномолекулярное поведение при механических возмущениях характеризуется широко, чтобы понять многие биологические процессы. Однако такие методы, как атомная силовая микроскопия, имеют ограниченное временное разрешение, в то время как режит энергии Фюрстера (FRET) только позволяет делать вывод о конформах. Флуоресценция микроскопии, с другой стороны, позволяет в режиме реального времени на месте визуализации отдельных молекул в различных условиях потока. Наш протокол описывает шаги по захвату конформансальных изменений отдельных биомолекул в различных средах потока сдвига с помощью флуоресценционной микроскопии. Поток сдвига создается внутри микрофлюидных каналов и контролируется шприц насосом. В качестве демонстрации метода, фон Willebrand фактор (VWF) и лямбда ДНК помечены биотин омичи и фторфора, а затем обездвижены на поверхности канала. Их конформации постоянно контролируются при переменном потоке сдвига с использованием общего внутреннего отражения (TIRF) и конфокальной флуоресценции микроскопии. Реверсивная динамика распутывания VWF полезна для понимания того, как регулируется его функция в крови человека, в то время как конформация ДНК лямбды дает представление о биофизике макромолекул. Протокол также может быть широко применен для изучения поведения полимеров, особенно биополимеров, в различных условиях потока и для исследования реологии сложных жидкостей.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Механизмы реагирования биомолекул на экологические стимулы были изучены широко. В среде потока, в частности, сдвига и удлиненные силы регулируют конформационные изменения и, возможно, функции биомолекул. Типичные примеры включают сдвига индуцированной распутывание лямбда ДНК и фон Willebrand фактор (VWF). Ламбда ДНК была использована в качестве инструмента для понимания конформационной динамики отдельных, гибких полимерных цепей и реологии полимерных решений1,2,3,4. VWF является естественным датчиком потока, который агрегирует тромбоциты на участках раны кровеносных сосудов с ненормальными скоростью сдвига и структурой потока. Разгадка VWF имеет важное значение для активации связывания тромбоцитов с доменом A1 и связывания коллагена с доменом A3. Кроме того, высокий сдвига индуцированных A2 домена разворачивается позволяет расщепление VWF, который регулирует его молекулярное распределение веса вобращении5,6. Таким образом, прямая визуализация того, как эти молекулы ведут себя под потоком, может значительно улучшить наше фундаментальное понимание их биомеханики и функции, что, в свою очередь, может позволить новые диагностические и терапевтические применения.

Типичные методологии для характеристики одномолекулярных конформации включают оптические/магнитные пинцеты, атомную микроскопию силы (AFM) и одномолекулярную рецензируемую рецензию Фюрстера (FRET)7. Одномолекулярная силовая спектроскопия является мощным инструментом для исследования силы и движения, связанных с конформационными изменениями биомолекул. Тем не менее, ему не хватает возможности составить карту общих молекулярных конформий8. AFM способен к визуализации с высоким пространственным разрешением, но ограничен в временном разрешении9,10. Кроме того, контакт между кончиком и образцом может затруднить реакцию, вызванную потоком. Другие методы, такие как FRET и нанопорная аналитика, определяют одномолекулярные белковые складные и разворачивающиеся состояния на основе обнаружения внутримолекулярного расстояния и исключенных объемов. Тем не менее, эти методы все еще находятся в зачаточном состоянии и ограничены в их прямом наблюдении одномолекулярных конформации11,12,13,14.

С другой стороны, непосредственное наблюдение макромолекулы с высоким висальным и пространственным разрешением при флуоресценционной микроскопии улучшило наше понимание одномолекулярной динамики во многих биологических процессах15,16. Например, Fu et al. недавно впервые добились одновременной визуализации удлинения VWF и связывания рецепторов тромбоцитов. В своей работе молекулы VWF были обездвижены на поверхности микрофлюидного канала через взаимодействия биотин-стрептавидина и изображены под общей внутренней флуоресценцией (TIRF) микроскопии при различных средах потока сдвига17. Применяя аналогичный метод, как Фу, мы здесь продемонстрировать, что конформации VWF и лямбда ДНК могут быть непосредственно наблюдались как при TIRF и конфокальной флуоресценции микроскопии. Как показано на рисунке 1,микрофлюидные устройства используются для создания и контроля потока сдвига, а биомолекулы обездвижены на поверхности канала. При применении различных ставок сдвига регистрируются конформации одной и той же молекулы для измерения прорезной длины, также показанной на рисунке 1. Этот метод может быть широко применен для изучения других полимерных поведений в сложных условиях потока как для реологических, так и для биологических исследований.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка VWF

  1. Восстановите плазму человека VWF, чтобы подготовить ее к маркировке реакций. Добавьте 100 л деионизированной (DI) воды в 100 мкг лиофилизированного VWF для создания 1 мг/мл VWF сзапасваемого раствора.
  2. Dialyze VWF фондовый раствор для того, чтобы удалить избыток глицина, тем самым увеличивая эффективность маркировки биотина и фторорора.
    1. Передача 50 злифика раствора запасов VWF в диализный блок 0,1 мл с 10 000 молекулярным отсечкой веса и уплотнением крышкой. Храните оставшийся биржевый раствор при -20 градусов по Цельсию. Акции VWF будут стабильными в течение 1 года при -20 градусов по Цельсию.
    2. Запуск диализа в 500 мл 1x стерильный фосфат-буферный солей (PBS) (0,01 M дисотрия фосфат, 0,0018 монопотазий фосфат, 0,0027 М хлорид калия, 0,137 М хлорид натрия, pH 7.4 на 25 Повторите диализ в течение дополнительного часа, используя 500 мл свежего PBS.
  3. Начните реакцию маркировки биотина. Подготовьте 2 мМ раствор NHS-PEG4-biotin путем растворения твердых веществ в воде DI непосредственно перед реакцией. Разрешение NHS-PEG4-biotin оставаться в воде в течение длительного времени приведет к NHS-эфир группы гидролизоваться, тем самым уменьшая эффективность маркировки.
    1. Добавьте 2,5 л 2 мМNHS-PEG 4-биотина в диализный блок, содержащий решение для акций VWF. Это приведет к 20-кратного избытка молярного биотина по сравнению с мономерами VWF. Первичные амины VWF будут реагировать с NHS-ester групп, темсамым ковалентно связывания с PEG 4-биотин групп через amide связи.
    2. Поместите диализный блок в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл. Печать диализного блока с соответствующей крышкой. Защищайте сборку трубно-диализного с Помощью Parafilm. Держите сью и оставьте при комнатной температуре в течение 40 минут.
  4. Начало флюорофорной маркировки реакции. Подготовьте раствор 2,8 мМ Alexa 488 тетрафторофенил-эстер (TFP-ester) флуоресцентный краситель (возбуждениемакс 498 нм,максимум выбросов - 519 нм) путем растворения твердого фторофора в воде DI. Сделайте это непосредственно перед реакцией, чтобы предотвратить гидролизуем группы TFP-ester.
    1. Добавьте 2,9 л флюорофора 2,8 мМ 488 в диализный блок. Это приведет к 34-кратного избытка молярного флюорофора по сравнению с vwF мономеров. Оставшиеся первичные амины VWF будут реагировать с группами TFP-ester, тем самым ковалентно связывая с флюорофорами через аминные связи.
    2. Добавьте 2,0 л бикарбоната натрия (растворенного в воде DI) в диализный блок. Это регулирует рН реакции ближе к 8.0, что повышает эффективность TFP-эстер и первичной реакции амина.
    3. Защищайте диализный блок в микроцентрифуговой трубке так же, как и в шаге 1.3.2. Хранить в темноте, чтобы предотвратить фотоотбеление и оставить при комнатной температуре в течение 1 ч и 30 мин.
  5. Поместите диализный блок в 900 мл 1x стерильных PBS и диализировать на ночь при 4 градусах Цельсия. Это даст примерно 70 кЛ маркированных VWF при концентрации 0,71 мг/мл или 2,84 мкм (мономерная концентрация).
  6. Передача помечены VWF в микроцентрифуг трубки. Накройте трубку алюминиевой фольгой и защитите от света. Хранить при 4 градусах по Цельсию. Для длительного хранения добавьте антимикробный азид натрия до конечной концентрации 0,02% (w/v).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.

2. Подготовка ДНК Ламбда

  1. Биотинилат линейной ДНК лямбда, заполняя ее сплоченные конечные участки (кос-сайты) нуклеотидами биотина-14-dCTP в соответствии со стандартными протоколами, повторяемыми здесь в шаге 2.118. Заполните оставшуюся часть коссайтов с dATP, dTTP и dGTP нуклеотидов.
    1. Приготовьте 1 мМ растворы dATP, dTTP, dGTP и биотин-14-dCTP в 10-кратном буфере реакции (500 мМ хлорида натрия, 100 мМ Трис гидрохлорид, 100 мМ хлорид магния, 10 мМ дитиотрейтол, рН 7,9 при 25 градусах Цельсия).
    2. Поместите 48 л/с 500 нг/Л Л ДНК лямбда в трубку ПЦР и нагрейте в течение 5 мин при температуре 65 градусов по Цельсию. Участки круговой ДНК лямбды будут отделяться под теплом, линейно излучать молекулу и делая одноцепочечные свесы готовыми к биотиниляции. Сразу же после этого, место на льду, чтобы предотвратить cos сайтов от повторного annealing.
    3. Добавьте в ДНК лямбды 5 мМ dATP, dTTP и dGTP и 4 л биотин-14-dCTP. Кроме того, добавить 2,5 л 5 U / L Кленов Фрагмент (3''5' экзо-) для катализировать синтез ДНК.
    4. Инкубировать реакционную смесь в течение 1 ч при 37 градусах Цельсия.
    5. Добавьте 1,2 л 0,5 М ЭДТА. Затем нагрейте реакционную смесь в течение 5 мин при температуре 70 градусов по Цельсию. Это отключит реакцию Кленова фрагмента и биотинилации.
  2. Удалить избыток нуклеотидов из ДНК лямбды с помощью спиновой колонки, которая может вместить 10-70 Л л и имеет 6000 молекулярного веса отсечения.
    1. Поместите колонну в микроцентрифугную трубку 2 мл. Центрифуга колонны и трубки при 1000 х г в течение 2 мин. Распоряжаться потоком через который собирается в трубке.
    2. Замените буфер столбца 1x тем же буфером реакции с шага 2.1.1. Сделайте это, добавив 500 кЛ 1x буфера к столбце. Центрифуга в течение 1 мин при 1000 х г. Утилизация потока через. Повторите эти 2 раза, так что в общей сложности 1500 Л был добавлен в столбец.
    3. Поместите колонну в микроцентрифугную трубку длиной 1,5 мл. Аккуратно добавьте раствор со ступени 2.1.5 к верхнему слою столбца. Центрифуга в течение 4 мин при 1000 х г.
    4. Соберите протока (40-70 qL) из микроцентрифуговой трубки и поместите в трубку ПЦР. Это содержит очищенную, биотиниляционную ДНК лямбды.
  3. Этикетка лямбда ДНК с флуоресцентным красителем YOYO-1 (возбуждениемакс 490 нм, выбросмакс 509 нм) в соответствии со стандартными протоколами, повторяется здесь в шаге 2.3.120.
    1. Подготовьте раствор красителя YOYO-1 и ДНК лямбды с красителя к базовой паре молярного соотношения 1:10. Предположим, что НИкакая ДНК не была потеряна в шаге очистки для расчета концентрации базовой пары ДНК лямбды. Полноразмерная ДНК лямбды имеет 48 502 базовых пары.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если 50 qL раствора был восстановлен с шага 2.2.4, добавьте 7.4 qL 500 мкм YOYO-1 красителя.
    2. Нагрейте раствор в течение 2 ч при температуре 50 градусов в темноте, чтобы завершить реакцию.
    3. Накройте трубку алюминиевой фольгой и защитите от света. Хранить при 4 градусах по Цельсию. Теперь решение готово к вкачанию в микрофлюидные устройства.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.

3. Создание микрофлюидных форм канала в кремниевой пластине

  1. Используйте фотолитографию для создания микрофлюидных каналов с соответствующими размерами(рисунок 2) на мастер кремниевой пластине в соответствии со стандартными протоколами19.

4. Подготовка полидиметилсилоксана (PDMS) микрофлюидного устройства

  1. Добавьте 5 частей силиконовой эластомерной базы к 1 части лечебного средства (по массе) в весовой лодке. Тщательно перемешайте содержимое в течение 1 мин, чтобы создать предварительно вылеченный раствор PDMS.
  2. Поместите мастер кремниевой пластины в пластиковую чашку Петри. Налейте раствор PDMS над вафлей, чтобы создать слой 5 мм. Накройте блюдо и оставьте в обезвращренном вакууме в течение 1 ч, чтобы удалить пузырьки воздуха.
  3. Инкубировать покрыты Петри блюдо на 60 градусов по Цельсию на ночь, чтобы вылечить PDMS в гибкой твердой. Лечение приведет к микрофлюидных каналов формованных в PDMS на интерфейсPDMS-вафель.
  4. Вырезать 20 х 10 мм прямоугольники в PDMS, вокруг каждого микрофлюидного канала, используя бритву. Удалите прямоугольные блоки PDMS с помощью пинцета.
  5. Используйте 25 G тупой конец иглы с заточенными краями пробить отверстие 0,5 мм в диаметре на одном конце канала, убедившись, что отверстие проходит полностью через блок PDMS (Рисунок 2). Используйте тонкую иглу, чтобы выбить PDMS из отверстия. Повторите это на другом конце канала. Это создаст входе и выход для потока через канал.
  6. Очистите поверхность блока PDMS с помощью виниловой ленты. Удар сжатый азотный газ над No 1 1 1 /2, 22 х 50 мм coverslip для удаления мусора.
  7. Поместите блок PDMS с стороной канала вверх и крышкой в камеру плазменной машины связи. Начните лечение.
  8. Когда лечение завершено, быстро поместите блок PDMS на крышку так, что канал находится в контакте с скольжения. Нанесите давление по краям блока. Поместите сборку coverslip-PDMS на горячую тарелку при 115 градусах по Цельсию в течение 15 минут, чтобы укрепить постоянную связь.
  9. Вставьте 10 см длиной, 0,25 мм внутреннего диаметра трубки в отверстие розетки в верхней части блока PDMS. Это позволяет жидкости легко вытекать из канала. Устройство завершено.

5. Лечение поверхности микрофлюидного устройства

  1. Инъекционный йlt;10 qL из 10 мкг/мл биоинтинилатированный альбомин сыворотки крупного рогатого скота (BSA-biotin) растворяется в стерильных 1x PBS в впуске микрофлюидного устройства для экспериментов VWF. Вводят йт;10 л 1 мг/мл BSA-биотин для экспериментов с ДНК лямбда. Удерживайте несколько микролитров BSA-биотина в наконечнике пипетки после инъекции и позвольте кончику оставаться встроенным в входе.
    1. Всегда держите каплю воды DI вокруг кончика. Это предотвратит попадание пузырьков воздуха в канал. Применяйте эту технику каждый раз, когда в канал вводится новое решение.
    2. Разрешить BSA-биотин инкубировать в устройстве в течение 2 ч. BSA будет неспецифически связываться с поверхностью крышки(рисунок 3A).
  2. Снимите наконечник пипетки. Введите в канал блокирующий раствор казеина и дайте ему инкубировать в течение 30 мин. Казеин будет блокировать любые свободные сайты, уменьшая неспецифические привязки биомолекул на поверхность(рисунок 3B).
  3. Удалите кончик и введите злит;10 л из 10 мкг/мл стрептавидина, растворенного в стерильных 1x PBS в канал для экспериментов VWF. Используйте 100 мкг/мл стрептавидина для экспериментов с ДНК лямбда. Инкубировать в течение 10 мин. Стрептавидин будет связываться с биотинами группы BSA-биотин(рисунок 3C).
  4. Удалите наконечник и введите злитроу;10 л раствора моющего средства 1x (0,05% Tween 20 в PBS) в канал, чтобы смыть лишний стрептавидин.
  5. Удалите наконечник и введите злиц;10 л либо 28,4 нм VWF разбавленного в растворе казеина или ламбда ДНК от шага 2.3.3. Инкубировать VWF в течение 3 мин. Инкубировать лимбда ДНК в течение 45 мин (Рисунок 3D).
  6. Снимите кончик и введите злитроу;10 л из 5 мМ свободного биотина, разбавленного в растворе казеина. Бесплатный биотин будет блокировать избыточные места связывания стрептавидина на поверхности канала(рисунок 3E).

6. Визуализация ДНК VWF и Lambda под флуоресценционную микроскопию

  1. Приготовьте 1 мл блокирующего раствора казеина с 2,2 мМ протокатеховой кислотой и 37 нм протокатечуатом-3,4-диоксигеназой (для минимизации фотоотбелеки). Загрузите в шприц и закрепите в шприц-насосе. Возьмите 30 см в длину, 0,25 мм внутреннего диаметра трубки и прикрепите один конец к шприц иглы. Поток в раствор, чтобы удалить пузырьки воздуха. Прикрепите другой конец трубки к входе микрофлюидного устройства. Рекомендуется делать это через 3 минуты после шага 5.6.
  2. Выберите наивысшую цель увеличения (т.е. 60-100X) общего внутреннего отражения (TIRF) или конфокального флуоресцентного микроскопа. Добавить каплю масла погружения на его цель, если это необходимо. Поместите микрофлюидное устройство на стадии микроскопа, чтобы coverslip заподлицо с целью.
  3. Начните ярко-полевую микроскопию. Отрегулируйте фокус так, чтобы все объекты, такие как мусор и пузырьки, были видны. Затем отрегулируйте сцену в направлении X и Y до тех пор, пока не будет виден край микрофлюидного канала и не разделит раму.
  4. Переключитесь на канал 488 (FITC). Отрегулируйте угол наклона уровня и TIRF по мере необходимости до тех пор, пока не отличить отдельные зеленые, шаровые молекулы. Это либо молекулы ДНК VWF, либо лямбда.
  5. Отрегулируйте время экспозиции и интенсивность лазера, чтобы визуализировать флуоресцентные молекулы без фотоотбелевания их слишком быстро. Отрегулируйте контраст, чтобы также визуализировать молекулы более четко.
  6. Начало потока от шприца насоса так, что casein блокирующий раствор течет в канал и из розетки. Делайте это ровно через 5 минут после шага 5.6. Остановить и начать поток, чтобы наблюдать изменения в конформации молекул. При применении потока, скорость использования между 5000 и 30000 л/ ч. Повторите это в различных областях микрофлюидного устройства. Продолжить этот процесс, чтобы найти молекулы, которые могут продлить и расслабиться на нескольких циклах остановки и начала потока.
  7. Обратите внимание, сколько времени требуется для молекул, чтобы достичь максимального расширения и полностью расслабиться в глобулы. Запись видео непрерывного поведения молекул под сдвига потока, выбрав лучшее время экспозиции, частота экспозиции и продолжительность видео, которые будут захватывать весь спектр расширенного поведения и свести к минимуму photobleaching.
  8. Сохранить видео как . Файлы AVI с шкалой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.

7. Анализ изображений конформансальных изменений

  1. Рассчитайте скоростьfigure-protocol-1сдвига стены () применяется к макромолекулы с помощью скорости потока ()и высота(ч) и ширина(w) прямоугольного микрофлюидного канала. Используйте следующее уравнение, чтобы сделать это:
    figure-protocol-2
  2. Определите длину любой биомолекулы под различными темпами сдвига с помощью индивидуального кода MATLAB (см. Дополнительные файлы). Создайте папку под названием анализ видео, которая включает в себя следующие коды MATLAB: main.m, save_each_frame.m, get_length.m. и get_length.fig. Создайте subfolder в анализе видео под названием видео и добавить . Avi файлы, которые будут проанализированы в него.
  3. Откройте main.m с помощью MATLAB 2019a и запустите код. Введите имя видеофайла для анализа в окне команды под введите файл данных для анализа:.
  4. В открытом графическом пользовательском интерфейсе (GUI) установленный порог (текст в поле в правом верхнем правом окне) до 20 и нажмите на кнопку «Набор порога» для подтверждения.
  5. Используйте курсор данных в верхней панели инструментов окна, чтобы выбрать один пиксель в любом месте на панели шкалы. Нажмите кнопку «Старт» в разделе бар шкалы справа от окна. Положение выбранного пикселя (x,y) будет отображаться справа от кнопки. Нажмите на кнопку Pixel размер (мкм) кнопку. Размер пикселя должен измеряться только один раз в каждом видео.
  6. Выберите любой пиксель на молекуле интереса. Нажмите на стартовую точку в разделе VWF. После того, как положение выбранного пикселя появится на текстовом поле справа, нажмите на левый конец, правый конец и длину строки, чтобы получить молекулярную длину в изображении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть использован для анализа конформационных изменений любой биомолекулы, несмотря на код, имеющий определенный раздел под названием VWF.
  7. Дважды проверьте левый и правый конец молекулы. Увеличьте и используйте курсор данных, чтобы проверить положение пикселей, представляющий интерес. Вручную выберите пиксель в качестве конца и пересчитать длину (в пикселях) при необходимости.
  8. Запишите размер пикселя в мкм и длину строки в пикселе в листе Excel и вычислите длину строки в мкм.
  9. Повторите вышедля шаги для каждого изображения. Используйте Кнопку Last, Следующая в правом нижнем углу графического интерфейса, чтобы переключаться между изображениями в том же видеофайле. Нажмите на Близко, чтобы закрыть окно ГРАФИЧЕСКОго интерфейса.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наблюдение за динамическим поведением биомолекул, таких как VWF и лямбда ДНК в большой степени зависит от оптимизации их связывания с поверхностью устройства. Инкубирование поверхностных процедур для рекомендуемого времени в микрофлюидном устройстве имеет решающее значение для получения связывания с несколькими точками крепления, так что молекулы могут свободно расширяться и расслабляться при изменении потока. Если белки или ДНК связаны слишком сильно с несколькими связями, они будут либо распространяться на ограниченную...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для получения высококачественных данных одномолекулярных конформационных изменений с помощью флуоресценционной микроскопии, описанной в этом методе, очень важно инкубировать молекулу в течение соответствующего количества времени, минимизировать ее неспецифические взаимодействия с поверхностью и установить настройки микроскопа, которые уменьшают фотоотбеление. Способность молекулы свободно изменять конформацию связана с количеством взаимодействия биотина-стрептавидина, образовавшихся между молекулой и поверхностью. Как уп...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих интересах.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично поддержана Грантом Национального научного фонда DMS-1463234, Национальными институтами здравоохранения, грантами HL082808 и AI133634, а также внутренним финансированием Университета Лихай.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 Labeling KitInvitrogenA30006
Bio-Spin P-6 Гелевые колонкиBio-Rad7326221
БиотинSigma-AldrichB4501Использовать в качестве свободного биотина на этапе 5.6
Biotin-14-dCTPAAT Bioquest17019
BSA-BiotinSigma-AldrichA8549
CoverslipsVWR48393-195No. 1 ½, 22 x 50 мм
dNTP КомплектInvitrogen10297018
Поплавковые буи для мини-диализного аппаратаThermo Scientific69588
Klenow Fragment (3'→ 5' exo-)New England BioLabsM0212SИспользование для 10X реакционного буфера на этапе 2.1.1 и 1X реакционного буфера на этапе 2.2.2
Lambda DNANew England BioLabsN3011S
Мини-устройство для диализаThermo Scientific6957010K MWCO, объем 0,1 мл
NEBuffer 4New England BioLabsB7004S
NHS-PEG4-BiotinThermo Scientific21330
Протокатехуат 3,4-диоксигеназаSigma-AldrichP8279
Протокатехуевая кислотаSanta Cruz Biotechnologysc-205818
Набор силиконовых эластомеров для производства PDMS КомпанияDow Chemical 4019862
стрептавидинSigma-Aldrich85878
Блокирующий растворCANDOR Bioscience110 050Использование в качестве раствора для блокировки казеина по всему протоколу
Виниловая лента для чистых помещенийFisher Scientific19-120-3217
Фактор фон Виллебранда, Миллипоры плазмы человекаSigma681300
YOYO-1 КрасительAAT Bioquest17580
0,25 мм Внутренний диаметр трубкиCole-ParmerEW-06419-00
Игла 25 калибраТомас СайентификJG2505X

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
  2. Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
  3. LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow. Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).
  4. Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime. ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).
  5. Springer, T. A. Biology and physics of von Willebrand factor concatamers. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).
  6. Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
  7. Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).
  8. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  9. Siedlecki, C. A., et al. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).
  10. Roiter, Y., Minko, S. AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains. Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).
  11. Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).
  12. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  13. Howorka, S., Siwy, Z. Nanopore analytics: sensing of single molecules. Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).
  14. Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).
  15. Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
  16. Xia, T., Li, N., Fang, X. H. Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).
  17. Fu, H., et al. Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).
  18. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science. 271 (5250), 795-799 (1996).
  19. Wang, Y., et al. Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor. Biophysical Journal. 116 (11), 29092(2019).
  20. Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).
  21. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  22. Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopyShear FlowSingle MoleculeMicrofluidic ChannelsTotal Internal ReflectionConfocal MicroscopyVon Willebrand FactorLambda DNABiotin StreptavidinSyringe Pump

Related Articles