Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Метод совместной культуры для изучения Нейрита Отток аурост в ответ на стоматологические целлюлозы Паракриновые сигналы

6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60809

⸱

14 февраля 2020 г.

 ,  , 
1Cell, Developmental and Integrative Biology Department, University of Alabama at Birmingham

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем изоляцию, дисперсию и покрытие зубной пульпы (DP) первичных клеток с тройничных (TG) нейронов культивируется на вершине над трансвелл фильтры. Клеточные реакции клеток ДП можно анализировать с помощью иммунофлюоресценции или АНАЛИЗА РНК/белка. Иммунофлуоресценция нейронных маркеров с конфокальной микроскопией позволяет анализировать реакции невритовых наростов.

Аннотация

Иннервация зубов позволяет зубам чувствовать давление, температуру и воспаление, все из которых имеют решающее значение для использования и поддержания зубного органа. Без сенсорной иннервации ежедневная пероральная деятельность нанесет непоправимый ущерб. Несмотря на свою важность, роль иннервации в развитии и обслуживании зубов в значительной степени упускается из виду. Несколько исследований показали, что DP-клетки выделяют внеклеточные матричные белки и паракриновые сигналы для привлечения и руководства Аксонами TG в и по всему зубу. Тем не менее, несколько исследований предоставили детальное представление о перекрестном разговоре между мезенхимом DP и нейрональными афферентами. Для устранения этого пробела в знаниях исследователи начали использовать сокультуры и различные методы для изучения этих взаимодействий. Здесь мы демонстрируем несколько шагов, участвующих в сокультивации первичных клеток ДП с TG нейронов рассеялись на надивной трансвелл фильтр с большим диаметром поры, чтобы аксональный рост через поры. Первичные клетки DP с геном интереса в окружении локс сайтов были использованы для облегчения удаления генов с помощью аденовирусной-Cre-GFP рекомбиназной системы. Использование TG нейронов из мыши Thy1-YFP позволило точное афферентное изображение, с выражением значительно выше фоновых уровней конфокальной микроскопии. Ответы DP могут быть исследованы с помощью сбора и анализа белков или РНК, или же, через иммунофлуоресцентное окрашивание клеток ДП, покрытых съемными стеклянными крышками. Средства массовой информации могут быть проанализированы с помощью таких методов, как протеомный анализ, хотя это потребует истощения альбумина из-за присутствия сыворотки крупного рогатого скота в средствах массовой информации. Этот протокол предоставляет простой метод, которым можно манипулировать для изучения морфологических, генетических и цитоскелетных реакций TG нейронов и клеток ДП в ответ на контролируемую среду совместного культурного исследования.

Введение

Иннервация зубов позволяет зубам чувствовать давление, температуру и воспаление, все из которых имеют решающее значение для использования и поддержания зубного органа. Неспособность почувствовать боль зубов, связанную с кариесом зубов и травмой, приводит к прогрессированию заболевания. Таким образом, надлежащая иннервация является требованием для нормального роста зубов, функции и ухода.

В то время как большинство органов полностью функциональны и invated к моменту рождения, развитие зубов распространяется на взрослую жизнь, с иннервации зубов и минерализации, происходящих в концерте во время послеродовой стадии1,2. Интересно, что зубная целлюлоза (DP) мезенхим первоначально выделяет репелленты сигналы во время эмбриогенеза, чтобы предотвратить проникновение аксона в развивающийся зубной орган, который позже переходит к секреции привлекательных факторов, как зуб приближается к извержению3,4. Во время послеродовых стадий афферентные аксоны из тройничного (TG) нерва проникают в и по всему зубу во время осаждения дентина начинается (обзор в Pagella, P. et al.5). Несколько исследований in vivo показали, что нейронно-мезенхимальные взаимодействия направляют иннервацию зубов у мышей (рассмотрено в Luukko, K. et al.6),но мало деталей молекулярных механизмов доступны.

Сокультуры клеток обеспечивают контролируемую среду, в которой исследователи могут манипулировать взаимодействиями между нейронными и мезенхимальными популяциями. Эксперименты по совместной культуре позволяют глубже углубиться в сигнальные пути, направляющие иннервацию и развитие зубов. Тем не менее, некоторые из обычных методов, используемых для изучения клеток в совместной культуре представляют технические проблемы. Например, кристально фиолетовое окрашивание невритовых наростов может неспецифически пятно Шванн клетки, включенные в TG рассеивания рассеивания расслоения расслоения, и могут быть пики интенсивности цвета с относительно небольшими ответами7. Микрофлюидные камеры предлагают привлекательный вариант, но значительно дороже, чем трансвелл фильтры8,9 и только позволяют исследования нейрональных реакций на DP выделения. Для решения этих вопросов, мы разработали протокол, который позволяет: а) точное окрашивание и изображение TG неврит рост в ответ на DP выделения, б) генетическая модификация DP клеток и / или TG нейронов для расследования конкретных сигнальных путей, и в) исследование DP клеток ответы на факторы, выделяемые TG нейронов. Этот протокол обеспечивает возможность точно исследовать несколько особенностей иннервации зубов в контролируемой среде анализа совместной культуры in vitro.

   

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты с мышами были одобрены Институциональным комитетом UAB по уходу за животными и использованию (IACUC).

1. Приготовление плиты

ПРИМЕЧАНИЕ: Обложки могут быть использованы для изображения dP-клеток в конце асссе. Убедитесь, что крышка пластины на все инкубации и промывки шаги за пределами стерильной ткани культуры капота для предотвращения загрязнения во время обработки образцов.

  1. Подготовка coverslip
    1. Автоклав круговые крышки.
    2. Фильтр ультрачистая вода под капотом.
    3. Перенесите крышки на 24-колодную пластину и покройте каждый из них 400 мл/мл поли-Д-лизин.
    4. Разрешить coverslips, чтобы впитаться, погруженный в течение 5 минут, на рокер на 12 об /мин или орбитальный шейкер на 40-50 об/мин. Убедитесь, что крышка на предотвращение загрязнения.
    5. Промыть крышки с фильтрованием ультрачистой воды около 5 мин на рокер на 12 об/мин или шейкер на 50 об/мин. Повторите.
    6. Разрешить крышки высохнуть, по крайней мере 2 ч под капотом с пластиной крышкой, чтобы облегчить испарение. Эти крышки должны быть использованы в пределах 48 ч.
    7. Клетки семян DP на вершине охватывает и обрабатывают в конце анализа на иммунофлуоресценцию (раздел 3.3).
  2. Фильтры покрытия
    1. Разбавить ламинин до 10 мкг/мл. Фильтр разбавленного ламинина под капотом.
    2. Пипетка 450-500 л из 10 мкг/мл ламинина в каждую скважину из 24-колодца пластины.
    3. Поместите трансвелл фильтр, 3 мкм пористость, в хорошо, так что он контактирует с раствором ламинина и оставить его в инкубаторе 37 градусов по Цельсию либо на 2 ч или на ночь. Фильтр поры должны позволить некоторые решения для рассеиваться и пальто как в верхней и нижней части фильтра. Эти фильтры должны использоваться в течение 48 ч или храниться в холодильнике при 4 градусах По Цельсию в течение 1 недели.

2. Клеточное покрытие с факультативным генетическим манипулированием

  1. Мыши: Генетическое изменение клеток DP может быть выполнено (но не требуется) для изучения мезенхимально-нейрональных взаимодействий. Смотрите разделы 2.3 и 2.4 для предлагаемых генетических вариаций.
  2. DP вскрытие, дисперсия и покрытие(рисунок 1)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для dP вскрытия, используйте ультра-тонкие, прямой край щипц. Ультратонкие края позволят пользователю вклинить край силы между минерализованной структурой и тканью DP.
    1. Урожай P5-P8 мышей. На этом этапе зубы должны быть минерализуются, а корень открыт.
    2. Обезоживать новорожденных с помощью переохлаждения, помещая их в блюдо в холодильнике 4 ккс, пока они больше не двигаться или реагировать на ощупь. Эвтаназия новорожденных путем обезглавливания и в соответствии с процедурами IACUC на указанном объекте.
    3. Подготовьте 3-5 мл аликот 0,25% трипсин-EDTA в 50 мл конической трубки для сбора DP от каждой мыши. Это облегчит переваривание зубной пульпы у послеродовых мышей. Используйте более 3 мл при переваривании тканей более чем у 10 послеродовых мышей.
    4. Поместите голову на одноразовую подкладку так, чтобы рот к потолку и основание шеи плоским на рабочей поверхности. Используйте лезвие бритвы в распиловки движения, чтобы отделить челюсть от челюсти.
    5. Дополнительно удалить язык либо с ножницами или с щипками, чтобы облегчить доступ к молярам.
    6. Поместите открытую голову в блюдо на стерильной марлевой площадке и поместите образец под рассекающим микроскопом(рисунок 1D).
    7. Удалите альвеолярную костную ткань, окружающую первые моляры. Подчелюстные зубы не полностью прорезаются в этой точке. Вставьте щипцы в альвеолярное отверстие и дразнить ткани от зуба к buccal (щека) или лингвистической (язык) стороне рта. Челюстные зубы потребуют полного удаления расщелина вокруг зуба для воздействия и удаления.
    8. Аккуратно перенесите подчелюстные и челюстно-лицевые первые моляры (M1s) в отдельное блюдо клеточной культуры с 1x фосфат-буферным сольней (PBS).
    9. Повторите 2.2.4-2.2.8 до тех пор, пока все M1s не будут собраны. Держите блюдо, содержащее M1s на льду во время уборки урожая.
    10. Удалите внешний орган Enamel (EOE), окружающий внешнюю сторону каждого M1. Это может быть сделано после шага 2.2.11.
    11. С набором щипц, поверните M1 так cusps вниз и открытый корень подвергается. На дне зуба будет овальное отверстие, а непрозрачная ткань ДП инкапсулирована тонким слоем дентина и эмали.
    12. Используя кончик щипцы, мягко ослабить DP, запустив одну руку щипцы вокруг внутренней окружности минерализованной ткани. Удалить ткань DP из минерализованной структуры и передать его в третье блюдо, содержащее 1x PBS. Удалите EOE, если он еще не отделен(рисунок 1E).
    13. Перенесите всю ткань DP на 0,25% трипсин-ЭДТА в конической трубке 50 мл. Vortex смесь и место в 37 градусов по Цельсию теплой водяной бане в течение 10 минут. Это может быть сделано с теми же щипцы или с длинными, флакон щипцы. Ткань будет трудно разойтись и потребует вихря каждые 3-4 мин. Не превышать 10 мин трипсиизации, так как трипсин может повредить клеточные мембраны.
    14. Под стерильным капюшоном добавьте разогретые средства массовой информации совместной культуры(Таблица 1)к окончательному соотношению не менее 1:1 носителя, чтобы трипсин инактивировать фермент. Более большие соотношения приемлемы если больше дисперсии ткани желательно.
    15. Pipette средств массовой информации вверх и вниз несколько раз с 10 мл пипетка для дальнейшего разгона DP в средствах массовой информации. Будьте осторожны, чтобы избежать больших пузырьков. Полное дисперсия практически невозможна из-за липкой природы ткани. Тем не менее, это также не является необходимым, поскольку клетки будут мигрировать наружу из ткани после покрывало.
    16. Передача 1 мл рассеянного DP к каждой скважине из 24-хорошо ткани культуры пластины(рисунок 1F).
    17. Поместите пластину в инкубатор при 37 градусах Цельсия и позвольте клеткам прикрепляться и мигрировать из неразоперсперых тканей в течение 48 ч перед изменением носителя. Первичные клетки должны быть покрыты в относительно высоких концентрациях, чтобы достичь 85-90% слияния в течение 1 недели. Если это не будет достигнуто через 1 неделю, отбросьте пластину.
  3. Факультативное генетическое манипулирование клетками ДП
    1. Чтобы изменить пути сигнализации клеток, урожай DP клеток из генетических мышей нокаут или от мышей, в которых ген интереса в окружении loxP сайтов. В последнем случае, ген может быть удален с помощью рекомбины Adenovirus-Cre-GFP (Ad-Cre-GFP) для удаления флангового гена, как описано ниже. Используйте Adenovirus-eGFP (Ad-eGFP) в качестве контрольного вируса, чтобы гарантировать, что вирусная инфекция не вызывает клеточной реакции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ad-eGFP контролируется усилителем промоутера CMV, который очень силен. Ad-Cre-GFP регулируется IRES, внутренним регулятивным регионом между Cre и GFP, который не очень силен. Это приводит к более яркой флуоресценции в клетках Ad-eGFP, чем в ad-Cre-GFP. Подтверждать эквивалентные уровни инфекции на основе общего числа клеток флуоресценции, а не на уровнях клеточной флуоресценции.
    2. Подготовьте 500 л носителей, содержащих вирус, и 10 мкг/мл полибрена на скважину. Polybrene помогает с вирусной инфекцией в клетках около слияния10. Этот протокол основан на множественности инфекции (MOI) 100 для Ad-eGFP и 200 Ad-Cre-GFP для эффективной генной инфекции с небольшим или вообще не влияет на жизнеспособность клеток. Расчетный номер ячейки 4 х 104 клетки / хорошо из 24-хорошо пластины:
      figure-protocol-1
    3. Смешайте носители с кратким вихрем или пипеткой и добавьте 500 кL к каждой скважине.
    4. После 24 ч добавьте еще 500 qL кокультурных носителей, которые не содержат дополнительных полибренов или вирусов.
    5. После в общей сложности 48 ч, аспирированные вирусосодержащие средства массовой информации и заменить на свежие совместно-культуры средств массовой информации. На данный момент, TG нейроны могут быть добавлены на вершине трансвелл фильтров.
  4. Рассечение нейронов тригеминала, рассечение и покрытие
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе, изображение неврита нарост в совместной культуре с DP клетки были оптимизированы с помощью подростков (6-недельный) B6.Cg-Tg (Thy1-YFP)16Jrs/J мышей. Центральная и периферическая нервная системы мышей Thy1-YFP имеют желтый флуоресцентный белок (YFP) тег, выражение которого начинается вокруг P6-P10 в нейронах и увеличивается экспоненциально по всей нервной системе в течение послеродовой и взрослой жизни11,12. YFP и GFP сохранили последовательности, которые позволяют этим нервам быть окрашены антителами против GFP, в результате чего пан-нейронального пятна. В конечном счете, эти мыши позволяют лучше визуализации и количественной оценки нейронов, используемых и выращенных в клеточной культуре.
    1. Эвтаназия подростков мышей с углекислым газом с последующим вывихом шейки матки.
    2. Обезглавить мышей и удалить кожу из черепа. Не забудьте включить эквивалентное количество мужчин и женщин.
    3. Вставьте кончик пары микрорассекующих ножниц в основание черепа. Вырезать вдоль sagittal шов черепа(Рисунок 1A).
    4. Сделайте четыре небольших горизонтальных пореза: два вдоль корональных швов ушами и два вдоль швов лямбдоида у основания черепа. Это должно создать два закрылка кости.
    5. Используйте щипцы, чтобы очистить назад два закрылка кости. Это должно выявить мозг.
    6. Удалите мозг. Перенесите голову в блюдо культуры тканей с 1x PBS и положить под микроскопом.
    7. Найдите TG ганглии, которые легко видны у грызунов13, размещенных в дюре материи между мозгом и кости челюстно-лицевого процесса (Рисунок 1B).
    8. Вырезать три ветви, которые путешествуют в глаза, челюсти и челюсти и передачи ганглиев на холодный 1x PBS с помощью прямой край штрафа щипцы. Держите блюдо, содержащее Ганглии TG на льду во время уборки урожая.
    9. После того, как все TG пучки собирают, передача ганглиев в 50 мл конической трубки, содержащей 5 мг/мл стерильной фильтрованной коллагеназы типа II с помощью флаконщины.
    10. Vortex коллагенеза с tG расслоение и поместить трубку в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 25-30 мин. В течение этого времени, принять конические трубки из водяной ванны, вихрь, и вернуться в ванну каждые 5-10 минут.
    11. Centrifuge коллагеназа-TG нейрона решение в течение 2 мин на 643 х г.
    12. Под капюшоном культуры ткани, нежно аспирировать коллагенеза с micropipette.
    13. Добавьте 5 мл 1% стерильной фильтрованного трипсина II типа и вихря. Поместите коническую трубку в водяную ванну 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
    14. Centrifuge трипсин-TG смесь в течение 5 мин на 643 х г. Удалите верхнюю часть трипсина с помощью микропипетта, чтобы нейроны TG не удаляются. В трубке все равно будет жидкость.
    15. Добавьте достаточное количество носителей, чтобы отключить оставшийся трипсин (при 1:1 или более низком соотношении трипсина к сми).
    16. Подсчитайте количество клеток и разбавьте раствор до 200 000 клеток/мл (250 л клеток, содержащих 50 000 клеток).
    17. Поместите фильтры с покрытием трансвелл из раздела 1.2 в колодцы с DP.
    18. Разбавить клеток содержащий раствор так, что Есть 200000 клеток / мл. Пипетка 250 л на трансвелл фильтр, и культуры клеток на 37 градусов по Цельсию в одночасье(рисунок 1F).
    19. На следующий день, заменить средства массовой информации с 1 мл со-культуры средств массовой информации с 1 ММ уридина и 15 ММ 5 '-флюор-2'deoxyuridine, чтобы остановить чрезмерное распространение мезенхимальных клеток, которые могут предотвратить неврит овых. Дополнительно: Добавить факторы роста или ингибиторы в этом носителе при попытке дальнейших манипуляций.
    20. Культура клетки для дополнительных желаемых точек времени. Этот протокол был оптимизирован в течение 5 дней культуры со средствами массовой информации изменены только на второй день, чтобы добавить митотические ингибиторы. Более длительные периоды времени потребуют дополнительных изменений мультимедиа.

3. Сбор и обработка образцов

  1. Тройничное окрашивание
    1. Pipette 1 мл aliquots стерильных 1x PBS в 24-колодец пластины под тканью культуры капот для каждого трансвелл фильтр анимируется.
    2. Удалите жидкость на вершине фильтра, удаляйтесь с помощью пипетки на 200-1000 л, стараясь оставить слои клеток нетронутыми. Прикрепленные клетки должны оставаться прикрепленными и незакрепленные клетки будут свободно во время этого нежного pipetting. Вакуумный фильтр может повредить слой клетки и не рекомендуется для аспирации.
    3. Перенесите фильтр на пластину 1x PBS, будучи уверенным, чтобы удалить верхний слой носителя, как упоминалось в предыдущем шаге.
    4. Поместите пластину со всеми трансвелл фильтры и крышки на рокер на 12 об/мин или 40-50 об/мин на орбитальный шейкер в течение 10 минут.
    5. Аспирировать PBS, в том числе верхний слой, как описано выше, добавить 500 зл 1xPBS и место на рокер или орбитальный шейкер для дополнительного 5-10 мин промыть.
    6. Аспирируйте 1x PBS еще раз и заменить 4% параформальдегида (PFA). Используйте не менее 500 л, чтобы вся поверхность фильтра была погружена в воду. Поместите тарелку на рокер при 12 об/мин или орбитальный шейкер при 40-50 об/мин при комнатной температуре 1 ч.
    7. Удалите PFA и промыть пластины дважды в течение 5-10 минут каждый на рокер с 500 Зл л 1x PBS.
    8. Блок с 10% бычьей сыворотки альбумина (BSA) 5% козьей/ ослиной сыворотки, в зависимости от вторичного животного хозяина антитела, в 0.05% Tween-1xPBS (PBST). Используйте 450-500 л раствора, чтобы фильтр погружался в жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, эти пластины могут храниться при 4 градусах По Цельсию в течение нескольких месяцев для обработки в более позднее время. Используйте parafilm для уплотнения пластины, чтобы обеспечить испарение не происходит и регулярно проверять на испарение, так что поверхность фильтра остаются погруженными.
    9. Удалить блок и добавить 450-500 л первичных антител в 1% BSA-PBST без дополнительной промывки. Инкубировать при 4 градусах Цельсия на ночь, нежно качаясь.
    10. Удалить первичный раствор антитела и промыть 500 л 1xPBST на рокер, 3 раза, при комнатной температуре
    11. Удалить PBST, добавить вторичные антитела и инкубировать на рокер ночь на 4 КС, завернутые в алюминиевую фольгу для защиты фторофоров от деградации света. Промыть снова, 3 раза, с 1x PBST на рокер при комнатной температуре. Заменить на 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, пластина может храниться в течение нескольких месяцев при 4 градусах Цельсия, если завернутый в алюминиевую фольгу, чтобы предотвратить деградацию фторофора. Используйте parafilm для уплотнения пластины, чтобы обеспечить испарение не происходит и регулярно проверять на испарение, так что поверхность фильтра остаются погруженными. Лучше всего изображение в течение одного месяца.
    12. Для оптимальной визуализации, использовать Thy1-YFP мыши нейронов с анти-GFP антитела специально пятно нейрональных афферентов значительно выше фоновых уровней. Используйте Anti-Neurofilament 200, чтобы точно пятно аксональных структур, если Thy1-YFP мышей не доступны.
    13. Изображение по желанию. Фильтры не должны быть покрыты и вместо этого могут быть размещены на вершине coverslip или слайд для визуализации с перевернутым микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Области фильтра не будут содержать афферентные структуры. Возьмите несколько изображений с глубиной z-стек, который захватывает все афферентные структуры. Используйте программное обеспечение для сшивания для визуализации неврита на больших площадях или (желательно) целых областях фильтра.
  2. Коллекция РНК, белков и носителей
    1. В то время как трансвелл фильтры обработки, собирать средства массовой информации в RNAse / DNAse свободных труб и заморозить для более поздних анализов (ELISA, протеомика и т.д.).
    2. Сразу же после сбора средств массовой информации, аликвот лисис буфера или радио иммуно осадков Анализ (RIPA) буфер с протеиназы и фосфатазы ингибиторов в скважины. Этот протокол был оптимизирован для 100 л/колодца в 24-хорошей пластине.
    3. Разрешить буферов лиза клетки в течение 5 минут, а затем очистить каждый фильтр с новым кончиком пипетки, и собирать образцы клеток в RNAse / DNAse свободных труб. Заморозить лисис для будущих анализов (полуколичественные и/или количественные ПЦР, Западная поника и т.д.).
  3. Факультативная иммунофлуоресценция клеток зубной целлюлозы:
    1. Аккуратно поднимите крышки из раздела 1.1 с щипками и перенесите их в различные скважины с 4% PFA на 1 ч с раскачиванием.
    2. Аспир PFA и промыть крышки дважды с 1x PBS. Следуйте этому с пермяковизацией, блокированием и иммунофлуоресценцией для маркеров, представляющих интерес со стандартными методами иммунофлюоресценции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эти результаты показывают, что TG neurite рост был увеличен в присутствии первичных клеток DP в основной хорошо по сравнению с контролем TG неврит монокультуры (Рисунок 2A,C). Существует некоторая изменчивость асссея в неврите. Таким образом, монокультура нейронов TG должна быть включена во все анализы в качестве контроля для обнаружения базальных уровней невритовых наростов. Первичные клетки из мыши Tgfbr2f/f были использованы в этом протоколе после заражения Ad-...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Ежедневная деятельность полости рта требует, чтобы зубы смысле внешних стимулов и внутреннего воспаления, с тем чтобы обеспечить надлежащее использование и техническое обслуживание. Однако, только ограниченная информация имеющаяся относительно сигналов которые управляют процессами развития иннервации зуба. Этот протокол предоставляет метод изоляции и совместной культуры первичных клеток ДП и TG нейронов для изучения перекрестного общения между двумя популяциями. Некоторые переменные были оптимизированы и оставляют открыт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана а) Национальные институты здравоохранения / NIAMS (грант номера R01 AR062507 и R01 AR053860 в RS), б) Университет Алабамы в Бирмингеме Стоматологическая академическая исследовательская подготовка (DART) грант (номер T90DE022736 (PI MacDougall)) в SBP от Национального института стоматологических и краниоциальных исследований / национального института в) UAB Глобальный центр краниофациальных, устных и стоматологических расстройств (GC-CODED) Пилот и доступность гранта SBP и d) Национальный институт стоматологии и craniofacial Научно-исследовательские/Национальные институты здравоохранения K99 DE024406 грант SBP.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
5-фтор-2'-дезоксиуридинSigma-AldrichF0503используется в качестве ингибитора митотики при концентрации 15 мкм; M концентрация в кокультуральных средах, День 2
24 Well Cell Culture PlateCorning3524Co-culture plate
Alexa-546 Anti-chickenInvitrogenA-11040Вторично по отношению к окрашиванию нейритов, меченных антителом против GFP, разведение 1:500
Anti-GFP антителоAves Lab, IncGFP-1010Первичное антитело для мечения нейронов Thy1-YFP, разведение 1:200
Anti-Neurofilament 200 антителоSigma-AldrichNO142Моноклональное первичное антитело к меченым нейронам, разведение 1:1000, альтернатива, если мыши с YFP недоступны
B6; 129- Tgfbr2tm1Karl/JЛаборатория Джексона12603Tgfbr2f/f модель мыши, используемая для клеток пульпы зубов в оптимизированном протоколе
B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/JЛаборатория Джексона3709Генотип мышиной модели Thy1-YFP используется для нейронов тройничного нерва
Коллагеназа типа IIMillipore234155-100MGИспользуется для диспергирования нейронов тройничного нерва
Фетальная бычья сывороткаGibco10437Добавка к кокультуральным средам
Тонкие щипцыFine Science Tools11413-11Тонкие щипцы для диссекции ТГ
LamininSigma-AldrichL2020Покрывает трансвелловые вставки при конечной концентрации 10 мкм; г/мл, исходный раствор предполагается в дозе 1,5 мг/мл
Лизисный буфер (Buffer RLT)Qiagen79216Извлекает РНК из клеток пульпы зуба после совместной культуры
L-глутаминGibco25030081Добавка к сокультуральным средам Микрорассекающие ножницы
Sigma-AldrichS3146-1EAНожницы для вскрытия черепа
Крышка микроскопа СтеклоFisherbrand12-545-81Круговой покровный стакан для дополнительного культивирования клеток и иммунофлуоресцентной
обработки Minimal Essential Medium aGibco12571063Ко-культуральная среда
Пенициллин-стрептомицинGibco15070063Антибиотическая добавка к кокультуральным средам
Ингибитор фосфатазыSigma-Aldrich04 906 837 001Добавка к RIPA Буфер для экстракции белка из клеток пульпы зуба после ко-культура
PolybreneMilliporeTR-1003-GИспользуется для помощи в трансфекции клеток пульпы зуба
Poly-D-LysineSigma-AldrichP7280Покровное покрытие для содействия клеточной адгезии пульпы зуба
Ингибиторы протеазыMillipore05 892 791 001Добавка к буферу RIPA для извлечения белка из клеток пульпы зуба после ко-культивирования
свободных пробирок эппендорфа РНКазы/ДНКазыDenvilleC-2172Предварительно стерилизованные пробирки объемом 1,7 мл для сбора РНК, ДНК или белка в конце анализа
Вкладыш для клеточных культур ThinCert Вкладыш для клеточных культурGreiner Bio-One662631Transwell Вкладыши для нейронов тройничного нерва в анализах совместной культуры
Trypsin-EDTA (0,25%)Gibco25200056Используется для диспергирования клеток пульпы зубов
Трипсин типа IISigma-AldrichT-7409Используется для диспергирования нейроны тройничного нерва
Ультратонкие щипцыFine Science Tools11370-40Ультратонкие щипцы для диссекции
UridineSigma-AldrichU3750Используется в качестве митотического ингибитора при 1 мкм; Концентрация М в средах сокультур, система
вакуумной фильтрацииMilliporeSCNY00060одноразовый фильтр Steriflip, 50 мкм; m нейлоновый сетчатый фильтр
Щипцы для флаконовFine Science Tools110006-15Длинные щипцы для переноса тканей в конические
, 2-го дня

Ссылки

  1. Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).
  2. Kollar, E. J., Lumsden, A. G. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
  3. Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
  4. Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp. Physiology & Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).
  5. Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).
  6. Luukko, K., Kettunen, P. Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A. Cell Adhesion & Migration. , 1-9 (2016).
  7. Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. Assay for neurite outgrowth quantification. BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).
  8. de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism. Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).
  9. Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices. Journal of Visualized Experiments. (102), e53114(2015).
  10. Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV. Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).
  11. Caroni, P. Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice. Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).
  12. Alić, I., et al. Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology. Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).
  13. Howroyd, P. C. Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. , (2019).
  14. Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons. Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).
  15. Liu, R., Lin, G., Xu, H. An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment. PLoS ONE. 8 (4), 60558(2013).
  16. Burry, R. W. Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures. Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).
  17. Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in molecular biology. 1656, Clifton, N.J. 229-251 (2017).
  18. Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).
  19. Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro. Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).
  20. Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).
  21. Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
  22. Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth. Scientific reports. 6, 31799(2016).
  23. Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in Physiology. 5, 326(2014).
  24. Miura, T., Yokokawa, R. Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices. Development, Growth & Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Клетки пульпы зубанейроны тройничного нервафильтр TranswellAdenovirus-Cre-GFPмышь Thy1-YFPконфокальная микроскопияиммунофлуоресцентное окрашиваниепротеомный анализ
Метод совместной культуры для изучения Нейрита Отток аурост в ответ на стоматологические целлюлозы Паракриновые сигналы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.