Методическая статья

Идентификация нейтрофилов Внеклеточных Ловушек в Параффина-embedded Feartline артериальных тромби с использованием иммунофлюоресценционной микроскопии

8.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60834

⸱

29 марта 2020 г.

 ,  ,  , 
1Veterinary Medical Teaching Hospital, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 2Department of Veterinary Surgical and Radiological Sciences, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 3Department of Veterinary Medicine and Epidemiology, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем метод выявления нейтрофилов внеклеточных ловушек (NETs) в формальдегид-фиксированной и парафина встроенных кошачьих кардиогенных артериальных тромбов с использованием тепло-индуцированного антигена поиска и двойной иммуномаркировки протокола.

Аннотация

Нейтрофил внеклеточных ловушек (NETs), состоящий из клеточной ДНК (cfDNA) и белков, как гистоны и нейтрофил эластаза (NE), высвобождаются нейтрофилов в ответ на системное воспаление или патогенов. Хотя ранее было показано, что NETs увеличивают образование тромбов и подавляют фибринолиз у людей и собак, роль NETs у кошек с кардиогенной артериальной тромбоэмболией (CATE), опасным для жизни осложнением, вторичным по отношению к гипертрофической кардиомиопатии , неизвестно. Стандартизированный метод для выявления и количественной оценки NET в кардиогенных артериальных тромбов у кошек будет способствовать нашему пониманию их патологической роли в CATE. Здесь мы описываем метод выявления NETs в формальдегид-фиксированной и парафина встроенных тромбо в аортальной бифуркации, извлеченные во время некропсии. После депарафинизации с ксиленом, аортальные секции прошли непрямой тепло-индуцированного антигена поиска. Разделы были затем заблокированы, permeabilized, и ex vivo NETs были определены путем coлокализации клеточной ДНК (cfDNA), цитруллинированный гистон H3 (citH3), и нейтрофил elastase (NE) с использованием иммунофлюоресценции микроскопии. Для оптимизации иммунообнаружения NETвов в тромби, аутофлуоресценция элементов ткани была ограничена с помощью процесса закалки аутофлюоресценции до микроскопии. Этот метод может быть полезным инструментом для изучения NETs и тромбоза в других видах и предлагает новые идеи в патофизиологии этого сложного состояния.

Введение

Кошки с гипертрофической кардиомиопатией подвергаются риску опасных для жизни тромбоэмболических осложнений1,,2. Несмотря на высокую заболеваемость и смертность, связанные с кошачьей кардиогенной тромбоэмболией (КАТЭ), лежащая в основе патофизиология CATE у кошек плохо понимается. Есть также ограниченные диагностические и терапевтические инструменты для лечения и выявления кошек, подверженных риску этого разрушительного состояния3.

В дополнение к своей роли в врожденном иммунитете, нейтрофилы, как было показано, играют роль в тромбозе, выпустив нейтрофил внеклеточных ловушек (NETs), которые веб-подобных сетей клеточной ДНК (cfDNA) инкрустированы гистонами и гранулированных белков, как нейтрофил эластазы (NE) и миелопероксиды. Нейтрофилы проходят образование NET в ответ на системное воспаление, прямое столкновение с патогенными микроорганизмами, а также взаимодействие с активированными тромбоцитами4,,55,6,,7. У собак днк, полученная из нейтрофилов, подавляет лизис тромбов, в то время как протеины NET ускоряют образование тромбов. Способность NETs улавливать циркулирующие клетки и компоненты коагуляции также является ключом к их тромбогенным свойствам8,,9,,10,,11,,12.

NET обнаруживаются путем колокализации внеклеточных нейтрофильных белков, гистонов и cfDNA. Из-за этого, выявление и количественное определение NETs в фиксированных тканях иммунофлуоресценции депарафинизированных тканей превосходит традиционные гематоксилин и эозин (H и E) пятно с использованием яркой микроскопии поля4,5. Несколько человеческих исследований с использованием иммунофлуоресценционной микроскопии определили NETs как структурные компоненты коронарных артериальных тромбов, тромбов мозгового инсульта, атеротромбоза и венозной тромбы13,14,16,,17.17 На сегодняшний день не описан стандартизированный метод выявления и количественной оценки NET в кошачьих тромби. Поскольку выявление NET s в кошачьих кардиогенных артериальных тромбов может облегчить будущие трансляционные исследования в NETs и тромбоз, мы описываем методы net идентификации и оценки в парафинавстроенных артериальных тромбов у кошек.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все описанные здесь методы были выполнены в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и использованию в Калифорнийском университете в Дэвисе. Некропсии и биопсии тканей проводились с согласия владельцев.

1. Фиксация тканей, встраивание и секция

  1. Рассекать аортальные бифуркации, в том числе нисходящей аорты, бедренной артерии, и общие подвздошные артерии (Рисунок 1A), вскоре после гуманной эвтаназии или смерти. Блант вскрыть фасции(рисунок 1B) до погружения его полностью в 10% нейтрально-буферизированных формалин для как минимум 24 ч и не более 48 ч.
  2. Чтобы обезвоживать образец, сначала погрузите в 10% нейтрально-буферизированный формалин, нагретый до 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч. Затем погружайся в возрастающие концентрации этанола, нагреваемого до 37 градусов по Цельсию (70%, 95%, 100%) 2x на 1 ч каждый. Наконец, без промывки, погрузите 2x в 100% толуол нагретый до 37 градусов по Цельсию на 1 ч каждый.
  3. Добавьте парафин с подогревом до 62 градусов по Цельсию и дайте парафину полностью затвердеть на ночь.
  4. Раздел 2-3 мкм парафина-встроенных тканей с использованием микротома и место на положительно заряженных стеклянных слайдов. Храните секционные ткани при -80 градусах по Цельсию до дальнейшего анализа.

2. Депараффинизация, регидратация и извлечение антигена, индуцированного в теплом,

  1. Для выполнения депарафинизации и регидратации секций на стеклянных слайдах, поместите стеклянные горки в стеллажи и процесс в следующем порядке:
    1. Полностью погрузите в 100% ксилена в течение 3 мин. Повторите этот шаг 2x. Не смягчить между шагами.
    2. Погружение полностью в снижение концентрации этанола (100%, 95%, 70%) при комнатной температуре (RT), 3x на 3 мин каждый. Не смягчить между шагами.
    3. Погрузите полностью в деионизированную воду в течение 2 мин. Повторите.
  2. Поместите разделы в Tris-буферированный солен с 0,1% Tween (TBST, рН 7,6) в течение 2-3 мин.
  3. Заполните резервуар деионизированной водой, нагретой до 100 градусов по Цельсию. Дайте пароходу уравновесить 20 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тепло-индуцированный антиген поиска лучше всего выполняется с косвенным нагрева, генерируемых пароходом с предустановленной температуры настройки, такие как пищевой пароход.
  4. Нагрейте коммерчески доступный раствор извлечения антигена, содержащий Tris и EDTA (pH No 9) до 95-97 градусов по Цельсию на контролируемой температурой горячей пластине с постоянным перемешиванием. Убедитесь, что он не кипит.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор должен стать облачным, как только он нагревается.
  5. Налейте нагретый раствор извлечения антигена в слайд-контейнер и поместите контейнер в камеру парохода. Разрешить антигена извлечения раствор уравновесить до температуры парохода в течение 3-4 мин. Убедитесь, что температура камеры составляет 95 градусов по Цельсию.
  6. Погрузите горки полностью в нагретый антиген извлечения раствора и продолжить применение внешнего нагрева через пароход в течение 20 минут.
  7. Снимите слайд-контейнер с парохода и дайте слайдам и раствору поиска антигена охладиться до RT. Храните разбавленный антиген поисковый раствор при 4 градусах Цельсия и при необходимости повторно используйте до 2x.
  8. Вымойте слайды 3x с TBST в течение 5 минут.

3. Закалка иммуномаркировки и аутофлуоресценции

ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 1 подробно описывается состав блокирующих буферов, используемых в следующих шагах.

  1. Инкубировать разделы в Блокирование буфера 1 для 2 ч на RT под нежным качания (30-50 об /1/ т. д.). Печать с парафина пленки, чтобы избежать сушки.
  2. Без мытья, немедленно применять 100 л разбавленного кролика поликлонального античеловеческого цитруллинированного гистонhtone H3 (citH3) антитела (0,03 мг/мл разбавленных в блокирующем буфере 1) непосредственно на слайд.
  3. Поместите крышку (24 мм х 40 мм х 0,13-0,17 мм) на каждом участке, чтобы позволить равномерное распределение смеси антител.
  4. Инкубировать 12-16 ч при 4 градусах Цельсия с нежным раскачиванием (30-50 об/мин). Печать с парафильмом пленки, чтобы избежать сушки.
  5. Вымойте 3x с TBST в течение 5 мин.
  6. Применить 100 зл козы анти-кролик антитела спряженные Alexa Fluor 488 (разбавленный до конечной концентрации 0,04 мг/мл или 1:50 в блокирование буфера 1), как описано в шаге 3.3. Инкубировать 1 ч на RT под нежным раскачиванием (30-50 об/мин). Защитите слайды от света.
  7. Вымойте tBST 3x в течение 5 мин.
  8. Инкубировать разделы в Блокирование буфера 2 ночь на 4 кВ под нежным качания (30-50 об /ч). Защитите от света.
  9. Вымойте tBST 3x в течение 5 мин.
  10. Блок разделов в Блокирование буфер амп 3, как описано в шаге 3.3 на RT для 2 ч под нежным качания (30-50 об / мин).
  11. Инкубировать разделы с биотинилатами поликлональных антитела NE кролика кролика (окончательная концентрация 0,2 мкг/мл в Блокирующий буфер 3) при 4 КК для 12-16 ч, как описано в шагах 3,2-3,4.
  12. Вымойте tBST 3x в течение 5 мин.
  13. Инкубировать с Alexa Fluor 594 стрептавидин конъюгировать (разбавить до 1:100 или 0,02 мг/мл в блокирующий буфер 3), как описано в шагах 3.2-3.3 для 1 ч на RT. Защитите от света и печать с парафином для предотвращения сушки.
  14. Вымойте tBST 1x в течение 5 мин.
  15. Нанесите 100 л раствора автофлюоресценции непосредственно на секции в течение 1 мин в соответствии с инструкциями производителя.
  16. Немедленно мыть слайды с TBST 6x в течение 10 минут.
  17. Обложка каждого слайда с 100 злиц 300 нм DAPI в течение 5 минут в темноте.
  18. Вымойте с TBST в течение 3 мин. Повторите это в общей сложности 5x.
  19. Нанесите каплю (50 евро) антифадейской среды крепления, часть комплекта самоуточения автофлюоресценции, прямо на стеклянную горку, окружающую секцию. Поместите крышку (24 мм х 40 мм х 0,13-0,17 мм) осторожно на секцию, не создавая пузырьков.
  20. Разрешить образцы для лечения на ночь в темноте при 4 градусах Цельсия, пока монтаж наяней не затвердеет для микроскопического анализа с линзами погружения.

4. Идентификация нейтрофилов внеклеточной ловушки

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол использует перевернутый эпифлюоресцентный микроскоп с цифровой камерой CCD 1280 x 960 (см. Таблица материалов).

  1. Чтобы найти тромби, скан черепно-сканно каудально по длине аорты, аортальной бифуркации, и каждая бедренная артерия с помощью фазовой контрастной микроскопии с целью 10x. Тромб представляет собой конгломерат тканей, содержащих эритроциты, белые кровяные тельца и тромбоциты, прилегающие к эндотелию на фазовом контрасте и яркой полевой микроскопии(рисунок 2A, Рисунок 2B).
  2. Первый изучить разделы для NETs с использованием канала DAPI (возбуждение 357/44 нм) с 10x и 20x целей(рисунок 2C). Обратите внимание, что cfDNA появляется как деконденсированная ДНК, которая не находится в пределах цитоплазмы клетки, когда его видят на фазовом контрасте или яркой полевой микроскопии.
  3. Определите внеклеточный NE и citH3 на Техасских красных каналах (возбуждение 585/29 нм, эмиссия 628/32 нм) и зеленый флуоресцентный протеиновый канал (возбуждение 470/22 нм, эмиссия 525/50 нм), соответственно, с 10, 20 и 40x целями.
  4. Оценить и проанализировать NET s внутри thrombus используя имеющееся програмное обеспечение, such as Изображение J (NIH). NET образование определяется на основе колокализации cfDNA, внеклеточного citH3, и NE, как ранее описано18. Поддержание последовательного времени экспозиции и выгоды каждого канала на протяжении всего приобретения изображений, чтобы избежать насыщения в интенсивности пикселей.
  5. Карта каждого тромба на основе его близости к нисходящей аорты, разделив его на три равные зоны, с зоной 1 ближе к аорте, Зона 3 дальше от аорты, и Зона 2 между зонами 1 и 3). С оператором ослепленным к медицинскому состоянию каждого предмета, примите по крайней мере 10 случайных полей в каждой зоне. Характеризуйте распределение NET в тромби путем усреднения количества полей с NET в каждой зоне или расчета средней зоны, занимающей NET в каждой зоне.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя этот протокол для депарафинизации, теплового антигена поиска, и двойной иммуномаркировки парафина встроенных тромбов, мы определили NETs в кошачьих CATE в первый раз. Тромби в аортальной бифуркации были обнаружены флуоресценцией микроскопии и яркой полевой микроскопией с использованием стандартных h и E окрашивания и фазовой контрастной микроскопии. На яркой полевой микроскопии кошачий артериальный тромби состоял из красных кровяных телец, лейкоцитов, фибрина и тромбоцитов(рисунок 3А).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы описываем протокол для выявления NETs в фиксированной кошачьей кардиогенных тромбов с помощью двойного протокола иммуномаркировки и иммунофлуоресценции микроскопии. Хотя только кардиогенные артериальные тромбы были окрашены, в теории этот протокол может быть использован для других видов тромбов и в других ветеринарных видов. Идентификация NETs в кошачьих артериальных тромби предполагает, что NETs может играть определенную роль в тромбозе у кошек.

Обнаружение NETs иммунофлуоресценции в фикси...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Исследование было поддержано фондами Калифорнийского университета в Дэвисе, Центра здоровья животных (CCAH 2018-30-F). Авторы хотели бы отметить д-р Кевин Вулард для использования флуоресценции микроскопа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4,6-диамидино-2-фенилин (DAPI)Life Technologies CorporationD1306
Alexa Fluor 594 Стрептавидина конъюгатThermoFisher ScientificCatalog # S11227
Антицитруллинированный гистон H3 антителоAbcamAb5103
EVOS FL Система визуализации клетокThermoFisher ScientificAMEFC4300
EVOS Imaging Системный объектив 10xThermoFisher ScientificAMEP4681NA 0.25, WD 6.9/7.45 мм
Объектив для системы визуализации EVOS 20xThermoFisher ScientificAMEP4682NA 0.40, WD 6.8 мм
Объектив для системы визуализации EVOS 40xThermoFisher ScientificAMEP4699NA 0.75, WD 0.72 мм
Козий антикролик Alexa Fluor 488 антителоThermoFisher ScientificCatalog # A32723
Козья сывороткаJackson Immuno Research LabsКаталог # NC9660079. Часть производителя # 005-000-121
Антитела к нейтрофильной эластазеBioss АнтителаBs-6982R-BiotinКролик поликлональные антитела, биотин конъюгированный
NP40ПирсПродукт # 28324. Лот # EJ64292
Позитивно заряженные предметные стекла микроскопаThomas ScientificПроизводитель No 1354W-72
Сыворотка кроликаLife TechnologyКаталог # 10510
Решение для поиска мишениAgilent DakoS2367TRIS/EDTA, pH 9 (10x)
TrueVIEW Набор для гашения автофлуоресценцииVector LaboratoriesSP-8400

Ссылки

  1. Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, Suppl 1 6-9 (2015).
  2. Payne, J. R., et al. Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).
  3. Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012. Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).
  4. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
  5. Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review. Veterinary Pathology. , 300985819861721(2019).
  6. de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H & E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
  7. Li, R., Tablin, F. A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis. Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).
  8. Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).
  9. Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis. Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).
  10. Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nature Communications. 10 (1), 1322(2019).
  11. Li, B., et al. Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).
  12. Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58083(2018).
  13. de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
  14. Farkas, ÁZ., et al. Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases. Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).
  15. Qi, H., Yang, S., Zhang, L. Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis. Frontiers in Immunology. 8, 928(2017).
  16. Laridan, E., et al. Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi. Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).
  17. Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
  18. Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy. BMC Veterinary Research. 14 (1), 210(2018).
  19. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513(2016).
  20. Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation. Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).
  21. Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).
  22. Willingham, M. C. An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).
  23. Davis, A. S., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).
  24. Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).
  25. Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).
  26. Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
  27. Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method. Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).
  28. Ducroux, C., et al. Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

H3

Похожие статьи