В Vitro Направленная эволюция ограничения Эндонуклеза с более строгой спецификой

Краткое содержание

Ограничение эндонуклеазы с новой специфичностью последовательности может быть разработано из ферментов, распознающих частично вырожденную последовательность. Здесь мы предоставляем подробный протокол, который мы успешно использовали, чтобы изменить специфику последовательности фермента NlaIV. Ключевыми составляющими протокола являются разобщенности транскрипции/перевода и выбор вариантов с новой последовательностью.

Аннотация

Ограничение эндонуклеазы (REase) инженерии специфичности чрезвычайно трудно. Здесь мы описываем многоступенчатый протокол, который помогает производить варианты REase, которые имеют более строгую специфичность, чем родительский фермент. Протокол требует создания библиотеки кассет выбора выражения (ESCs) для вариантов REase, в идеале с изменчивостью в позициях, которые могут повлиять на связывание ДНК. ESC окружен с одной стороны последовательностью для деятельности места ограничения пожеланной и биркой biotin и с другой стороны местом ограничения для нежелательной деятельности и грунтовое место annealing. ESCs транскрибируются и переводятся в эмульсию воды в масле, в условиях, которые делают присутствие более чем одной молекулы ДНК на каплю маловероятной. Поэтому ДНК в каждой кассетной молекуле подвергается только активности переведенного, закодированного фермента. Варианты REase желаемой специфики удаляют тег и биотин, но не сайт грунтовки. После разрушения эмульсии молекулы ДНК подвергаются спадению биотина, и сохраняются только те, что находятся в супернатанте. Этот шаг уверяет, что сохраняются только ESC для вариантов, которые не потеряли желаемую активность. Эти молекулы ДНК затем подвергаются первой реакции ПЦР. Расщепление в нежелательной последовательности отрезает сайт связывания грунтовки для одного из грунтовок. Таким образом, ПЦР усиливает только ESC из капель без нежелательной деятельности. Затем проводится вторая реакция ПЦР для повторного введения места ограничения для желаемой специфики и метки биотина, с тем чтобы можно было повторить этап отбора. Выбранные открытые рамки чтения могут быть переэкспрессированы в бактериальных клетках, которые также выражают коньяк метилтрансферазы родительской REase, потому что недавно развилась REase цели только подмножество метилтрансферазы целевых сайтов.

Введение

Инженерия специфичности последовательности является чрезвычайно сложной задачей для класса II REases. В этом классе эндонуклеазы распознавание последовательности и катализ и катализ тесно переплетены, скорее всего, как эволюционная гарантия против создания эндонуклизии более широкой специфичности, чем ее cognate метилтрансферазы, которая повредит ДНК хозяина. Направленная эволюция новых особенностей в клетках еще больше осложняется необходимостью защиты ДНК хозяина от недавно сконструированной эндонуклеазной деятельности. Таким образом, Есть только несколько успешных попыток REase инженерных сообщили, и все они используют уникальные особенности конкретного фермента^{1,,2,33,24,,55,6,7}.

Здесь мы предоставляем подробный протокол для разработки специфики, которые могут быть использованы для создания вариантов эндонуклеаза, которые имеют более узкую специфичность, чем родительский фермент, который основан на нашей успешной инженерии nlaIV эндонуклеазы⁸. Для любого такого фермента с произвольной последовательностью распознавания, дополнительная специфичность может быть введена для баз в флангах. Для родительских ферментов, распознаваемых частично вырожденных последовательностей (таких как NlaIV с целью GGNNCC), дополнительная специфичность также может быть введена в последовательности распознавания. Поскольку дополнительная специфичность, скорее всего, потребует контактов с белковыми ДНК, вновь признанные базы должны лежать в пределах родительской эндонуклеазы ДНК. В принципе, схемы отбора могут быть созданы для любой желаемой специализации последовательности распознавания. Тем не менее, большинство REases, которые признают palindromic и почти palindromic целевых последовательностей функциональных dimers, которые признают только половина участка палиндром. Таким образом, выбор новых особенностей, нарушающих симметрию белковых нуклеационных взаимодействий, вряд ли сработает. Для димерической NlaIV, например, последовательность GGNNCC теоретически может быть сужена до GGATCC, но сужение специфичности до GGAACC, как ожидается, будет более трудным. Наша схема предполагает как положительный, так и отрицательный отбор.

Этот процесс является более эффективным, когда отрицательный выбор также используется для удаления специфики, способной расщеплять все последовательности, кроме предпочтительной более узкой специфичности. Например, выбор для GGATCC может быть объединен с антивыбором против GGBVCC (где B является какой-либо базой, кроме A, и V является любой базой, кроме T). Когда некоторые из возможных целевых последовательностей не охвачены, результат ы отбора эксперимента зависит от эффективности положительного и отрицательного отбора. В нашей работе NlaIV, мы выбрали для GGATCC, и против GGSSCC (где S G или C), и получили специфичность, которая, игнорируя цели нарушения симметрии, может быть описана как GGWWCC (где W является A или T), предполагая, что в данном конкретном случае, отрицательный выбор был более важно, чем положительный отбор.

Наш подход начинается с создания кассеты выбора выражения (ESC). ESC состоит из секций. На внутренней основной части, Есть варианты открытого чтения кадра (ORF) Из REase, под t7 промоутер управления. Этот основной раздел ESC не может содержать какой-либо cognate сайт для инженерии REase. Ядро зажато между двумя когнатными участками для дикого типа REase: место расщепления для нежелательной деятельности (контрвыбранная последовательность, GGSCCв этом примере) и сайт расщепления для желаемой деятельности (выбранная последовательность, GGATCC в примере). Заключительный этап подготовки ESC в ПЦР добавляет биотин близко к желаемой активности в 5' конце и создает различные счетчиквыбранных последовательностей (GGSSCC в примере). Стратегия отбора основывается на использовании тщательно разработанных праймеров в протоколе повторного амплификации ESC после транскрипции/перевода/перевода/выбора протокола(рисунок 1A). Библиотека ESC выражается в in vitro разрозненном транскрипционном переводе воды в масле эмульсии^99,10,,11. В каждой капле, специфика выраженного фермента влияет на состояние ESC(Рисунок 1B,шаг I). Для описанного расположения, желаемая активность расщепления переведенного белка удаляет биотин тег ДНК, но не влияет на другой конец ESC с встречной выбранной последовательности. Когда эмульсия сломана, биотининатированные фрагменты удаляются стрептавидином сродством выпадения, так что только фрагменты из капель с желаемой активностью остаются(Рисунок 1B,шаг II). Этот шаг удаляет неактивные варианты REase. Супернатантная фракция выдвижной ступени затем усиливается ПЦР. В первой реакции ПЦР используются праймеры F2 и R1(рисунок 1A,B,шаг III). Primer F2 связывается с разделом ESC между выбранной последовательностью счетчика и концом молекулы. Таким образом, ESCs, выражающие варианты, способные расщеплять выбранную последовательность счетчика (и, следовательно, отделить места связывания для грунтовок F2 и R1 на две разные молекулы ДНК) не усиливаются и, таким образом, удаляются из библиотеки. Праймер R1 связывается между выбранным участком и ядром ESC, чтобы он не был подвержен статусу расщепления выбранного участка и восстанавливает место расщепления для желаемой деятельности (GGATCC). Цикл закрывается вторым ПЦР (с праймерами F1 и R2), который добавляет биотин в конце 5'близко к выбранному участку и восстанавливает разработанный вариант на выбранном участке счетчика близко к противоположному концу ESC(Рисунок 1B,шаг IV). Полученная смесь ДНК готова к очередному раунду отбора.

Успех протокола отбора сильно зависит от правильного выбора новой, более строгой последовательности распознавания целей и тщательного проектирования стратегии мутагенеза и ее эффективной реализации. Потому что это гораздо легче улучшить на незначительные уже существующие предпочтения REase, чем преодолеть их, мы рекомендуем начать с кинетического изучения любых уже существующих предпочтений. Необходимость тщательного проектирования мутагенеза обусловлена ограниченным размером библиотеки мутантов, которые могут быть обработаны представленным протоколом (10⁹ клонов в одном эксперименте). Поэтому все 20 возможных замен аминокислот могут быть эффективно протестированы лишь в нескольких позициях (см. Обсуждение). Случайный мутагенез, такой как подверженные ошибкам ПЦР (EP-PCR), представленный в качестве альтернативного метода, приведет к глубокому недовыборке существующей сложности. Если какая-либо информация о потенциальных аминокислотных позициях, участвующих в контактах с ДНК (или даже расположенных в непосредственной близости от дегенеративных нуклеотидов в cognate последовательности) имеется, она, безусловно, следует использовать для выбора нескольких аминокислот для олигонуклеотида руководствоваться насыщения мутагенеза (протокол шаги 1,6-3.10).

Протокол

1. Подготовка ЭСК

1. Клонметилтрансферазы системы ограничения модификации, которая будет разработана в плазмиде низкого числа копий (например, pACYC184 или pACYC174 или их производных).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм бактериального хозяина должен быть в состоянии переносить метилирование, введенное клонированным ферментом, и обеспечивать индуцируемое выражение полимеразы РНК T7. Рекомендуется использовать штамм ER2566 (перенос ямок McrA, McrBC и Mrr).
2. Подтвердите, что рекомбинантная плазмидная ДНК защищена от расщепления cognate эндонуклеазы путем лечения 0,5 мкг плазмидной ДНК с 10 единиц cognate REase в буфере и температуре, рекомендованной поставщиком ферментов для 2 ч.
3. Подготовьте компетентные клетки этого штамма.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Любой метод может быть использован. В инженерном проекте NlaIV использовался простой метод хлорида кальция^12.
4. Постройте рекомбинантную плазмиду с ORF для REase под контролем промоутера T7 из другой группы исключения и с другим маркером отбора, чем тот, который содержит ген метилтрасфаразы в шаге 1.1. Векторы pET28 и pET30 могут быть использованы.
5. Удалите все сайты распознавания для инженерного фермента из раздела рекомбинантной плазмиды между промоутером T7 и стоп-кодоном фермента ORF, введя тихие мутации(Рисунок 2, Таблица 1A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если необходимо удалить несколько таких сайтов, потребуется несколько раундов мутаций (шаги 1.5.1-1.5.7).
   1. Используйте наизнанку реакцию ПЦР, которая усиливает полнометражную плазмидную плазмида с разработанными вариациями, представленными на 5'концах грунтовок(Таблица 2A).
   2. Удалите ДНК шаблона, добавив 10 U эндонуклеаза DpnI к 50 qL реакции ПЦР, и инкубировать в течение 2 ч при 37 градусах Цельсия.
   3. Разрешить продукты агарозного геля электрофорусис. Вырежьте полосу, соответствующую полнометражной плазмиде, и очистите ее коммерческим комплектом.
   4. Добавьте 10-x перевязочный буфер (до концентрации 1x) и дополнить АТС (до 1 мМ). Добавьте 10 U полиннуклеотидной киназы T4 и инкубировать в течение 20 мин при 37 градусах Цельсия. Инактивируйте фермент, нагревая при 70 градусах по Цельсию в течение 10 мин.
   5. Добавить PEG 4000 до 5%, добавить снова с АТФ (до 1 мМ), и добавить 5 U T4 ДНК лигаза. Инкубировать 2 ч при комнатной температуре (RT).
   6. Превратитесь в компетентный бактериальный штамм, несущий коньяк метилтрансферазы (шаг 1.1).
   7. Изолировать плазмидную ДНК в малых масштабах и подтвердить введение последовательности изменений путем секвенирования дидеокси.
6. Ввести уникальные места ограничения близко к последовательности (ы) мишенью олигонуклеотида управляемых мутагенеза(Рисунок 2, Таблица 1B). Выполните шаги 1.5.1-1.5.7 для каждого сайта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется только при использовании целевого мутагенеза. При выполнении случайных мутагенеза, пропустить шаги 2-3 и перейти к разделу 3 вместо. В представленном примере все сайты были введены вверх по течению целевых регионов, но они могут быть введены ниже по течению, а также.
7. Дизайн праймеров для усиления ESC (таблица 1C).
   1. Дизайн обратного грунтовки связывания вниз по течению endonuclease ORF, который представит выбранный сайт распознавания (R1) и его более короткая версия (R2), которая связывает за пределами выбранной последовательности NlaIV и содержит биотин в 5'end (см. Рисунок 1).
   2. Дизайн передний грунт (F1) связывания с ESC вверх по течению от промоутера T7. Этот праймер должен также ввести счетчики выбранный вариант (ы) исходной последовательности распознавания (т.е. максимум вариаций последовательности, признанных исходным ферментом, за исключением выбранной обратной последовательности).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более короткая версия этой грунтовки (F2), которая охватывает последовательность distal к выбранной последовательности счетчика будет использоваться позже в селективном ПЦР (шаг 5.9).

2. Сплит-и-микс Синтез мутагенных праймеров

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг используется только для проектов, которые требуют снадытного мутагенеза на более чем одном участке. Требуется синтезатор с несколькими столбцов синтеза. Присваивайте столбцы для синтеза рандомизированных тройни кодона И диких тройняшек типа «Кодон» по частотам мутагенеза. Например, если имеются семь столбцов синтеза равного объема, а на данном участке желательно частота мутагенеза 0,3, добавьте рандомизированные кодоны NNS в столбцах 0,3 х 7 или 2, а дикие кодоны типа в 0,7 х 7 или пяти столбцах(рисунок 3).

1. Решите о местах для сусинамутного мутагенеза. Выбирайте частоты мутагенеза в зависимости от гипотетической важности сайтов (т.е. чем важнее сайт, тем выше частота), сохраняя в виду ограничения на общую сложность библиотеки (см. Обсуждение).
2. Синтезировать олигонуклеотиды во всех столбцах, вплоть до триплета непосредственно перед вторым местом суверенного мутагенеза, считая с 3'end. Не удаляйте 5'тритил защитные группы в последнем цикле синтеза (использовать тритил-на вариант на синтезаторе). Защитная группа будет удалена в начале следующего цикла синтеза (шаг 1 на рисунке 3).
3. Откройте столбцы синтеза. Соберите контролируемое поровое стекло (CPG) поддержку синтеза в сухую трубку 1,5 мл и перемешать путем вихря. Переразделить смешанную часть cpG-минины на новые столбцы синтеза. Избегайте введения влажности, потому что это уменьшит общую урожайность (шаги 2 и 4 на рисунке 3).
4. Продолжить синтез, начиная с субнасыщенного мутагенеза сайте триплет. Присваивайте столбцы рандомизированным тройням NNS или диким тройням типа в соответствии с желаемой частотой мутагенеза (см. примечание выше). Если присутствуют дополнительные места субнасыщения, приступайте только к триплету, предшествующей следующему месту субнасыщения мутагенеза. Опять же, оставьте 5'-тритил группы в конце (5'-тритил-на вариант на синтезаторе) (шаг 3 на рисунке 3). Затем продолжайте шаг 2.3.
5. Если нет более субнасыщенности сайтов присутствуют вниз по течению, завершить синтез, оставляя 5'тритил группы в конце (5'-тритил-на вариант на синтезаторе) (шаг 5 в Рисунок 3).
6. Дезащита и очистка библиотеки олигонуклеотидов в соответствии с инструкциями производителя картриджа очистки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Олигонуклеотиды, выделяемые дезащитой cpG, также могут быть очищены в обратной фазе высокой производительности жидкой хроматографии (HPLC) с тритил-на с последующим ручным удалением тритиловой группы (1 ч лечения с 80% уксусной кислотой на РТ) и второй очисткой HPLC.
7. Проверьте качество библиотеки олигонуклеотидов в геле мочевины.-PAGE.

3. Создание библиотек вариантов

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте рекомбинантную плазмиду со ступени 1.6.

1. Создание библиотек олигонуклеотид направленмут мутагенез.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы используйте протокол EP-PCR (шаг 3.2).
   1. Усиль раздел от промоутера T7 до уникального места фермента ограничения, обрамляющего последовательность, направленную с мутагенезом (в случае NlaIV: SalI, EcoRI, или Eco52I) (Таблица 1B-C, Таблица 2B, Рисунок 4). Увеличьте вторую часть от уникального места фермента ограничения до 3' конца ESC.
   2. Смешайте отдельно 5 зЛ реакций ПЦР (от шага 3.1.1) с 8 л воды, 1,5 л 10x ограничения ферментного буфера, и 5 единиц соответствующих ферментов ограничения (SalI, EcoRI, или Eco52I) и инкубировать при соответствующей температуре для 2 ч.
   3. Разрешить продукты обеих реакций с помощью агарозного геля электрофорусис. Вырежьте ожидаемые полосы размера и очистите с коммерческим комплектом.
   4. Запуск до 1/3 очищенных продуктов в гель агарозы и измерить концентрацию каждой очищенной полосы денситометрии.
   5. Настройка перевязки двух частей ESCs в соотношении 1:1 моляров с буфером 1x ligase и 1 U t4 ДНК лигаза и инкубировать для 2 ч на RT.
   6. Разрешить реакционные продукты в гель агарозы. Вырежьте ожидаемый размер продуктов и очистить с коммерческим комплектом.
   7. Усиль очищенные продукты перевязки в реакции ПЦР с праймерами F1 и R2(таблица 1C и таблица 2A). Не запускайте более 20 циклов усиления.
   8. Фракция ПЦР реакции в гель агарозы. Вырежьте продукты и очистите с коммерческим комплектом.
   9. Выполнить 5 qL aliquot очищенной библиотеки от предыдущего шага в геле агарозы и измерить концентрацию денситометрии.
   10. Клон небольшой образец библиотеки (до 5 qL) и последовательности клонов, чтобы проверить частоту и распределение мутаций (Таблица 3). Приступай к шагу 4.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, можно использовать высокое повышаемый посвяжение небольшой выборки ESC.
2. Выполните EP-PCR.
   1. Усиль ESC от плазмиды, полученной в шаге 1.5.7 с грунтовками F1 и R1. Выполнить 20 циклов с Taq I полимераза (Таблица 1B).
   2. Гель очищает продукт ПЦР.
   3. Настройка EP-PCR с 2 нг очищенного продукта ПЦР с предыдущего шага и запустить 15 циклов EP-PCR(Таблица 1C) с F1 и R1 праймеров.
   4. Гель очищает продукт и количественно его с помощью геля денситометрии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за низкой концентрации очищенного продукта EP-PCR используется около 1/3 для количественной оценки.
   5. Клон небольшой образец библиотеки (до 1/5) и последовательности клонов, чтобы проверить частоту мутации и распределение (Таблица 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, выполнять высокопроизводительные секвенирования небольшой выборки ESC.

4. Выполнение Сравнительных В пробирке Транскрипции перевод реакции

1. Тест эндонуклеазы выражения и ферментативной активности в экстракорпоральной транскрипции-перевода.
   1. Подготовьте короткий (200-500 bp) субстрат с одним местом распознавания для эндонуклеаза, расположенного близко к центру молекулы, чтобы можно было легко обнаружить реакцию расщепления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Самый простой способ подготовить субстрат – это усиление ПЦР соответствующего фрагмента любой молекулы ДНК. Субстрат может быть радиомаркирован или флуоресцентно помечен ы для упрощения обнаружения расщепления.
   2. Наведите 50 л реакции транскрипции-перевода с 0,5 мкг дикого типа ESC в соответствии с рекомендациями производителя. Добавьте магниевую соль (MgCl_2,MgSO_4,и ацетат магния можно проверить) до 1,5 мМ и соответствующее количество субстрата с предыдущего шага (не менее 0,5 мкг в случае немаркированной ДНК).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать любой комплект транскрипции/перевода, который не содержит нуклеаза, активированного магнием. Некоторые поставщики комплекта используют нуклеазы для удаления загрязнения ДНК во время производства, а затем добавить хелаторы в качестве ингибиторов нуклеаза. Такие наборы не совместимы с этим методом.
   3. Инкубация транскрипции-перевода реакции в соответствии с инструкциями производителя. Затем перенесите реакционную смесь на оптимальную температуру для фермента ограничения на 2 ч.
   4. Анализ расщепления субстрата в агарозном геле с последующим соответствующим обнаружением (например, окрашивание ДНК, визуализация флуоресценции или ауторадиография) (Рисунок 5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: По крайней мере частичное расщепление субстрата необходимо, прежде чем приступить к разобщенности. Если этого не достигнуто, необходима дальнейшая оптимизация химической формы магния или его концентрации.
2. Подготовьте масляно-сурфактантную смесь, добавив 225 л из Span 80 и 25 л Tween от 80 до 5 мл минерального масла в конической трубке 15 мл. Тщательно перемешайте, нежно инвертируя трубку 15x.
3. Для каждой библиотеки перевод 950 л масляно-сурфактантной смеси в 2 мл круглого нижнего криогенного флакона, этикетку с названием библиотеки и перевод на лед. Положите один небольшой цилиндрический перемешивание бар (5 х 2 мм²) в каждый флакон.
4. Подготовьте смесь реакции транскрипции-перевода in vitro (50 л для каждой библиотеки) в соответствии с предложениями производителя. Дополнить смесь хлоридом магния до конечной концентрации 1,5 мм (см. шаг 4.1.4).
5. Распределите 50 аликотов на 1,5 мл на льду.
6. Добавьте 1,7 фрома библиотеки (из раздела 3) в реакционную смесь на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте большее количество библиотеки выражения для эффективности выбора. Очень важно свести к минимуму частоту сводной капли, содержащей более одной молекулы ДНК.
7. Подготовьте эмульсию воды в масле последовательно для каждой библиотеки.
   1. Положите небольшой стакан (или большую чашку бутылки), наполненный льдом на магнитном мешалке с перемешиванием скорости, установленной на 1150 об/мин.
   2. Перенесите криогенный флакон с 950 л масляно-сурфактантной смеси и небольшой перемешиванием от шага 4.3 к ледяному стакану на магнитном мешалке. Убедитесь, что перемешивание бар вращается.
   3. Добавьте пять аликвот в библиотеке-транскрипции-переводе in vitro в течение 2 минут за 30 с интервалами и продолжайте помешивать в течение дополнительной минуты. Перенесите флакон с эмульсией в контейнер со льдом. Продолжить следующую библиотеку, начиная с шага 4.7.2.
   4. После обработки всех библиотек начать инкубацию всех библиотек в соответствии с рекомендациями производителя комплекта.
8. Перенесите флаконы к оптимальной температуре для инженерного эндонуклеаза еще на 2 ч, а затем поставьте их на лед не менее 10 мин.

5. Продолжение обработки библиотек и отбора

1. Перенесите эмульсии из криогенных флаконов в холодные трубки 1,5 мл, добавьте 1 кл/л 0,5 М ЭДТА и центрифугите их при 13 000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
2. Снимите верхнюю фазу масла пипеткой. Если масляно-водная межфаза не видна, инкубируйте трубку в течение не менее 5 мин при -20 градусах По Цельсию, чтобы заморозить водной фазе, а затем немедленно проворные из жидкого масла фазы.
3. Добавьте 100 кЛ 10 мМ Tris HCl pH 8.0 и немедленно выполнить экстракции с 150 зл фенола: хлороформ (1:1 v/v) путем короткого вихря с последующим фазовым разделением на 30 s центрифугации при 13000 х г. Соберите верхнюю ваковую фазу.
4. Осажгитднкую ДНК, добавив 0,1 vol (15 л) из 3 М ацетата натрия (рН 5,2), 2,5-5 мкг гликогена и 2,5 воль (375 л) этанола. Инкубировать при -20 градусах по Цельсию на 1 ч и центрифуге 15 мин при 13 000 х г,4 градусах По с. Откажитесь от супернатанта и кратко промыть гранулы с 1 мл холодного 70% этанола.
5. Сухие ДНК / гликогена гранулы в speedvac или воздух сухой для йgt;5 мин.
6. Растворите гранулы в 50 qL 10 mM Tris-HCl (pH 7.5). Добавьте 5 зЛ магнитных бусин стрептавидина, приготовленных в соответствии с инструкциями производителя, и смешайте по 1 ч на RT, предпочтительно в карусели-миксере или по нежному вихрю.
7. Разделите бусины на магнитной подставке и соберите жидкость, обогащенную В ДНК без биотина.
8. Сосредоточьтесь на ДНК путем осадков этанола (шаги 5.4-5.5).
9. Растворите концентрированную ДНК с предыдущего шага в 5 Л воды и используйте в качестве шаблона в реакции ПЦР с праймерами F2 и R1(таблица 1A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать проблем с загрязнением шаблона и свести к минимуму артефакты ПЦР, используйте полимеразу Taq (не Pfu или Phusion) и запускайте 18-20 циклов с увеличением времени, пропорционального размеру шаблона (1 кб и 1 мин) (см. таблицу 2B).
10. Фракция ПЦР продукт в гель агарозы и вырезать ожидаемый размер продукта. Некоторые смазки указывает на то, что Есть продукты разных размеров (см. Рисунок 6). Очистите ДНК от гелевой плиты с помощью коммерческого комплекта.
11. Запустите вторую реакцию ПЦР с до 50 нг ДНК от шага 5.10 и праймеры F1 и R2, используя тот же протокол, что и в шаге 5.9. Продолжить очистку продукта, как описано в 5.10. Очищенная ДНК после количественной оценки по денситометрии геля агарозы (не УФ-спектроскопии) может быть использована в следующем раунде выбора in vitro (шаг 4.6).

6. Варианты экрана для измененной специфичности последовательности

1. Клон выбранные варианты.
   1. Дайджест продукта от шага 5.10 на 2 ч с 10 U ограничения ферментов, подходящих для клонирования ORF в вектор выражения (для NlaIV: NcoI и XhoI) в температуре и буфере, рекомендованных поставщиком ферментов. Разрешить продукты с электрофорозом геля агарозы и изолировать ожидаемый размер фрагмента.
   2. Приготовьте плазмидный вектор (например, pET28) двойным расщеплением с теми же ферментами, что и в шаге 6.1.1 и гель очистите продукт коммерческим комплектом для очистки геля ДНК.
   3. Оцените концентрации переносчика и вставьте денситометрией с электрофорезом геля агарозы.
   4. Настройка перевязки с 1-5 U T4 ДНК лигаза и вектор: вставьте молярное соотношение 1:3-1:5 в 1x буфер лигазе рекомендуется поставщиком ферментов. Инкубировать в течение 2 ч на RT и ввести в соответствующие бактерии хозяина (от шага 1.3) путем преобразования или электропорации¹².
   5. Выберите экстрансатанты на пластинах LB, содержащих соответствующий антибиотик (50 мкг/мл канамицина для векторов pET28 или pET30) и 1% глюкозы.
2. Экспресс варианты белка.
   1. Прививать одиночные колонии от преобразования (до 24 клонов может быть легко обработаны в одном запуске) в 2 мл LB с канамицином (50 мкг/мл) и 1% глюкозы и расти в одночасье при 37 градусов по Цельсию с встряхиванием.
   2. Прививать 15 мл теплого (37 градусов по Цельсию) LB, содержащего 100 мкг канамицина и без глюкозы с 0,75 мл ночной культуры и инкубировать при 37 градусов по Цельсию с энергичной тряской.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать центрифуги 50 мл центрифуг или 100 мл фляг Erlenmayer.
   3. Добавьте 176 л глицерола к 1 мл ночной культуры (окончательная концентрация глицерола - 15%) тщательно перемешать и заморозить при -70 градусов по Цельсию.
   4. После 2-3 ч дополнить 15 мл культуры (от шага 6.2.1) с IPTG до 1 мМ и культуры для дополнительных 5 ч.
   5. Соберите бактериальные гранулы центрифугированием (10 000 х г,4 кв.к., 10 мин) и заморозьте при -70 градусов по Цельсию.
3. Очистите варианты белка.
   1. Передача 20 зл никеля сродни сродни суспензии подвески в 200 л буфера B1 в 1,5 мл трубки с широким наконечником пипетки, аккуратно перемешать, и центрифуга (5000 х г, 30 с, 4 кС). Удалите супернатант путем пипетки и оставьте трубку на льду.
   2. Отрежь бактериальные гранулы со ступени 6.2.5 в 300 Л L В1 путем энергичного вихря. Перенесите подвеску в трубку 1,5 мл.
   3. Добавьте 3 злитролога 100-x ингибитора протеазы и лизосомного раствора в В1 (окончательная концентрация 1 мг/мл). Дезинтегрировать клетки путем sonication с наконечником оборудованный зонд. Используйте шесть 10 s очередей на образец с йgt;15 s кончик времени охлаждения во льду между ними. Держите клеточные подвески на льду все время.
   4. Пеллетная клетка мусора центрифугированием (2 мин, 12 000 х г,4 кВ) и передача 250 л супернатанта в алин аликот от шага 6.3.1.
   5. Смешайте в течение 15 минут в холодной комнате, желательно в карусели смеситель или нежный вихрь.
   6. Центрифуга (5000 х г,30 с, 4 кв с) и аспирируй супернатант с пипеткой.
   7. Добавьте 500 л буфера W и аккуратно приостановите работу с мисиной. Центрифуга (5000 х г,30 с, 4 кв с) и аспирируй супернатант с пипеткой.
   8. Повторите шаг 6.3.7.
   9. Добавьте 20 qL буфера E, аккуратно отрепроруйте посев и оставьте образец на льду на 2-5 мин. Центрифуге (5000 х г,30 с, 4 кв С) и соберите супернатант.
   10. Повторите шаг 6.3.9. Бассейн супернационты.
   11. Анализ образцов белка в SDS-PAGE (5-10 Л)(Рисунок 7).
4. Экран для вариантов с измененной специфичностью.
   1. Анализ расщепления деятельности на бактериофаг ехламда ДНК. Образец протеина может составлять до 10% от конечного объема реакции. В общей сложности 2 юл протеинового образца на 0,5 мкг ДНК и 2 ч время реакции является хорошей отправной точкой.
   2. Проанализируйте реакционные продукты с помощью электрофореза агарозного геля вместе с продуктами, генерируемыми ферментом дикого типа. Выберите клоны, генерирующие модели расщепления, четко отличающиеся от фермента дикого типа для дальнейшего анализа(рисунок 8).

Результаты

Этот протокол является лишь инструментом для увеличения частоты желаемых вариантов инженерии REase путем истощения (но не устраняя) два нежелательных класса: неактивные ферменты и эндонуклеазы с неизменной дикой специфичности последовательности типа. С другой стороны, поскольку изменение специфики REase чрезвычайно трудно, найти даже один такой вариант производства расщепления шаблон, который отличается от фермента дикого типа в одном скрининге 24 клонов следует считать успешным. В наших руках лучшие экраны могли определить до 20% перспективных вариантов(рисунок 8А).

Положительный результат сильно зависит от качества библиотеки (т.е. ограниченной частоты замен и их случайного распределения) и эффективного захвата биотининолатой популяции членов библиотеки (шаги 3,6–3,7). Обе проблемы могут быть обнаружены. Качество библиотеки должно быть проверено до выбора путем секвенирования как можно больше клонов (Зgt;15) или путем прямого секвенирования библиотеки путем секвенирования высокой пропускной способности (шаг 3.10, таблица 3). Если большинство выбранных клонов не активны, это является явным признаком провала выбора захвата стрептавидина. Аналогичный эффект наблюдается в случае библиотек, которые проходят много циклов отбора, потому что такие библиотеки, скорее всего, доминируют неактивные варианты, которые избежали стрептавидина захвата выбора шаг(рисунок 8B). Поэтому рекомендуется проводить скрининг после каждого цикла отбора и далее разрабатывать выбранные вручную перспективные варианты, а не зависеть от итерации отбора.

Рисунок 1: В пробирке выбор новой специфичности последовательности на основе nlaIV инженерных. ()Организация экспрессии/выбора кассеты (ESC) включает в себя два сайта распознавания для REase, 1) выбранной последовательности (GGATCC) близко к правому концу и 2) счетчик выбранной последовательности (GGSSCC) близко к левому концу, а также T7p и T7t-T7 промоутер и T7 терминатор. Сайты связывания грунтовки показаны ниже. Расщепление диким типом и выбранными вариантами NlaIV отображаются как красные и зеленые треугольники соответственно. (B) Шаги цикла выбора: I) Эмульгация реакции транскрипции-перевода-расщепления смесями с библиотекой ESC; II) Вся биоинтинилатированная ДНК захватывается на магнитные частицы, покрытые стрептавидином, и удаляется, тем самым удаляя кодируя неактивные варианты; III) ESCs, кодируя REases с дикими типами деятельности (т.е. те, кто в состоянии расщеплять последовательность GGSSCC) устраняются, потому что расщепление последовательности отделяет связывающие сайты для передних и обратных грунтовок. Таким образом, никакого усиления этих ЭСК не происходит; IV) Вход для следующего раунда отбора создается путем добавления биотина на правом конце и повторного введения вариации счетчика выбранных последовательностей на левом конце. Перепечатано из Чапинска и др.⁸ с разрешения Эльзевье. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Подготовка ESC. Фрагмент, полученный из исходной конструкции в векторе выражения, содержащем NlaIV ORF под контролем промоутера T7, был изменен, чтобы быть пригодным для выражения/выбора. Сайт NlaIV вниз по течению от NlaIV ORF был удален, и уникальные сайты (SalI, EcoRI и Eco52I), которые использовались для мутации выбранных позиций, были введены в NLaIV ORF как молчаливые мутации. Окончательная конструкция была усилена с фланговыми грунтовками, которые ввели два фланговых участка NlaIV: выбранная последовательность счетчика (GGSSCC) слева и выбранная последовательность (GGATCC) справа. Реверс также ввел биотин. Праймеры, используемые при создании мутировавших ECS, отображаются в виде синих стрелок и помечены ниже (см. таблицу 1B,C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Схема разделения и смешивания синтеза. Пример относится к синтезу праймера MutB, где последовательность NNS была введена на частоте 0,8 в четырех позициях (см. также таблицу 3). Обратите внимание, что химический синтез осуществляется от 3'до 5', но все последовательности показаны в канонической 5'-3 'ориентации (т.е. он исходит справа налево в этой схеме). Последовательности дикого типа в мутагенизированных положениях отображаются зеленым цветом, в то время как мутагенные последовательности NNS красным цветом. Подчеркивается сайт распознавания SalI, который позже используется для внедрения мутаций в ESC. Указаны точки смешивания и разделения шагов (2 и 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Использование уникальных участков фермента ограничения в олигонуклеотид целевого мутагенеза. Стратегия введения мутации показана на примере строительства библиотек А-С (см. шаги 3.1-3.7). Перепечатано из Чапинска и др.⁸ с разрешения Эльзевье. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Эндонуклелитотический расщепление в экстракорпоральном транскрипции-переводе. (A) Расщепление испытательного субстрата в оптимальном буфере REase: 1) Субстрат, 612 bp PCR продукт с одним сайтом распознавания NlaIV; 2) Продукты расщепления, 355 bp и 257 bp. (B) Расщепление в экстракорпоральном транскрипции-перевод реакции (содержащей 0,5 мкг ESC): 1-2) 15 qL aliquots перевода экстракорпорированной транскрипции без субстрата (линия 2: реакция дополнена 1,5 мМ МГК_2); 3-4) 15 аликотов транскрипции in vitro с 1 мкг испытательного субстрата; (линия 4: реакция дополнена 1,5 мМ MgCl_2). Маркер размера S-ДНК (pBR322 переваривается mspI). Образцы были решены в 6% родной PAGE. ДНК была окрашена бромидом этидия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 6: Продукты первого ПЦР в цикле отбора. См Рисунок 1B,шаг III; протокол шаг 5.10. Наборы столбцов 1 и 2 являются аликотами двух разных библиотек, загруженных в тройной. Стандарт размера S-ДНК (ДНК лямбда, переваренный с HindIII и EcoRI). Стрелка указывает положение полноформатного ESC (1,050 bp). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 7: Варианты NlaIV очищены для дальнейшего скрининга в мини-масштабе. Смотрите шаг 6.3.11. Каждая линия содержит 10 qL aliquot другого варианта. S-белковый молекулярный вес стандарт. Молекулярная масса подразделения NaIV REase составляет 29,9 кДа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 8: Примеры скрининга вариантов NlaIV для изменения специфичности последовательности. Смотрите шаг 6.4.2. (A) Успешный скрининг с высокой частотой перспективных вариантов. S - маркер размера ДНК, ДНК лямбды, расщепляемые с Хиндиии и ЭкоРИ; дикий тип (wt) - лямбда ДНК расщеплялась с диким типом NlaIV; Субстрат ДНК лямбда, а не расщепляться; другие столбцы с очень низкой активностью. Варианты помечены! перспективные варианты, которые производят шаблон расщепления отличается от фермента дикого типа; ? варианты, которые также могли бы изменить предпочтение последовательности. (B) Неудачный скрининг, с большинством вариантов неактивным и один вариант с по-видимому неизменным шаблоном расщепления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 9: Альтернативный выбор по перевязке. Эта альтернатива может быть использована для всех REases генерации липких концов. Здесь мы представляем пример протокола для схемы отбора для фермента MwoI (неопубликованные). I) Выбранная последовательность (расположенная в правом конце ESC) с определенными остатками, показанными красным цветом, и выбранной вариацией последовательности cognate, показанной синим цветом. В скобках ниже выбранной последовательности счетчика, которая должна быть помещена в левом конце ESC показано; II) Продукт расщепления MwoI; III) После прекращения транскрипции/перевода in vitro продукты очищаются и перевязка выполняется с избытком адаптера. В перевязке могут участвовать только продукты расщепления, которые были расщеплены в выбранной последовательности. Поэтому неактивные варианты устраняются, а шаг стягивания не нужен. Продукт расщепления в выбранной последовательности счетчика (на левом конце ESC, не показан) не может участвовать в этой перевязке, поскольку выступающий конец адаптера не дополняет выбранную последовательность счетчика; IV) Селективный PCR использует ту же стратегию, что и в основном протоколе, для устранения вариантов с дегенеративной специфичностью последовательности дикого типа (F1 primer, связывающей дисталь на выбранном сайте счетчика), в то время как неактивные варианты устраняются селективным обратным грунтового, который не может связываться с дядевским (и, следовательно, не измененным перевязкой адаптера) правого конца. В следующем цикле процесс может быть итерирован с помощью адаптера, идентичного продукту расщепления предыдущего шага (т.е. «расщепленная кассета» в панели III), и соответствующей селективной реверсивной грунтовкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Таблица 1: Праймеры, используемые в разработке NlaIV. Подчеркиваются последовательности сайтов, упомянутых в комментариях. Небольшие буквы указывают последовательности, которые не имеют дополнений в шаблонах ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту таблицу (Право нажмите, чтобы скачать).

Таблица 2: Условия реакции ПЦР, которые будут использоваться в протоколе. Температура_m т м и грунтовка плавления (если T_m отличается для грунтовков, то следует использовать нижний_Т-м). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту таблицу (Право нажмите, чтобы скачать).

Таблица 3: Результаты проверки качества двух мутагенных грунтовок, синтезированных со стратегией сплит-и-микс. Мутагенизированные кодоны обозначены с помощью «XXX». Более низкое индексное число указывает на положение закодированной аминокислоты. Адаптировано из Чапинска и др.⁸ с разрешения Elsevier. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту таблицу (Право нажмите, чтобы скачать).

Таблица 4: Результаты EP-PCR. Основные параметры, полученные из последовательного анализа 22 клонов ECS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту таблицу (Право нажмите, чтобы скачать).

Обсуждение

Протокол отбора, описанный здесь, был протестирован для NlaIV⁸, димерической PD-(D/E)XK последовательности распознавания, которая распознает палиндромный целевой сайт с центральными базами NN и катализает тупой конец разреза между базами NN. NlaIV был выбран потому что расщепление между основаниями NN предлагает что эти основания близко к протеину в комплексе. В принципе, протокол может быть использован для любой последовательности конкретных ограничений эндонуклеазы, мономерные или димерические, любой группы раза, катализируя двойные разрывы нити любого шата, независимо от того, каталитические и специфика доменов совпадают (как в примере NlaIV) или являются отдельными (например, FokI). Более того, протокол в принципе полезен не только для генерации новой, более узкой ферментной специфичности, но и может быть использован для устранения звездной деятельности или для создания высокой эндонуклеазы верности. Однако все это еще не было проверено. В частности, целенаправленная ликвидация звездной активности может быть осложнена тем, что те же остатки аминокислот могут быть связаны с привязкой к желаемым и нежелательным основаниям. Шаги in vitro, описанные в этом протоколе, не ограничиваются выбором суженных специфических, но также могут быть использованы для выбора измененных в противном случае особенностей. Однако, есть тогда проблема с вариантом эндонуклеазы: если спектр субстратов включает в себя новые цели, не расщепленные родительской эндонуклеазы, то в целом нет хорошего способа защитить клетки от вредного воздействия этой деятельности. В отличие от этого, если эндонуклеазная специфичность только сужается, цели подмножество диких целей типа, и, следовательно, уже доступны cognate метилтрансферазы должны быть полностью защитные.

Наш протокол отличается в нескольких отношениях от многих направленных протоколов эволюции. Разнообразие открытого кадра чтения генерируется один раз в начале эксперимента, а не во всех итерациях. Более того, он создается путем синтеза сплит-микса, а не EP-PCR. Для замен ы кодонов НСН, используемых в этой работе, есть (4 х 4 х 2)⁶ и 1,07 х 10⁹ комбинаций для шести позиций. Таким образом, любой данный вариант присутствует в среднем один раз в 1,7 fmoles ESC. Эта емкость может быть увеличена до семи позиций с помощью синтеза со смесью 20 прекурсоров тринуклеотида, которые предлагаются Glen Research или за счет уменьшения частоты мутаций в менее перспективных позициях с синтезом сплит-и-микс олигонуклеотидов. По возможности рекомендуется ограничить степень вариации шестью позициями. Очевидно, что такой адресный мутагенез требует некоторых уже существующих знаний о по крайней мере регионах REase, участвующих в привязке субстрата. Протокол сплит-микс для создания разнообразия имеет явные преимущества по сравнению с EP-PCR. Используя EP-PCR, мы получили неизменные варианты и последовательности, несущие восемь замен для NLaIV ESCs в том же EP-PCR (таблица 4). Библиотека EP-PCR содержит значительную часть клонов, которых следует избегать (дикие последовательности типов, множественные замены, смещение кадров и мутации ерунды, а также мутации в местах, которые вряд ли повлияют на специфичность последовательности).

Наш протокол также отличается от многих других направленных протоколов эволюции наличием двух последовательных шагов отбора. Положительный выбор гарантирует, что желаемая активность сохраняется, в противном случае тег биотина не удаляется, а последовательность кодирования может быть удалена путем вытягивания вниз. Технически возможно, что случайное появление романа, не перекрывающихся специфичности (например, GCATGC) может привести к разрыву биотина тега, а, если подходящий сайт расщепления присутствует вблизи желаемого расщепления, но не в другом месте. Однако это должно быть крайне маловероятно. Отрицательный выбор удаляет открытые рамки чтения, которые кодируют ферменты, которые все еще имеют нежелательную активность. Этот шаг не является строго обязательным, поскольку протокол по-прежнему обогащает библиотеку вывода вариантами, которые способны расщеплять последовательность выбора, но не в состоянии расщеплять в другом месте В ESC, что делает его непригодным для усиления ПЦР. Тем не менее, эффективность отбора, как ожидается, будет ниже, потому что ферменты с оригинальной специфичностью последовательности не будут удалены из вывода и превзойти перспективные варианты с измененной специфичностью, но и снижение ферментатической активности. Обратите внимание, что на уровне популяции как желаемые, так и нежелательные целевые последовательности могут, но не должны быть, вырождаться. В примере nlaIV анти-цель была вырожденной, а цель недегенерацией. Даже при вырождения на уровне населения, в одной капли присутствует только одна (недегенеративная) цель или противоцельный. В нашем протоколе целевые и антицелевые последовательности вновь вводятся при каждом повторении шагов отбора. Таким образом, открытая рамка чтения должна кодировать фермент, способный расщеплять все возможные цели, и не в состоянии расщеплять любой из анти-целей, чтобы выжить несколько раундов отбора. Обратите внимание, что необходимость повторного введения цели антивыбора при каждой итерации протокола обеспечивает соблюдение двух последовательных ПЦР. Первый ПЦР использует грунтовку, которая андалинируется за пределами антицели, так что расщепление анти-цели предотвращает реакцию ПЦР. Второй PCR требует грунтовки, которая выходит за рамки анти-цели, и вновь вводит анти-цели, чтобы убедиться, что во время нескольких раундов отбора, каждый открытый кадр чтения проверяется против всех вариантов анти-цели.

Для ферментов, которые генерируют липкие концы, может быть использован соответствующий альтернативный протокол, основанный на ранее описанном методе изоляции REase ORF^10. Истощение неактивных вариантов биотина захвата, который используется в наших экспериментах заменяется в альтернативном протоколе путем перевязки совместимого адаптера с последовательностью, которая используется в качестве сайта связывания грунтовки в селективном ПЦР(Рисунок 9). Только ESCs, которые производят ферменты с выбранной специфичности генерировать перевязки способных концов и, следовательно, будут выбраны. Последовательность липкого конца выбранной последовательности счетчика должна быть разработана таким образом, чтобы она не смогли участвовать в перевязывания с адаптерами. Итерация процесса отбора может быть легко достигнута путем переключения между двумя различными адаптерами и, следовательно, двумя различными обратными праймерами в селективном ПЦР.

Даже с новыми протоколами, задача инженерных новых особенностей в пробирке по-прежнему очень сложной задачей. Для типичного типа II REases, специфичность последовательности и эндонуклелитической активности зависят от одних и тех же белковых регионов. Поэтому трудно изменить одно, не затрагивая другое. Успех делается более вероятно, стратегия, которая учитывает след фермента, уважает симметрию белково-ДНК взаимодействий, и опирается на уже существующие ферментативные предпочтения, которые должны быть определены авансом в биохимических экспериментов, как это было сделано для nlaIV пример⁸.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1000Å Поддержка CPG (dA, dT, dC, dG)	Biosset	45-1000-050	Также можно использовать других поставщиков
, а также ASM-800 DNA/RNA	Biosset	800-001-000
GeneJET Gel Extraction Kit	Thermo Scientific	K0691	Любой другой набор может быть использован
Glen-Pak Картридж для очистки ДНК	Glen Research	60-5200
HIS-Select Nickel Affinity Gel	Sigma	P6611
pET 28a вектор			Любой другой вектор с промотором T7 перед сайтом клонирования может быть использован
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F530S	Любой другой высокоточный и высокотехнологичный термофильный полимеш может быть использован
Фольга из пористой стали	Biosset	40-063
Rapid Translation System RTS 100, E.coli HY Kit	Roche	3 186 148
Эндонуклеазы рестрикции	Thermo Scientific		Очевидно, что другие поставщики, ферменты могут быть использованы
Стрептавидин Магнитные шарики	New England Biolabs	S1420S	Другие поставщики также могут быть использованы. Мы положительно протестировали пласты из
химических веществ Sigma Synthesis, включая фосфорамиды	Carl Roth		Также можно использовать других поставщиков
Колонки для синтеза (разных размеров)	Biosset
T4 DNA ligase	Thermo	Scientific EL0011	Можно использовать любую другую лигазу