Method Article

Количественная оценка спатиотемпоральных параметров клеточного экзоцитоза в микропаттернальных клетках

DOI:

10.3791/60801

⸱

September 16th, 2020

 ,  ,  , 
1Unité Mixte de Recherche 144 CNRS, Molecular Mechanisms of Intracellular Transport group, Institut Curie, 75005 Paris, France, 2PSL Research University, Paris, France, 3Sorbonne Université, Paris, France, 4INRIA, Université Paris-Sud, PSL

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Прямая визуализация лизосомального экзоцитоза на микропаттернальных клетках позволяет пространственную количественную оценку этого процесса. Нормализация морфологии с использованием микропаттернов является выдающимся инструментом для выявления общих правил пространственного распределения клеточных процессов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Live изображения рГлуорин помечены растворимые N-этилмалеймид чувствительных факторов Присоединения белка REceptor (v-SNARE) Везикул-ассоциированный мембранный белок 7 (VAMP7) путем полного внутреннего отражения флуоресценции микроскопии (TIRFM) является простой способ изучить секрецию из лизосомального отсека. Воспользовавшись клеточной культурой на микропаттернированных поверхностях для нормализации формы клеток, для выполнения пространственного анализа секреторных моделей были использованы различные статистические инструменты. Используя функцию K Рипли и статистический тест на основе ближайшего расстояния соседа (NND), мы подтвердили, что секреция от лизосом не является случайным процессом, но показывает значительную кластеризацию. Следует отметить, что наш анализ показал, что экзоцитозные события также группируются в неклезионных областях, что указывает на то, что молекулы адгезии не единственные структуры, которые могут вызвать секреторные горячие точки на плазменной мембране. Тем не менее, мы обнаружили, что деление клеток усиливает кластеризацию. Помимо четко определенных клеевых и неклейвых областей, круговая геометрия этих микропаттернов позволяет использовать полярные координаты, упрощая анализы. Мы использовали оценку плотности ядра (KDE) и кумулятивную функцию распределения полярных координат событий экзоцитоза для выявления обогащенных областей экзоцитоза. В кольцеобразных микропаттерновых клетках кластеризация происходила на границе между клеевыми и неклейными областями. Наш анализ показывает, как статистические инструменты могут быть использованы для исследования пространственного распределения различных биологических процессов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экзоцитоз является универсальным клеточным процессом, в котором пузырьки сливаются с плазменной мембраной и высвобождает ее содержимое. Vesicle может либо предохранитель полностью с плазменной мембраны (полный синтез) или создать поры синтеза, который остается открытым в течение ограниченного времени (поцелуй изапустить) 1. Например, недавно синтезированные белки высвобождаются во внеклеточную среду из пузырьков, которые поступают из комплекса Golgi. Этот биосинтетический, антероградный путь изначальный, особенно в многоклеточных организмах, выделяет сигнальные пептиды (например, гормоны, нейротрансмиттеры) и внеклеточные матричные компоненты (например, коллаген), а также для движения трансмембранных белков в плазменную мембрану. Кроме того, выделения могут возникать из различных эндосом: 1) рециркуляции эндосом для повторного использования трансмембранных белков; 2) многозвуковые тела (MVB) для высвобождения экзосом; и 3) лизосомы для высвобождения протеолитических ферментов. Эндосомальная секреция была показана, чтобы быть важным для нейрита нарастания, псевдоподии формирования, плазменной мембраны ремонт, и АТФ-зависимыхсигнализации 2.

Для изучения экзоцитоза на уровне одной клетки, несколько методов были использованы. Патч-зажим позволяет обнаруживать одиночные события экзоцитоза с высоким временным разрешением в широком спектре живых клеток3. Однако этот метод не дает информации ни о локализации событий экзоцитоза, ни о том, из какого отсека он происходит. Электронная микроскопия позволяет напрямую визуализировать экзоцитные события с высоким пространственным разрешением, а в сочетании с иммунолабелированием предоставляет информацию о специфике задействованных отсеков и молекул. Недостатком такого подхода является отсутствие информации о динамике процесса, а также его неспособность проводить высокопутные исследования. Подходы световой микроскопии, такие как полная внутренняя флуоресцентная микроскопия отражения (TIRFM), которая использует эвакуационные поля для освещения флюорофоров в непосредственной близости от крышки (100 нм), обеспечивает хорошее временное и пространственное разрешение для изучения событий экзоцитоза. Однако этот метод совместим только с клетками-адептами и может применяться только к брюшной/нижней части клеток.

Следует отметить, что плазменная мембрана выявляет значительную неоднородность на основе клеевых комплексов, которые присутствуют только в ограниченных зонах. Эта неоднородность ограничивает, например, поглощение различных лигандов4. Кроме того, недавно было сообщено, что секреция из комплекса Golgi сосредоточена в "горячих точках" в плазменноймембране 5. Кроме того, известно, что некоторые грузы секретируются с помощью фокус-адгезии связанных экзоцитоз6. Таким образом, особое внимание следует уделить вопросу о том, случайным образом ли в пространстве распределяются события экзоцитоза, или же они сконцентрированы в определенных областях плазменной мембраны. Несколько статистических инструментов, основанных на функции K Рипли были предложены для изучения этихвопросов 7,8,9. Наш подход сочетает в себе эти инструменты с микропаттернированием для контроля формы клеток и неоднородности плазменной мембраны. Помимо предоставления средств для проведения различия между клеевыми и неклейными областями, этот метод также позволяет проводить сопоставления между различными клетками и условиями и увеличивает мощность статистического анализа.

Здесь мы используем различные статистические инструменты для изучения пространственного распределения событий экзоцитоза из лизосомального отсека, контролируемых живоклеточной визуализацией TIRFM VAMP7-pHluorin в кольцеобразных микропаттерн-нормализованных клетках hTert-RPE1. Было подтверждено, что секреция от лизосом неслучайный процесс 8,9 ичто экзоцитоз события демонстрируют кластеризации. Следует отметить, что события экзоцитоза также группируются в неклейвых областях, что указывает на то, что молекулы адгезии не единственные структуры, которые могут вызвать секреторные горячие точки на плазменной мембране. Тем не менее, деление клеток действительно усиливает кластеризацию. Последовательно наш анализ выявил обогащенные участки экзоцитоза, которые находились на границе между клеевыми и неклейными участками.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка микропаттернных клеток

  1. Трансфекция клеток
    1. За день до трансфекции семя 2,5 х 106 hTERT-RPE1 клетки в один колодец 12 пластины (2 х 2 см) в 1 мл среды.
    2. В день трансфекции подготовьте трансфекцию смесью с плазмидой VAMP7-pHluorin (100 МКЛ буфера, 0,8 мкг ДНК, 3 МКЛ трансфектной смеси). Инкубировать в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: VAMP7 является лизосомальным v-SNARE, слитый с люминесцентным тегом pHluorin. Зонд pHluorin затухается низким рН, но во время экзоцитоза протоны высвобождаются и рГлуорин начинает излучатьсигнал 10,11.
    3. Добавьте смесь трансфекции к клеткам в их среде.
    4. Изменение среднего 4 ч после добавления трансфекции смесь на клетках.
    5. Используйте клетки для экспериментов в течение следующих 24-48 ч.
  2. Подготовка микропаттерна (метод фотолитографии)
    1. Вымойте крышки (25 мм диаметра) в этаноле и дайте им высохнуть в течение 5 мин.
    2. Активировать крышки путем освещения под глубоким УФ в течение 5 мин.
    3. Создайте влажную камеру, тщательно увлажняя бумажное полотенце, на которое помещается парафиновая пленка. Добавьте капли (30 л для 22-мм крышки) раствора Poly-L-Lysine-graft-Polyethylene Glycol (PLL-g-PEG) (0,1 мг/мл, 10 мМ HEPES, pH и 7,4) и поместите крышки с активированной поверхностью на них. Закройте влажную камеру сверху и инкубировать крышки на 1 ч.
    4. Вымойте крышки 2x в PBS и 1x в дистиллированной воде и дайте им высохнуть.
    5. Вымойте кварцевую фотомаск дистиллированной водой, а затем этанолом или пропанолом. Высушите фотомаск фильтрованным потоком воздуха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кварцевая фотомаска покрыта с одной стороны антиотражающим хромом, который содержит отверстия в виде микропаттернов. В этом протоколе используется фотомаска, содержащая кольцеобразные микропаттерны в форме 37 мкм. Когда глубокий УФ светит на фотомаске, свет может пройти только через эти отверстия12.
    6. Выставить фотомаска (хромированная сторона) для глубокого УФ в течение 5 минут, чтобы очистить поверхность.
    7. Добавьте небольшие капли воды (10 МКЛ для 20-мм крышки) на хромированной стороне фотомаска. Поместите крышку с их PLL-g-PEG-обработанной стороны на падение и высушить дополнительную воду. Убедитесь, что между маской и крышками не образуются пузырьки воздуха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Капиллярная сила воды обездвижит крышки.
    8. Выставить фотомаск на глубокий УФ в течение 5 минут с не-хромированной стороной вверх (крышки прикреплены на нижней поверхности).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Свет может проходить только через отверстия и изменять PLL-g-PEG-обработанную поверхность крышки ниже фотомаска.
    9. Удалите крышки из фотомаска, добавив избыток воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Coverslips должны быстро уплыть.
    10. Инкубировать крышки в растворе внеклеточных матричных белков (50 мкг/мл фибронектина, 5 мкг/мл флуоресцентного фибриногена, разбавленного в воде) на парафиновой пленке во влажной камере (как в шаге 1.2.3) на 1 ч под капотом ламинарного потока, чтобы избежать загрязнения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент может быть приостановлен в этот момент путем хранения coverslips в PBS при 4 градусов по Цельсию.
  3. Посев клеток на микропаттернированных поверхностях
    1. Используйте магнитный держатель крышки, который соответствует размеру микропаттернированных coverslips для установки coverslips. В день приобретения нагрейте держатель крышки до 37 градусов по Цельсию, чтобы избежать теплового удара для клеток во время последующих шагов.
    2. Подготовьте модель среды, дополнив DMEM/F12 среды с 20 мМ HEPES и 2% пенициллина / стрептомицина.
    3. Место coverslips в держатель с микропаттернной стороной вверх и добавить шаблон среды, как только coverslip находится на основе держателя. Добавить уплотнение и обездвижить с магнитным устройством. Заполните держатель крышки с узором среды и закрыть его стеклянной крышкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте быстры, чтобы не позволить крышки высохнуть. Не мыть держатель крышки с этанолом между экспериментами, потому что уплотнение может сохранить некоторые этанола, который может реагировать с PLL-G-PEG и привести к клеточному стрессу. Вымойте держатель крышки только с мыльной водой. Кроме того, сустав может быть инкубирован в среде узора при 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч, чтобы разбавить остаточный продукт.
    4. Соберите трансфицированные клетки hTERT-RPE1 путем трипсинизации (0,5 мл на одну 12 пластин) и добавьте 1 мл 10% FBS DMEM/F12 среды.
    5. Добавьте 0,5 x 106 трансфицированных ячеек hTERT-RPE1 к держателю крышки и отголосок его. Инкубировать в течение 10 минут в инкубаторе.
    6. Вымойте держатель крышки 5x с узором среды для удаления непривязанных клеток и остаточного FBS, добавив шаблон среды с одной пипетки и аспирации среды с другой пипетки для создания стирального потока. Всегда держите небольшой объем среды шаблона в держателе крышки, чтобы избежать высыхания клеток на микропаттерне крышки, что приведет к гибели клеток.
    7. Инкубация в инкубаторе в течение 3 ч, чтобы обеспечить полное распространение клеток.

2. Приобретение данных об экзоцитозе

  1. Изображение событий экзоцитоза
    1. Место держатель крышки под TIRM. Сигнал должен быть обнаружен чувствительной камерой, настроенной с лучшим доступным форматом изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте, 100x объектив цели и EMCCD камеры с 512 х 512 пикселей обнаружения области был использован в результате что до размера пикселя 160 нм.
    2. Поиск ячейки, выражаюной VAMP7-pHluorin, которая полностью распространяется(рисунок 1A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, выражаюющие VAMP7, четко идентифицируются, потому что они демонстрируют зеленый сигнал.
    3. Измените угол лазера до тех пор, пока не будет достигнут угол TIRF, позволяющий визуализировать события экзоцитоза VAMP7-pHluorin. Выполните 5 минут приобретения на частоте, совместимой с скоростью экзоцитоза и шкалой времени (обычно 3 Гц, рисунок 1D) с помощью программного обеспечения микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: HTERT-RPE1 клетки имеют лизосомальную секретарную частоту около 0,3 Гц на микропаттернах. Лизосомальный экзоцитоз имеет типичную продолжительность 1 с. Он характеризуется пиковой интенсивностью с последующим экспоненциальным распадом. Диффузия зонда должна быть очевидной в это время(рисунок 1B, C).
    4. Для каждой ячейки, также выполнить приобретение микропаттерна с помощью микроскопа программного обеспечения (Рисунок 1A).
  2. Приобретение координат экзоцитоза
    1. Откройте приобретенный фильм с ImageJ/FIJI. Использовать файл (ru) Импорт и импорт Последовательность изображений. Найти экзоцитоз событий на глаз. Событие экзоцитоза характеризуется появлением яркого сигнала, который распространяется наружу(рисунок 1).
    2. Используйте точечный инструмент, чтобы отметить центр экзоцитического события. Использовать Анализ Мера для измерения координат X и Y, а также временной координаты (число срезов). Выполните эти измерения для всех событий экзоцитоза фильма.
    3. Сохранить результаты(результаты Файл (ru) Сохранить как). Подготовьте текстовый файл для каждой анализируемой ячейки под названием "Результаты (cell_name).txt", который содержит срез, координаты X и координаты Y для всех событий экзоцитоза в этом порядке.

      Текстовый файл должен выглядеть так:
      Радиус диаметра ID X Y Feret
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115

      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы заменить все запятые с точками.
    4. Измерьте центр и диаметр каждой ячейки с помощью«Овального инструмента». Подходит идеальный круг (не используйте овал) и использовать "Мера", чтобы получить X и Y координаты и диаметр Ферета. Сохраните идентификацию каждой ячейки (ID), X и Y координаты, диаметр Feret и радиус (диаметр/2) в текстовом файле под названием "Spherical parameter.txt".

      Текстовый файл должен выглядеть так:
      Радиус диаметра ID X Y Feret
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115

      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы заменить все запятые с точками.
    5. Измерьте толщину кольца микропаттерна (длина адгезии) с помощью прямого инструмента и сохраните идентификатор ячейки, радиус ячейки (из файла: "Сферический параметр.txt") и длину адгезии в текстовом файле под названием "Pattern parameter.txt". Рассчитайте нормализованную длину адгезии, разделив длину адгезии на радиус клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы заменить все запятые по очкам.

      Файл должен выглядеть так:
      ID Радиус клетки адгезии длина Нормализованная длина адгезии
      RPE1_WT_Cell1 115 34 0.295652174
      RPE1_WT_Cell2 115 35 0.304347826

3. Одноклеточный пространственный анализ

  1. R пакет и установка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пакет R для этого анализа использует пакет13 Spatstat для вычисления двумерной (2D) плотности и функции K Рипли. Код с открытым исходным кодом использует текстовые файлы, которые были описаны ранее.
    1. Скачать и установить R https://www.r-project.org/ (версия 3.5.2 была использована в этом анализе).
    2. Скачать пакет (и набор демо-данных) из: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
    3. Установите пакет на R Studio с помощью«Инструментов»спомощью « Установки пакетов». Выберите" Пакет Архив файл (.zip; .tar.gz)" для категории " Установитьиз:" и выбрать файл пакета. Пресса "Установить".
    4. Загрузите пакет функцией"Библиотека"("ExocytosisSpatialAnalysis")", написав эту команду в студии R и нажав"Enter".
    5. Запустите пакет с функцией "ESA ()", написав эту команду в студии R и нажав "Enter".
      ПРИМЕЧАНИЕ: Откроется пользовательский интерфейс.
    6. Выберите каталог для набора данных (.txt файлы) и каталог для выходных участков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры анализа (см. текст ниже) могут быть изменены с помощью пользовательского интерфейса.
    7. Этот скрипт автоматически запустит и выполнит анализ. Он предоставляет файлы .pdf соответствующих участков и файлы .txt, содержащие численные результаты.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spatiotemporal характеристики экзоцитоза события были проанализированы из лизосом визуализированы VAMP7-pHluorin10,11 в hTert-RPE1 клеток. клетки hTert-RPE1 являются нетрансформированными клетками, которые хорошо принимают микропаттернирование и широко используются в предыдущих исследованиях наоснове микропаттернов 4,14. VAMP7 является лизосомальным v-SNARE15, который был помечен с...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы отслеживали события экзоцитоза из лизосомального отсека с помощью живоклеточной визуализации TIRFM VAMP7-pHluorin в кольцеобразных микропаттерн-нормализованных клетках и проводили строгий статистический анализ пространственных параметров событий экзоцитоза. Используя преобразованную функцию K Рипли и статистический тест, основанный на расстоянии ближайшего соседа, мы подтвердили, что секреция от лизосом не является случайнымпроцессом 8,,9. Оба статистических а...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы высоко ценим Тьерри Галли (Центр психиатрии и неврологии, INSERM) за предоставление плазмид VAMP7-pHluorin. Мы благодарим Тарна Дуонга за консультации по статистическому анализу и членов лаборатории GOUD для плодотворных дискуссий. Авторы высоко признают клетки и ткани Imaging фонда (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg и PICT-IBiSA @Pasteur) и Nikon Imaging Center, Институт Кюри (Париж), член французской национальной исследовательской инфраструктуры Франции-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. была поддержана Ассоциацией за рак (ARC) и P.M. получила финансирование от научно-исследовательской и инновационной программы Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения Мари Склодовска-Кюри No 666003. Эта работа была поддержана грантами INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) и Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), а также Национального центра научных исследований и института.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Магнитная камераChamlide
Хаммид DMEM/F12Gibco21041-025
ФибриногенМолекулярные зонды, InvitrogenF35200
Фибронектин бычья плазмаSigmaF1141
HEPES (1M)Gibco15630-056
hTert RPE1 клеточная линияhttps://www.atcc.org
ImageJhttp://rsbweb.nih.gov/ij/n/aАвтор: В. Расбанд, NIH/NIMH
JetPRIME Реактив для трансфекцииPolyplus114-07
Пеницилин/стрептомицинGibco15140-122
ФотомаскаDelta Mask
PLL-g-PEG растворSurface SolutionsPLL(20)-g[3.5]-PEG(2)
R Softwarehttps://www.r-project.org/н/д
Трипсин (TrypLE Express 1X)Gibco12605-010
УФ-озоновая печьJelight Company Inc342-220
VAMP7-pHFлуорин плазмидан/д н/д н/дСсылка на бумагу :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis.
J Biol Chem. 2008 5 декабря; 283(49):34365-73. DOI: 10.1074/JBC. M804587200.
Роль HRB в клатрин-зависимом эндоцитозе.
Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
  2. Samie, M. A., Xu, H. Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders. Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).
  3. Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
  4. Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling. The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).
  5. Fourriere, L., et al. RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions. Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).
  6. Wang, Y., McNiven, M. A. Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex. Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).
  7. Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics. PLoS One. 12, 80914(2013).
  8. Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells. Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).
  9. Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).
  10. Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth. Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).
  11. Alberts, P., et al. Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane. Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).
  12. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).
  13. Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , CRC Press. Indianapolis, IN. (2015).
  14. Schauer, K., et al. Probabilistic density maps to study global endomembrane organization. Nature Methods. 7, 560-566 (2010).
  15. Advani, R. J., et al. Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments. Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).
  16. North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures. American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).
  17. Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy. eLife. 7, 32311(2018).
  18. Chen, S. X. Beta kernel estimators for density functions. Computational Statistics & Data Analysis. 31, 131-145 (1999).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Exocytosis AnalysisTIRF MicroscopyMicropatterned CellsRipley K FunctionKernel Density EstimationVAMP7 pHluorinSpatial StatisticsCell AdhesionLysosomal SecretionStatistical Analysis

Related Articles