A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Прямая визуализация лизосомального экзоцитоза на микропаттернальных клетках позволяет пространственную количественную оценку этого процесса. Нормализация морфологии с использованием микропаттернов является выдающимся инструментом для выявления общих правил пространственного распределения клеточных процессов.
Live изображения рГлуорин помечены растворимые N-этилмалеймид чувствительных факторов Присоединения белка REceptor (v-SNARE) Везикул-ассоциированный мембранный белок 7 (VAMP7) путем полного внутреннего отражения флуоресценции микроскопии (TIRFM) является простой способ изучить секрецию из лизосомального отсека. Воспользовавшись клеточной культурой на микропаттернированных поверхностях для нормализации формы клеток, для выполнения пространственного анализа секреторных моделей были использованы различные статистические инструменты. Используя функцию K Рипли и статистический тест на основе ближайшего расстояния соседа (NND), мы подтвердили, что секреция от лизосом не является случайным процессом, но показывает значительную кластеризацию. Следует отметить, что наш анализ показал, что экзоцитозные события также группируются в неклезионных областях, что указывает на то, что молекулы адгезии не единственные структуры, которые могут вызвать секреторные горячие точки на плазменной мембране. Тем не менее, мы обнаружили, что деление клеток усиливает кластеризацию. Помимо четко определенных клеевых и неклейвых областей, круговая геометрия этих микропаттернов позволяет использовать полярные координаты, упрощая анализы. Мы использовали оценку плотности ядра (KDE) и кумулятивную функцию распределения полярных координат событий экзоцитоза для выявления обогащенных областей экзоцитоза. В кольцеобразных микропаттерновых клетках кластеризация происходила на границе между клеевыми и неклейными областями. Наш анализ показывает, как статистические инструменты могут быть использованы для исследования пространственного распределения различных биологических процессов.
Экзоцитоз является универсальным клеточным процессом, в котором пузырьки сливаются с плазменной мембраной и высвобождает ее содержимое. Vesicle может либо предохранитель полностью с плазменной мембраны (полный синтез) или создать поры синтеза, который остается открытым в течение ограниченного времени (поцелуй изапустить) 1. Например, недавно синтезированные белки высвобождаются во внеклеточную среду из пузырьков, которые поступают из комплекса Golgi. Этот биосинтетический, антероградный путь изначальный, особенно в многоклеточных организмах, выделяет сигнальные пептиды (например, гормоны, нейротрансмиттеры) и внеклеточные матричные компоненты (например, коллаген), а также для движения трансмембранных белков в плазменную мембрану. Кроме того, выделения могут возникать из различных эндосом: 1) рециркуляции эндосом для повторного использования трансмембранных белков; 2) многозвуковые тела (MVB) для высвобождения экзосом; и 3) лизосомы для высвобождения протеолитических ферментов. Эндосомальная секреция была показана, чтобы быть важным для нейрита нарастания, псевдоподии формирования, плазменной мембраны ремонт, и АТФ-зависимыхсигнализации 2.
Для изучения экзоцитоза на уровне одной клетки, несколько методов были использованы. Патч-зажим позволяет обнаруживать одиночные события экзоцитоза с высоким временным разрешением в широком спектре живых клеток3. Однако этот метод не дает информации ни о локализации событий экзоцитоза, ни о том, из какого отсека он происходит. Электронная микроскопия позволяет напрямую визуализировать экзоцитные события с высоким пространственным разрешением, а в сочетании с иммунолабелированием предоставляет информацию о специфике задействованных отсеков и молекул. Недостатком такого подхода является отсутствие информации о динамике процесса, а также его неспособность проводить высокопутные исследования. Подходы световой микроскопии, такие как полная внутренняя флуоресцентная микроскопия отражения (TIRFM), которая использует эвакуационные поля для освещения флюорофоров в непосредственной близости от крышки (100 нм), обеспечивает хорошее временное и пространственное разрешение для изучения событий экзоцитоза. Однако этот метод совместим только с клетками-адептами и может применяться только к брюшной/нижней части клеток.
Следует отметить, что плазменная мембрана выявляет значительную неоднородность на основе клеевых комплексов, которые присутствуют только в ограниченных зонах. Эта неоднородность ограничивает, например, поглощение различных лигандов4. Кроме того, недавно было сообщено, что секреция из комплекса Golgi сосредоточена в "горячих точках" в плазменноймембране 5. Кроме того, известно, что некоторые грузы секретируются с помощью фокус-адгезии связанных экзоцитоз6. Таким образом, особое внимание следует уделить вопросу о том, случайным образом ли в пространстве распределяются события экзоцитоза, или же они сконцентрированы в определенных областях плазменной мембраны. Несколько статистических инструментов, основанных на функции K Рипли были предложены для изучения этихвопросов 7,8,9. Наш подход сочетает в себе эти инструменты с микропаттернированием для контроля формы клеток и неоднородности плазменной мембраны. Помимо предоставления средств для проведения различия между клеевыми и неклейными областями, этот метод также позволяет проводить сопоставления между различными клетками и условиями и увеличивает мощность статистического анализа.
Здесь мы используем различные статистические инструменты для изучения пространственного распределения событий экзоцитоза из лизосомального отсека, контролируемых живоклеточной визуализацией TIRFM VAMP7-pHluorin в кольцеобразных микропаттерн-нормализованных клетках hTert-RPE1. Было подтверждено, что секреция от лизосом неслучайный процесс 8,9 ичто экзоцитоз события демонстрируют кластеризации. Следует отметить, что события экзоцитоза также группируются в неклейвых областях, что указывает на то, что молекулы адгезии не единственные структуры, которые могут вызвать секреторные горячие точки на плазменной мембране. Тем не менее, деление клеток действительно усиливает кластеризацию. Последовательно наш анализ выявил обогащенные участки экзоцитоза, которые находились на границе между клеевыми и неклейными участками.
1. Подготовка микропаттернных клеток
2. Приобретение данных об экзоцитозе
3. Одноклеточный пространственный анализ
Spatiotemporal характеристики экзоцитоза события были проанализированы из лизосом визуализированы VAMP7-pHluorin10,11 в hTert-RPE1 клеток. клетки hTert-RPE1 являются нетрансформированными клетками, которые хорошо принимают микропаттернирование и широко используются в предыдущих исследованиях наоснове микропаттернов 4,14. VAMP7 является лизосомальным v-SNARE15, который был помечен супер эклиптический рГлуорин на его N-терминуса и находится в люмене лизосомы. Внутри клетки, зонд pHluorin был утолен низким рН лизосомы, но во время экзоцитоза рГлуорин начал излучать сигнал, потому что рН увеличилось из-за протонного выпуска. VAMP7-pHluorin контролировался живой клеточной визуализацией TIRFM на кольцеобразных микропаттернах(рисунок 1A-B). Сигнал рГлуорин продемонстрировали пик во время экзоцитоза, который представлял собой быстрое высвобождение лизосомальных протонов с последующим экспоненциальным распадом, представляющим 2D диффузию зонда на плазменной мембране (Рисунок 1C). клетки hTERT-RPE1 представляли важную лизосомальную активность секреции со средней частотой экзоцитоза 0,28 Гц(рисунок 1D). Тем не менее, высокая неоднородность наблюдалась в скорости экзоцитоза в клетках (стандартное отклонение 0,15 Гц), что свидетельствует о сильной изменчивости клеток к клетке в секреции от лизосом.
Одноклеточный пространственный анализ для исследования того, является ли экзоцитоз лизосом случайным
Можно было визуализировать 2D распределение экзоцитоза KDE, как ранее выполняется для эндомембранныхотсеков 14, которые могли бы выявить различия в местной плотности(рисунок 2B). Этот подход актуален для визуализации среднего распределения популяции клеток, но менее информативный в одиночных клетках из-за ограниченного числа обнаруженных событий (десятки против нескольких тысяч, полученных в результате анализа населения) и высокой изменчивости клеток к клеткам. Например, этот подход не позволил нам оценить, следует ли распределению событий экзоцитоза полностью пространственному поведению случайности (CSR) (т.е. соответствует равномерному распределению тока в наблюдаемом регионе для одной ячейки). Шаблон точек следует за поведением КСО, когда две следующие гипотезы верны: 1) местоположение каждой точки не зависит от местоположения других точек; и 2) вероятность найти точку в субрегионе зависит только от соотношения между площадью этого субрегиона и общей площадью. Существует три возможных отклонения от КСО: 1) кластеризация (т.е. агрегация); 2) дисперсия (т.е. заказ с постоянным расстоянием); или 3) смесь кластеризации и дисперсии(рисунок 2C). Функция K Рипли была использована, чтобы ответить на этот вопрос, как и впредыдущих анализах 7,8,9 (Рисунок 2D). Функция K Рипли близка к 2r2 (при этом d является нормализованным расстоянием от события) в случае КСО, но выше (дыхательный нижний) до 2 евро в случае кластеризации (респираторная дисперсия). Вычитая 2 евро из функции K Рипли, теоретическая кривая КСО должна быть на уровне 0. Моделирование случаев КСО проводилось с использованием того же количества точек, что и наблюдаемые события экзоцитоза, для оценки доброты, пригодной для случая КСО (серый конверт вокруг теоретической кривой). Преобразованная функция K Рипли, применяемая к экспериментальным данным, проставляла положительные значения за пределами оболочки, указывая на кластеризацию(рисунок 2D).
Чтобы исследовать, если кластеризация событий экзоцитоза было связано с адгезиейклеток, как сообщалось ранее 6, мы провели аналогичный анализ данных исключительно из неклейной области клеток в центре(рисунок 2A, клей области в серый, неклейвых клеток центр области в белом). Следует отметить, что мы обнаружили, что экзоцитоз события в неклейной области были также сосредоточены(рисунок 2E), что свидетельствует о том, что молекулы адгезии были не только структуры, которые индуцированных секреторных горячих точек на плазменных мембранах.
Поскольку функция K Рипли является описательной статистикой, которая не обеспечивает значение P, был создан статистический тест, сравнивающий события клеточного экзоцитоза с симуляциями КСО. Использовался метод ближайшего соседа NND(i). NDD определяется как минимальное эвклидианское расстояние между точкой i и всеми другими точками. Средний NND(i) из всех экзоцитных событий одной ячейки был вычислен и по сравнению с КСО, полученным с большим количеством моделирования Монте-Карло(рисунок 2F). Мы обнаружили, что средний NND одной ячейки, проанализированной на рисунке 2F, был ниже среднего смоделированного распределения случая КСО, что указывает на более близких соседей в среднем и, таким образом, кластеризации. В случае дисперсии ожидалось более высокое значение для среднего NND(рисунок 2C). Это сравнение позволило вычислить значение P для каждой ячейки. Значение P представляет собой процент моделирования, которые продемонстрировали более экстремальный NND (двусторонним способом). Если быть точным, объективное значение P было вычислено как (k-1)/(N-1) с N является общее количество моделирования Монте-Карло (10000), и к число этих симуляций, которые были более экстремальными, чем наблюдаемыеизмеримые 16. Гистограмма всех значений P была построена для общей площадиячейки (рисунок 2G) и области неклейвых клеток(рисунок 2I). Если H0: "Экзоцитоз является процессом КСО" было правдой, равномерное распределение значений P ожидалось. Если H0 был ложным, ожидался пик при низком значении P. Выполняя тест Колмогорова-Смирнова на гистограммах значения P, было получено значение P, уступаемое 0,001, что показывает значительное отклонение от КСО в обоихслучаях (рисунки 2G и 2I). Кроме того, коэффициент кластеризации 0,955 для общей площади клеток и 1,000 для области неклейвых клеток указывает на то, что лизосомальный экзоцитоз является кластерным процессом, независимым от клеточной адгезии. Коэффициент кластеризации представляет процент ячеек, которые были ближе к поведению кластеризации, чем дисперсия. Этот результат соответствовал функции Рипли K.
Чтобы оценить роль клеточной адгезии в кластеризации, мы сравнили средний NND в неклейной области с ролью в общей области для каждой отдельнойячейки (рисунок 2H). Поскольку средний NND был обратно пропорционален плотности поверхности, мы нормализовали средний NND неклейной области, используя гомотетию. Значительно больше среднего NND экзоцитоза событий в неклейной области указано меньше кластеризации(рисунок 2H). Таким образом, хотя секреция из кластеров лизосом в неклейвых областях, адгезия клеток, как представляется, усиливает кластеризацию.
Пространственный анализ событий экзоцитоза с использованием полярных координат
Круговая геометрия кольчатого микропаттерна позволила использовать общие полярные координаты, что упростило анализы, как ранее было обнаружено17. Таким образом, каждое событие экзоцитоза может быть описано модулом (расстояние от источника, здесь центр нижней плоскости клетки) и углом (в соответствии с фиксированной произвольной оси). Кроме того, модуль может быть нормализован путем деления его на радиус клетки. Гистограмма событий экзоцитоза была построена в соответствии с модулом для репрезентативной ячейки(рисунок 3A). Это выявило пик вокруг границы между клеевыми/неклейными районами. Наблюдалась также большая изменчивость между клетками. Таким образом, мы объединили n 22 клеток, чтобы получить среднее распределение событий экзоцитоза. Однако для того, чтобы придать каждому элементу одинаковый статистический вес, случайным образом было выбрано одинаковое количество событий из каждой ячейки. Этот случайный выбор не изменил общих шаблонов видел. Для получения непрерывного среднего распределения отдельных распределений одиночных ячеек использовался KDE(рисунок 3B). Однако, поскольку нормализованный модуль составляет от 0 до 1, краевые условия должны были быть приняты во внимание. Бета ядро, которое изменяет форму рядом с краями былоиспользовано 18. Ошибка полоса была вычислена с bootstrap стратегии. Наблюдаемое среднее распределение было сравнено с гипотетическим распределением КСО, которое показало больше событий на более высоком модульном уровне, потому что область увеличилась с более высоким модулусом. Поскольку интеграл плотности вероятности должен быть один, распределение КСО было 2r (с нормализованным радиусом, без единиц). Группа доверия была вычислена вокруг теоретической кривой с использованием большого количества симуляций CSR Monte Carlo (по 5000). Былипостроены 1-йи 99-й процентили распределения модула из этих симуляций. Мы обнаружили, что среднее распределение событий экзоцитоза отклоняется от гипотетического при максимуме 0,7р,maxчто соответствует началу клейкой области клетки.
Мы попытались проверить, отличается ли наблюдаемое распределение модула от теоретического. Потому что средние дистрибутивы, как и в данном случае, не могут быть точно проверены тестом на доброту (например, Колмогоров-Смирнов) был использован альтернативный метод, предложенный Pecot et al. Этот метод измеряет разницу между изменением численности населения и изменением внутри популяции, и, таким образом, позволяет независимое тестирование для каждой координаты (т.е. модуль иугол) 17. Этот тест был использован для сравнения наших данных с смоделированными данными, представляющими события экзоцитоза КСО (такое же количество клеток и событий экзоцитоза, как наблюдаемые данные), и обнаружил статистически значимую разницу в вариациях (p lt; 0.001 с тестом Уилкоксона-Манн-Уитни, n No 22 клеток), что указывает на то, что наблюдаемое среднее распределение экзоцитоза не было КСО. Однако, когда были сопоставлены два моделирования КСО (по 5000 симуляций каждый), мы обнаружили, что гистограмма значения P не показывает равномерного распределения, но продемонстрировали пик около 1, что указывает на то, что этому тесту, вероятно, не хватало чувствительности.
Поскольку оценка KDE опирается на нетривиальный выбор пропускной способности ядра и чувствительна к краевым эффектам, также была вычислена кумулятивная функция распределения, которая преодолевает проблемы, присущие оценке KDE(рисунок 3D). Эта функция определяется между 0 и 1 и не содержит каких-либо произвольных параметров или предубеждений (например, смещения края). Диапазоны ошибок и доверия вычислялись так же, как и для распространения модульов. Функция кумулятивного распределения подтвердила, что события экзоцитоза не следовали за распределением КСО, а были чрезмерно центрированы при модули около 0,7рмакс. Таким образом, этот анализ позволил нам определить клеточные участки, где происходила кластеризация. Интересный вопрос, что этот результат поднимает ли чрезмерной концентраторизации на 0,7rмакс было из-за наличия клея / неклейких областях кольцеобразной микропаттерна или эффект периферических / центральных областей секреции клеток.
Поскольку среднее распределение событий экзоцитоза отклоняется от случая КСО в неклейвых, а также клеевых областях, мы также задавались вопросом, где плотность экзоцитоза была самой высокой. Были вычислены и сопоставлены плотность поверхности экзоцитоза в областях адгезии и неадхезия. Мы обнаружили, что плотность поверхности была ниже в области адгезии, чем в области неадхезия в результате парногоанализа (рисунок 3C). Это можно объяснить сильным снижением экзоцитоза на периферии клеток (0,85 - 1rмакс, рисунок 3B).
Рисунок 1. Экзоцитоз из лизосом в клетках hTert-RPE1: (A) Кольцеобразный микропаттерн (красный) и клей hTert-RPE1 ячейки трансфицированы с VAMP7-pHluorin (зеленый) изображен TIRFM. Стрелка показывает событие экзоцитоза. Шкала баров 10 мкм.(B) Кимограф событий экзоцитоза. Стрелки показывают события экзоцитоза. Шкала бар - 2 мкм, шкала бар во времени 5 с. (C) Нормализованный профиль интенсивности лизосомального экзоцитоза из 22 клеток. Каждая точка в среднем по крайней мере 1530 случаев экзоцитоза. Представлены данные - SEM.(D)Скорость экзоцитоза 22 клеток. Среднее стандартное отклонение построено красным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Пространственный анализ лизосомальных событий экзоцитоза. (A)Разброс сюжет экзоцитоза событий в течение 5 минут приобретения. Каждая точка представляет собой одно событие экзоцитоза. Область клея показана серым цветом. (B) 2D оценка плотности ядра (KDE) рассеяния участка А. Цвет представляет местную плотность событий экзоцитоза. (C)Схематическое представление возможных точечных шаблонов. Показаны четыре случая: Полная пространственная случайность (CSR), кластеризация, дисперсия и смешанные, а также несколько ближайших расстояний соседа (NND), чтобы показать, как средний NND уменьшился в кластеризации и увеличился с дисперсией. (D)Анализ одной репрезентативной ячейки с использованием функции K Рипли. Красная пунктирной линии равна "Ripley's K функции - qr2" для событий КСО, серый конверт представляет собой оценочную доброту-в-подходит из Монте-Карло моделирования с таким же количеством точек, как экзоцитоз событий (Nсобытие No 81). Черная сплошная линия равна функции K Рипли - qr2" для наблюдаемых событий экзоцитоза (Nсобытие No 81). Его положительное отклонение от красной кривой из серого конверта указывает на кластеризацию событий экзоцитоза. Функция K Рипли была нормализована, чтобы иметь максимальное значение 1. (E) Анализ неклейной области той же ячейки с использованием функции K Рипли, как в D. Положительное отклонение от красной кривой за пределами серого конверта указывает на кластеризацию событий экзоцитоза в неклейной области. (F) Сравнение среднего распределения NND от одной репрезентативной ячейки (красная линия) с KDE КСО, полученной из моделирования Монте-Карло (голубая кривая). Значение P было рассчитано в процентах от смоделированных значений, которые были более экстремальными, чем наблюдаемое значение. (G ) P значение гистограммы, полученной из теста NND, как в F для n й 26 клеток.G Пик низких значений P означает, что нулевая гипотеза «экзоцитоз следует за КСО» была отвергнута тестом Колмогорова-Смирнова, что указывает на то, что лизосомальный экзоцитоз не был КСО. (H) Коробка-сюжет среднего NND от экзоцитоза событий в неклейвых областях (белый) и общей области клеток (серый). Две точки данных из одной ячейки соединены строкой. Средний NND был больше в неклейной области, p lt; 0.001 с парным тестом Уилкоксона (n No 25 ячеек), что указывает на значительно меньшее скопление в неклеймовой области. (I) То же самое, что и G для неклейной области для n 26 ячеек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Пространственный анализ мероприятий объединить лизосомальный экзоцитоз: (A) Гистограмма событий экзоцитоза одной репрезентативной клетки во время 5-минутного приобретения с n No 161 экзоцитозом событий в качестве функции нормализованного модула; 0 представляет центр ячейки и 1 периферию ячейки. Область клея клетки показана серым цветом и соответствует модули от 0,65-1 для показанных клеток. Существует пик в начале клей области вокруг moduli между 0,6 и 0,7. (B) KDE событий экзоцитоза как функции нормализованного модула для n 22 клеток с 56 событиями в каждой клетке; 0 представляет центр ячейки и 1 периферию ячейки. Средняя область клея показана серым цветом и соответствует в среднем модули от 0,61-1. Разбитая синяя кривая является теоретической кривой, ожидаемой в случае КСО. Эта теоретическая кривая сопровождается конвертом, который представляет собой 1-99-й процентили КСО, полученные с помощью моделирования Монте-Карло. Кривая KDE из наблюдаемых данных красным цветом и сопровождается полосой ошибок, порожденной загрузкой. Область клея находится в серых областях з/- SEM.(C)В паре анализ плотности поверхности в областях спайки и неадхезия. Плотность поверхности экзоцитоза вычислялась как количество событий на нормализованную область и в секунду. Здесь, ЗП йлт; 0,05 от парного студента t-теста (n No 22 клеток). Нормальность была ранее проверена тестом Шапиро-Вилка. (D)Совокупная функция распределения данных в B (красная линия) и из моделирования КСО Монте-Карло (пунктирная синяя линия). Конверты были созданы как в B. Обратите внимание, что красная линия отклоняется от теоретической КСО на уровне около 0,7rмакс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Авторов нечего раскрывать.
Прямая визуализация лизосомального экзоцитоза на микропаттернальных клетках позволяет пространственную количественную оценку этого процесса. Нормализация морфологии с использованием микропаттернов является выдающимся инструментом для выявления общих правил пространственного распределения клеточных процессов.
Мы высоко ценим Тьерри Галли (Центр психиатрии и неврологии, INSERM) за предоставление плазмид VAMP7-pHluorin. Мы благодарим Тарна Дуонга за консультации по статистическому анализу и членов лаборатории GOUD для плодотворных дискуссий. Авторы высоко признают клетки и ткани Imaging фонда (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg и PICT-IBiSA @Pasteur) и Nikon Imaging Center, Институт Кюри (Париж), член французской национальной исследовательской инфраструктуры Франции-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. была поддержана Ассоциацией за рак (ARC) и P.M. получила финансирование от научно-исследовательской и инновационной программы Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения Мари Склодовска-Кюри No 666003. Эта работа была поддержана грантами INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) и Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), а также Национального центра научных исследований и института.
| Магнитная камера | Chamlide | ||
| Хаммид DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Фибриноген | Молекулярные зонды, Invitrogen | F35200 | |
| Фибронектин бычья плазма | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 клеточная линия | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Автор: В. Расбанд, NIH/NIMH |
| JetPRIME Реактив для трансфекции | Polyplus | 114-07 | |
| Пеницилин/стрептомицин | Gibco | 15140-122 | |
| Фотомаска | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG раствор | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | н/д | |
| Трипсин (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| УФ-озоновая печь | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFлуорин плазмида | н/д н | /д н/д | Ссылка на бумагу :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 5 декабря; 283(49):34365-73. DOI: 10.1074/JBC. M804587200. Роль HRB в клатрин-зависимом эндоцитозе. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
