Method Article

Эффективная дифференциация постгонглионических симпатических нейронов с использованием человеческих плюрипотентных стволовых клеток в соответствии с безкормовыми и химически определенными условиями культуры

DOI:

10.3791/60843

⸱

May 24th, 2020

 , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе мы описываем стабильную, высокоэффективную стратегию дифференциации для генерации постганглионических симпатических нейронов из человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Эта модель сделает нейроны доступными для использования исследований множественных вегетативных расстройств.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Плюрипотентные стволовые клетки человека (HPSCs) стали мощным инструментом для моделирования заболеваний и изучения эмбрионального развития человека в пробирке. Ранее мы представили протокол дифференциации для производности вегетативных нейронов с симпатическим характером, который был применен к пациентам с вегетативной невропатией. Тем не менее, протокол был построен на Knock Out Сыворотки Замена (KSR) и фидер основе условий культуры, и для обеспечения высокой эффективности дифференциации, сортировка клеток была необходима. Эти факторы вызывают высокую изменчивость, высокую стоимость и низкую воспроизводимость. Кроме того, не были проверены зрелые симпатические свойства, в ключая электрическая активность. Здесь мы представляем оптимизированный протокол, в котором культура и дифференциация PSC выполняются в условиях культуры, свободной от фидера и химически определенных. Идентифицированы генетические маркеры, идентифицирующие нервный гребень ствола. Дальнейшая дифференциация на постгнилионические симпатические нейроны достигается через 20 дней без необходимости сортировки клеток. Электрофизиологическая запись дополнительно показывает функциональную идентичность нейронов. Стрельба, обнаруженная у наших дифференцированных нейронов, может быть усилена никотином и подавлена атранергическим антагонистом-антагонистом. Промежуточные симпатические нейронные прародители в этом протоколе могут быть сохранены в качестве нейронных сфероидов на срок до 2 недель, что позволяет расширить культуры. В целом, наш обновленный протокол дифференциации нейронов показывает высокую эффективность дифференциации, лучшую воспроизводимость, большую гибкость и лучшее созревание нейронов по сравнению с предыдущей версией. Этот протокол предоставит исследователям клетки, необходимые для изучения человеческих расстройств, которые влияют на вегетативную нервную систему.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Постганглионические симпатические нейроны (симны) принадлежат к вегетативной нервной системе (ANS) и играют несколько важных ролей в реагировании и регулировании гомеостаза тела, независимого от сознания. Например, стресс стимулирует симны и вызывает ответ на борьбу или полет, что приводит к увеличению частоты сердечных приступов, артериального давления и потоотделения. Символы страдают от множественных расстройств человека из-за генетики, токсичности / травмы, или в качестве компаньонов к другим заболеваниям. Примером генетической невропатии является детское расстройство семейной дисавтотомии (FD), где тяжелая дисрегуляция симн вызывает дистостентомический кризис, очевидный потливость, пятно кожи, рвота приступы, гипертония, и тревога1. Примером токсичности является химиотерапия, которая, как сообщается, имеют токсические побочные эффекты на вегетативные нейроны2. Известно, что вегетативная денервация и гипериннервация могут привести к или сопровождать такие заболевания, как болезнь Паркинсона или гипертоническая почечная болезнь3,4. Таким образом, возможность проводить исследования и понимать механизмы симН биологии и дефектов в контексте болезни полезно для поиска новых и эффективных методов лечения.

Анатомии
Периферическая нервная система ветвится в сенсорные и вегетативные деления. Афферентные нервы сенсорной нервной системы отвечают за ощущение боли и прикосновения, в то время как ANS отвечает за передачу информации из всех органов в мозг. АНС делится на кишечную нервную систему, иннерватирующую желудочно-кишечный тракт, парасимпатическую нервную систему, что важно для расслабления, и симпатическую нервную систему (СНС), что важно для активации/регулирования органов. SNS адаптирует двухнейронную систему5. Преганглионические симпатические нейронные аксоны в спинном мозге сначала проект симпатической ганглиев, где postganglionic симН клеточные тела расположены. Эти нейроны затем отправить длинные прогнозы для innervate целевых тканей каждого органа в организме. Сигналы, передаваемые преганглионическими нейронами, являются холинергическими, в то время как постганглионические симнявляются являются адренергическими и, таким образом, выражают норадреналин (NE) в качестве основного нейромедиатора. Есть несколько заметных исключений постгонглионических, симпатических нейронов, которые холинергических, в том числе те, иннервируя кровеносные сосуды. Adrenergic postganglionic нейроны выражают ферменты тирозин гидроксилаза (TH), ароматические L-аминокислоты декарбоксилаза (AAAD), допамина - гидроксилаза (DBH), и моноамин оксидаза (МАО-А), все отвечает за генерацию и метаболизацию NE. Кроме того, они выражают NE рециркуляции транспортеров и / или рецепторов - adrenergic рецепторов (ADRA2), к-адренергический рецептор (ADR2B), норадреналин транспортер (NET1), и везикулярный моноамин транспортер (VMAT1/2).

Развития
Во время эмбрионального развития симны являются производными от нервного гребня (NC), который возникает между нервной трубки и наложения эктодерм6, и может дифференцировать в нескольких клеточных линий, в том числе меланоцитов, остеобластов, адипоцитов, глия, энтерические нейроны, сенсорные нейроны, и вегетативые нейроны7. Нейронные клетки гребня (NCCs) высоки мигрирующие клетки которые принимают несколько путей через зародыш. На этой ранней стадии развития NC, клетки выражают маркеры SNAIL1'2, FOXD3, и SOX108,,9,,10,11. Маршрут миграции вместе с их осевым местоположением определяет подтип NC, в который они будут развиваться. Эти подтипы NC можно отличить по их специфической экспрессии генов HOX: крякные NCCs не выражают гены HOX, неисправные NCCs выражают HOX 1-5, хоботные NCCs выражают HOX 6-9, и сакральные NCCs выражают HOX 10-1112. Среди них магистральные НКК признаны основным источником симнов. Предшественники SymN выражают транскрипционный фактор MASH1/ASCL113, который способствует выражению PHOX2B14 и INSM115. Семейство транскрипционных факторов GATA выражается во время позднего сочувственного развития. GATA2 и GATA3 выражены в симнях, которые, в свою очередь, активируют DBH16. Коэффициент транскрипции HAND2 также важен для выражения и поддержания DBH и TH17.

HPSCs (например, эмбриональные и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки) являются мощным инструментом18 для повторения парадигм развития и создания симнов, которые затем могут быть использованы для моделирования заболеваний различных человеческих расстройств. Таким образом, создавая симнизмы из HPSC, крайне важно следовать руководящим принципам развития и оценивать выражение соответствующих маркеров в процессе дифференциации.

Предыдущий протокол symN
Немногие исследовательские группы ранее сообщали о генерации симнов из hPSCs19,,20,,21. Прямое сравнение этих протоколов друг с другом и нашими был рассмотрен недавно22. В 2016 году23, мы опубликовали протокол дифференциации для поколения вегетативных нейронов с символом symN(рисунок 1A). В этом протоколе использовалась среда на основе КСР, которая использовалась как в поддержании недифференцированных hPSCs, так и в дифференциации клеток. Кроме того, hPSCs были сохранены на мыши эмбриональных фибробластов (MEF фибробластов). Мы использовали этот протокол и PSCs от пациентов с FD для моделирования расстройства23. В 2019 году мы описали более подробную версию этого старогопротокола 24. Таким образом, нервная судьба была вызвана двойным ингибированием SMAD25, чтобы блокировать TGF-я и BMP сигнализации в первые 2 дня. Активация WNT с использованием CHIR99021 способствовала нейронных прародителей, чтобы стать nc-клетками. На 11-й день, клетки были отсортированы FACS для CD49D+ или SOX10- популяций26,23, что дало около 40% NC эффективности генерации. Таким образом, сортировка была необходима для обеспечения эффективности и чистоты для следующих шагов дифференциации. NCCs были сохранены и усилены как сфероиды с комбинированным лечением FGF2 и CHIR. После 4 дней, NC сфероидов обслуживания были покрыты и с учетом BDNF, GDNF, и NGF, чтобы закончить созревание symN. Хотя эти символы выразили сильные символы, такие как ASCL1, TH, DBH и PHOX2A, маркеры для более зрелых симнов, включая выражение никотинового ацетилхолина (CHRNA3/CHRNB4) и везикальный транспортер (VMAT1/2), были низкими даже после 70 дней дифференциации. Гены HOX в этом протоколе не были официально протестированы, а зрелые нервные свойства, включая электрофизиологическую активность клеток, не были проверены.

Здесь мы представляем оптимизированный протокол для генерации симнов(рисунок 1B). HPSCs поддерживаются в условиях фидер-бесплатно, на витронектин (VTN) покрытием блюда, используя Основные 8 (E8) СМИ27. Формула дифференциации средств массовой информации была изменена на каждом этапе, тем самым увеличивая процент населения NC28. Созревание symN может быть выполнено на+CD49D /SOX10- отсортированных или несортированных популяциях NCC. Оба показывают высокий уровень выражения маркера symN к 30-му дню. Кроме того, симны, генерируемые с помощью этого протокола, реагируют на электрофизиологическую запись и на лечение симН-активатором и ингибиторными соединениями.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: H9 PHOX2B: GFP репортер линия была предоставлена Oh et al.19. Некоторые праймеры qPCR, используемые в этой работе, были получены от OriGene Technologies, в то время как несколько последовательностей получены из Frith et al.20,30.

1. Настройка для посуды, подготовки средств массовой информации и обслуживания hPSC

  1. Блюдо покрытие
    1. Покрытие витронектина (ВТН)
      1. Поместите флаконы VTN в воду 37 градусов по Цельсию до полного размораживания, а затем тщательно перемешайте.
      2. Для 100 мм Петри блюдо, смешать 7 мл 1x фосфат буферного соления (PBS) с 0,5 мг/мл VTN, добавить раствор VTN к блюду, и инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 1 ч.
    2. Подвал мембранного матричного покрытия
      1. Оттепель флаконы подвала мембранной матрицы (см. Таблица материалов) на льду при 4 градусах Цельсия в одночасье.
      2. Для одной скважины из 6 хорошо пластины, смешать 2 мл DMEM / F12 с 20 зл 100x подвал мембранной матрицы, добавить подвальные мембраны маминтарии раствор блюдо, оберните блюдо с парафина пленкой, и хранить в чистом контейнере на 4 кв к в одночасье. Работайте как можно быстрее. Помятые блюда можно хранить в 4 градусах Цельсия в течение 2 недель.
    3. Полиорнитин (PO)/ламинин (LM)/фибронектин (FN) покрытие
      1. В первый день, для одного колодца из 24 хорошо пластины, смешать 15 мкг /мл PO с 1 мл 1x PBS, инкубировать при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 ночь. Оттепель как LM и FN на -20 градусов по Цельсию на ночь и хранить при 4 градусах Цельсия до полного оттаять.
      2. На второй день, аспиратpo PO решение, мыть скважины 2x с 1x PBS, добавить 1 мл 1x PBS, содержащий 2 мкг/мл LM и 2 мкг/мл FN и инкубировать при 37 градусах По в 5% CO2 ночь. На данный момент блюдо с раствором LM/FN можно хранить в инкубаторе в течение нескольких месяцев, пока оно не высохнет. Добавьте больше 1x PBS для того чтобы предотвратить тарелку от высыхания вне.
  2. Подготовка средств массовой информации
    1. Подготовка Основные 8 средних (E8) путем оттаивания одной бутылки E8 дополнения на 4 КС в одночасье. Смешайте дополнение с 500 мл E8 средних и антибиотиков, если это необходимо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Работа E8 решение должно быть использовано в течение 2 недель.
    2. Подготовьте замораживающую среду hPSC, смешивая 90 мл полной среды E8 с 10 мл DMSO общим объемом 100 мл. Фильтр стерилизовать.
    3. Подготовьте среду дифференциации от 0 до дня 1, смешав 100 мл основного 6 (E6) носителя с 10 мкм SB431542, 1 нг/мл BMP4, 300 нМ CHIR99021 и 10 мкм Y27632 при общем объеме 100 мл.
    4. Подготовьте день 2 к дню 10 дифференциации среды путем смешивания 100 мл E6 среды с 10 мкм SB и 0,75 мкм CHIR99021 для общего объема 100 мл.
    5. Подготовьте день 10 к дню 14 сфероидной среды путем смешивания нейробазальной среды с 2 мл B27 (50x), 1 мл N2 (100x), 2 мМ L-глутамата, 3 мкм CHIR99021, и 10 нг/мл FGF2 для общего объема 100 мл.
    6. Подготовка день 14 на день 28 средних для сфероидов долгосрочного обслуживания, добавив 0,5 мкм свежего РА в день 10 на день 14 сфероидных среды для каждого кормления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите РА при -80 градусах по Цельсию.
    7. Подготовка среды созревания SymN путем смешивания нейробазальной среды с 2 мл B27 (50x), 1 мл N2 (100x), 2 мМ L-глутамат, 25 нг/мл GDNF, 25 нг/мл BDNF, 25 нг/мл NGF, 200 мкм аскорбиновой кислоты, и 0,2 мм dbcAMP для общего объема 100 мл. Раствор следует использовать в течение 2 недель. Перед каждым кормлением добавьте 0,125 мкм свежего РА. Это решение используется с 14-го дня (вариант 1) или 28-го дня (вариант 2).
    8. Подготовьте буфер FACS, смешивая DMEM с 2% FBS, 2 мМ L-глютамат и антибиотики, если это необходимо для общего объема 100 мл.
  3. hPSC техническое обслуживание
    1. Таяние и хранение hPSCs
      1. Приготовьте одну тарелку с покрытием VTN с покрытием 100 мм.
      2. Чтобы разморозить флакон hPSCs непосредственно из жидкого азота, положить флакон в воду 37 градусов, тщательно размахивая трубки в воде, пока он не оттаивает. Перенесите оттаять hPSCs на трубку 15 мл, содержащую 10 мл 1x PBS, и центрифугу на 200 х г в течение 4 мин.
      3. Отбросьте супернатант и добавьте 1 мл среды E8 в трубку. Pipette несколько раз, чтобы полностью приостановить гранулы, а затем добавить еще 9 мл E8 среды для достижения 10 мл общей сложности.
      4. Аспирируйте раствор VTN из 100-мм блюда.
      5. Перенесите hPSCs на 100-мм блюдо, осторожно встряхните (вверх и влево-вправо, а не по кругу), чтобы убедиться, что клетки равномерно распределены в блюде
      6. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, в 5% CO2.
      7. На следующий день, аспирировать все средние и корма с 10 мл E8.
      8. Кормите таким образом каждый день в течение следующих 3-4 дней, а затем подготовиться к расколу.
    2. Разделение hPSCs
      ПРИМЕЧАНИЕ: hPSCs в точке расщепления должно быть 80%-90% слияния. Следует наблюдать большие колонии с гладкими и яркими краями. Тем не менее, контакт между каждой колонией следует избегать(рисунок 2B, день 0 и рисунок 6B).
      1. Приготовьте посуду с покрытием VTN на 100 мм по мере необходимости.
      2. Аспирировать E8 и мыть блюдо, которое должно быть разделено 1x с 1x PBS.
      3. Аспирировать 1x PBS и добавить 4 мл 0,25 М EDTA. Инкубировать в течение 2 мин при 37 градусах Цельсия, 5% CO2.
        ПРИМЕЧАНИЕ: HPSCs должны быть разделены / replated как небольшие колонии. Не лечите ЭДТА дольше 2 мин, чтобы предотвратить разделение на одиночные клетки. Клетки должны быть по-прежнему прикреплены к поверхности блюда после 2 мин лечения.
      4. Аспирировать EDTA, отсоединить колонии, сильно pipetting 10 мл E8 среды на поверхности тарелки, и собрать все средние и клетки в 15 мл трубки.
      5. С hPSCs на 80%-90% стопроцентной, разделить колонии 1:15-1:20. Например, чтобы разделить hPSCs на 1:20 на одну тарелку 100 мм, возьмите 500 л раствора E8/hPSCs и смешайте с 9,5 мл свежей среды E8.
      6. Плита hPSCs в VTN покрытием 100 мм блюд.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется установить идеальное соотношение сплит для каждого исследователя и клеточной линии самостоятельно.
    3. Замораживание hPSCs
      1. Для одной 100-мм тарелки hPSCs, которая готова к разделению, приготовьте три криовиала и 3,5 мл замораживания среды.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Средства массовой информации и флаконы должны храниться в 4 градусах Цельсия или на льду до использования.
      2. Аспир E8 и мыть блюдо 2x с 1x PBS.
      3. Аспир 1x PBS и добавить 4 мл 0,25 М EDTA, инкубировать в течение 2 мин при 37 кв с, в 5% CO2.
        ПРИМЕЧАНИЕ: hPSCs должны быть заморожены, как небольшие колонии в то время, что они будут разделены. Не лечите клетки с ЭДТА дольше, чем 2 мин, чтобы предотвратить разделение на одиночные клетки. Клетки должны быть по-прежнему прилагается на поверхности блюда после 2 мин лечения.
      4. Аспирируйте ЭДТА, отсоединяйте колонии, сильно протянив 10 мл 1x PBS на поверхности блюда, и соберите все средние и клетки в трубке 50 мл.
      5. Добавьте 20 мл 1x PBS и центрифугу на 200 x g в течение 4 минут, чтобы промыть оставшиеся ЭДТА.
      6. Откажитесь от супернатанта и отрепретите гранулы в 3 мл замораживания среды.
      7. Равномерно распределите hPSCs на три криовиала, по 1 мл каждый.
      8. Хранить при -80 градусов на ночь в контролируемой коробке для замораживания или сэндвиче из пенополистирола, чтобы обеспечить медленное падение температуры, а затем перенести в резервуар с жидким азотом для длительного хранения.

2. Посев hPSCs, чтобы начать дифференциацию (день 0)

ПРИМЕЧАНИЕ: hPSCs должны быть готовы к дифференциации после стабилизации (т.е. быть разделенным 2-3x после оттаивания). Убедитесь, что колонии здоровы, с гладкими, блестящими краями и минимальной дифференциацией(рисунок 2B).

  1. Приготовьте помемную мембранную матричную посуду (24 хорошо или 6 хорошо посуды) за день до дня 0 по мере необходимости. Принесите посуду на RT в начале дифференциации.
  2. Сделать день 0-1 дифференциации среды по мере необходимости.
  3. Аспирировать E8 от слияния, готовы разделить hPCSs, и мыть блюдо 2x с 1x PBS.
  4. Добавить 7 мл 0,25 М EDTA на 100 мм блюдо, инкубировать при 37 кв С, 5% CO2, в течение 15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, лечение ЭДТА затягивается, чтобы разойтись в одиночные клетки.
  5. Снисшие все hPSCs (они должны быть плавающими) и перенесите на трубку 50 мл. Добавьте такое же количество или больше 1x PBS как разрешение EDTA для того чтобы разбавить вне EDTA.
  6. Центрифуга при 200 х г в течение 4 мин.
  7. Откажитесь от супернатанта, добавьте 1 мл дня 0-1 дифференциации среды и пипетки для гомогенизации клеток. Следуйте, добавив больше среднего, а затем смешать, чтобы разбавить клеточный раствор в концентрации идеально подходит для подсчета клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не разбавляйте клеточный раствор. Клетки из одной полной 100-мм тарелки следует разбавлять в 5 мл среднего для начала.
  8. Подсчитайте номер ячейки с помощью автоматизированного счетчика клеток или гемоситометра.
  9. Разбавить клеточный раствор по мере необходимости для достижения 125000 клеток / см2 в низком окончательном объеме (например, 2 мл на хорошо для 6 хорошо блюдо или 500 л на хорошо для 24 хорошо блюдо).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Низкий объем помогает клеткам прикрепляться быстрее.
  10. Аспирируй весь мембранный матримный раствор из посуды с покрытием и натарелки клеточном раствором в колодцы.
  11. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, в 5% CO2.

3. Нейронная индукция клеток гребня (день 1 к дню 10, Рисунок 2A)

  1. На 1 день кормите клетки со средним дифференциацией 0-1 (3 мл на скважину для 6 хорошо посуды и 1 мл на скважину для 24 хорошо посуды).
  2. На 2-й день кормят клетки 2-дневным 10 дифференциацией (3 мл на колодец для 6 хорошо посуды и 1 мл на скважину для 24 хорошо посуды).
  3. Отныне клетки следует кормить через день до 10-го дня (т.е. следующий день кормления будет 4-м днем).
    ПРИМЕЧАНИЕ: С 6-го дня, NC хребты должны быть обнаружены(рисунок 2B). Чтобы проверить, происходит ли дифференциация, рекомендуется проводить параллельную культуру дифференциации в небольших скважинах (т.е. 24 скважин), которые могут быть окрашены для SOX10/AP2a и использованы для экспрессии генов маркера во время дифференциации(рисунок 2B,C).
  4. Если сортировка ячеек, перейдите к разделу 4. В противном случае перейдите к разделу 5.

4. Флуоресценция активированная сортировка клеток (FACS) для нейро-маркера гребня CD49D и агрегирования NC-клеток в сфероидах

ПРИМЕЧАНИЕ: Для сортировки FACS образцы должны храниться на льду и не подвергаться воздействию света после окрашивания до сортировки.

  1. Подготовьте буфер FACS, если ячейки сортируются.
  2. Подготовка день 10-14 сфероидной среде.
  3. На 10 день, удалить среду, и мыть 1x с 1x PBS.
  4. Добавить диссоциационный раствор (см. Таблицу Материалов)по 2 мл на хорошо для 6 хорошо блюдо или 1 мл в хорошо для 24 хорошо блюдо, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 в течение 20 мин.
  5. Снимите все hPSCs и перенесите на трубку 50 мл.
  6. Заполните остальную часть трубки с FACS буфера и центрифуги на 200 х г в течение 4 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая трубка 50 мл может вместить до 20 мл или менее клеточного раствора. Объем буфера FACS должен быть достаточно высоким, чтобы нейтрализовать решение диссоциации.
  7. Откажитесь от супернатанта, отрептите клетки с соответствующим количеством буфера FACS (2 мл на скважину из 6 скважинной пластины) и подсчитайте, чтобы определить число клеток.
  8. Подготовьте следующие образцы.
    1. Образец 1 (неокрашенный контроль): 1 х 106 ячеек в 400 л буфера FACS. Фильтр клетки через 20 мкм крышка ситечко и держать трубку на льду.
    2. Образец 2 (DAPI только контроль): 1 х 106 ячеек в 400 л буфера FACS, содержащий 0,5 мкг/мл DAPI. Фильтр клетки через трубку FACS с крышкой ситечко и держать трубку на льду.
    3. Образец 3 (CD49d-маркирован): Приостановить остальные клетки с FACS буфер, содержащий PE / Cy7-конъюгированных CD49D антитела (5 qL для 1 х 106 ячеек на 100 л буфера FACS) в 15 мл трубки и инкубировать на льду в течение 20 минут.
  9. Заполните трубки с FACS буфера и центрифуги на 200 х г в течение 4 мин.
  10. Откажитесь от супернатанта и отбросьте каждые 5-10 х 106 ячеек в 1 мл буфера FACS, содержащего 0,5 мкг/мл DAPI в соответствии с инструкциями производителя.
  11. Фильтр клетки через трубку FACS с крышкой ситечко и держать трубку на льду.
  12. Подготовьте коллекционные трубки FACS, содержащие 2 мл буфера FACS.
  13. Сортируйте машину FACS с лазерами, которые могут обнаружить DAPI и PE-Cy7, чтобы изолироватьпопуляцию CD49D.
  14. После сортировки подсчитайте отсортированные ячейки.
  15. Centrifuge все отсортированные клетки и resuspend в день 10-14 сфероидной среде до окончательной концентрации 0,5 х 106 клеток на 500 qL среды.
  16. Плита 0,5 х 106 ячеек на хорошо в ультра-низких вложений 24 хорошо пластин.
  17. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия, в 5% CO2.

5. Агрегирование NC-клеток в сфероидах

  1. Если не использовать FACS для изоляции NC-клеток и вместо их агрегирования в сфероиды напрямую, сначала подготовьте клетки, как описано в шагах 4.2-4.5.
  2. Заполните остальную часть трубки с 1x PBS, и центрифуга на 200 х г в течение 4 мин.
  3. Откажитесь от супернатанта, resuspend клетки с соответствующим количеством день 10-14 сфероидной среде (например, 2 мл среднего для 6 хорошо пластины), и рассчитывать, чтобы определить номер клетки.
  4. Разбавить клетки в день 10-14 сфероидной среды до 0,5 х 106 клеток на 500 л среднего.
  5. Плита 500 л клеточной подвески на скважину в ультра-низкой крепления 24 хорошо пластин.
  6. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия, в 5% CO2.

6. NC сфероид обслуживания и симпатической индукции прародителя (день 10 на день 14, Рисунок 4A)

  1. Вариант 1: Минимальная культура сфероидов
    1. На 11-й день, добавить 500 л дня 10-14 сфероидов среды nc сфероидов без аспирации существующей среде с 10-го дня. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, в 5% CO2.
    2. На 12-й день наклоните пластину, чтобы накопить NC сфероиды на одной стороне скважин. Тщательно аспирируйте и отбрасывайте как можно больше средств и кормите 1 мл дня 10-14 сфероидной среды.
    3. Продолжайте кормить клетки каждый день до 14-го дня.
    4. Дополнительно: Если сфероиды агрегируют и генерируют большой комок, используйте пипетку, чтобы разбить сфероидные комки вверх. Это также гарантирует, что отдельные сфероиды не становятся слишком большими.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальный диапазон размеров сфероидов должен быть около 100-500 мкм. В этом диапазоне размер отдельных сфероидов не является критическим. Тем не менее, морфология, такие как гладкие и четкие края(рисунок 3 и рисунок 6) имеет важное значение для дальнейшего успеха. На день 14, каждая 24 хорошо пластины идеально содержит около 50-60 сфероидов различных размеров в пределах вышеупомянутого диапазона размеров.
  2. Вариант 2: Расширенная сфероидная культура
    1. На 15-й день, чтобы сохранить NC сфероидов, кормить с 1,5 мл дня 10-14 сфероидной среды, содержащей 0,5 мкм РА. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: РА следует добавлять свежими для каждого кормления и всегда храниться при -80 градусах Цельсия.
    2. Отныне кормите через день до 28-го дня, а затем продолжайте направлять сфероиды (раздел 7.1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Растущие сфероиды делятся примерно 1 раз в неделю, пайпетируя их с 1 мл пипетки, чтобы разбить их. Они делятся при приблизительном соотношении 1:2-1:4. В течение 2-недельного периода расширения, клетки должны примерно в четыре раза в количестве.

7. Дифференциация и созревание SymN (Вариант 1: после 14-го дня; Вариант 2: после 28-го дня)

  1. Покрытие сфероидов в обычных блюдах
    1. Подготовка PO / LM / FM покрытием 24 хорошо пластин.
    2. Подготовьте среду symN, содержащую 0,125 мкм РА (добавляйте свежий каждый корм) и 10 мкм Y27632 (только день 14).
    3. На 14-й день наклоните пластину, чтобы накопить NC сфероиды на одной стороне колодцев. Тщательно аспирируйте и отбросьте как можно больше средств и покормите 1 мл симН-среды.
    4. Снимите LM/FN с покрытых пластин.
    5. Сплит и пластины каждый колодец из 24 хорошо пластины в 4 отдельных колодцев из новых, покрытием 24 хорошо пластины. Каждая оригинальная скважина будет иметь 1 мл, содержащий 50-60 сфероидов. Это дает 250 л, содержащий примерно 10-15 сфероидов для каждой скважины на новой пластине.
    6. Добавьте 250 л дополнительной среды на скважину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это раскол 1:4; убедитесь, что сфероиды распределяются должным образом в рамках решения, так что раскол относительно равномерно. Количество сфероидов не учитывается, так как окончательное число не влияет на успешность генерации симнов.
    7. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2.
    8. На день 15 (или день 29 для варианта 2), корма, заменив все среды с 1 мл симН среды, содержащей 0,125 мкм РА. Отныне нейроны следует кормить каждые 2 дня до 20-го дня (или 35-го дня для варианта 2).
    9. После 20-го дня (или дня 35 для варианта 2) нейроны следует кормить, тщательно заменяя только половину существующей среды (500 л). Отныне кормите каждую неделю, если среда быстро не пожелтеет.
    10. Продолжайте кормить еженедельно до желаемого момента времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: symNs, как правило, агрегируются в ганглиеподобных структурах и склонны к отъезду от культурных блюд. Для предотвращения этого рекомендуется полукормления и минимальная управляемость.
  2. Покрытие клеток для электрофизиологической записи
    1. Подготовка PO /LM/FM-покрытием 96 хорошо электрофизиологии пластин.
    2. Подготовьте среду symN, содержащую 0,125 мкм РА (добавляйте свежий каждый корм) и 10 мкм Y27632 (только день 14).
    3. На 14-й день соберите все сфероиды, затем центрифуги их на 200 х г в течение 4 мин.
    4. Откажитесь от супернатанта, добавьте 2 мл раствора диссоциации и перенесите смесь обратно в одну из скважин ультра-низкой пластины крепления. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, в 5% CO2 в течение 20-45 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от размера сфероидов, период диссоциации может быть длиннее 20 мин. Проверьте диссоциацию клетки каждые 10 минут до 45 мин. Дополнительно, 0,1 мг/мл DNase может быть добавлен с диссоциационным раствором, чтобы предотвратить свободную ДНК от мертвых клеток, делая раствор липким. Это необязательно в этом протоколе, потому что сфероиды не будут агрегироваться, как только они полностью разобщены.
    5. Pipet полностью разъединить сфероиды, затем центрифугу на 200 х г в течение 4 мин.
    6. Откажитесь от супернатанта, отрепримите клетки с соответствующим количеством симН-среды и подсчитайте номер ячейки.
    7. Плита клеток на 100000/см2 в PO / LM / FN покрытием электрофизиологии скважин в 200 Л Л общего объема на скважину.
    8. На 15 день (или день 29 для варианта 2), следуйте тем же процессам кормления, как в разделе 7.1. Общий объем после 15-го дня (или дня 29 для варианта 2) должен составят 300 л за скважину.
    9. Измерьте электрические сигналы с помощью машины с помощью мультиэлектродного массива после 20-го дня (или 35-го дня для варианта 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В варианте 2, сфероиды могут быть покрыты в любое время между днем 14-дневный 28. Первые измерения электрических сигналов могут быть проведены через неделю после покрытия сфероидов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе мы даем инструкции о том, как генерировать симнизмы из hPSCs. Культурные условия, продемонстрировавшиеся здесь, были улучшены по мимо ранее опубликованного протокола23,,24 (рисунок 1A)до условий, не связанных с подачей и химически определенных условий(рисунок 1B). Предусмотрены два варианта, один из которых, в течение чем делаются симнс, составляется в течение 20 дней, а другой, где НКК ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недавно мы опубликовали два обзора, один из которых обсуждал использование симн-симнов, полученных hPSC, для моделирования заболеваний31, а также углубленное сравнение доступных протоколов дифференциации22. Таким образом, здесь мы сосредоточимся на устранении неполадок текущего протокола, чтобы помочь заинтересованному исследователю преуспеть в создании симнов. В течение всего процесса дифференциации, для того, чтобы получить последовательные данные, а также здоровые диффер...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Хайди Ульрихс за критическое чтение и редактирование рукописи.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 мм чашки для клеточных культурFalcon353003
15 мл конические пробирки для культуры тканейVWR/Corning89039-664
24-луночные планшеты для культивирования тканейFalcon353047
24-луночные планшеты со сверхнизким уровнем прикрепленияCorning07 200 601 и 07 200 602
инкубатор для культуры тканей 5% CO2/20% O2Thermo Fisher/Life ТехнологииHeracell VIOS 160i
50 мл конические пробирки для культуры тканейVWR/Corning89039-656
6-луночные планшеты для культуры тканейCostar3516
AccutaseInnovation Cell TechnologiesAT104500раствор для диссоциации клеток
Антитело к AP2aAbcamab108311Хозяин: Кролик; разведение
1:400Антитело против Ascl1BD Pharmingen556604Хозяин: мышь IgG1; разведение 1:200
Антитело Anti-CD49DBioLegend304313Хозяин: мышь IgG1; 5 μ l/миллион ячеек в 100 μ l объем
антитела Anti-CD49D (изотип)BioLegend400125хозяина: мышь IgG1; 5 μ l/миллион ячеек в 100 μ l объем
DAPI красительSigmaD95421:1000 разведение
Anti-DBH антителоImmunostar22806Хозяин: Кролик; 1:500 разведение
Anti-GFP антителоAbcamab13970Хозяин: Курица; 1:1000 разведение
Anti-HOXC9 антителоAbcamab50839Хозяин: Мышь; 1:100 разведение
Anti-NET1 антителоMabNET17-1Хозяин: Мышь; 1:1000 разведение
Anti-PRPH антителоSanta Cruz BiotechnologySC-377093/H0112Хозяин: Мышь IgG2a; 1:200 разведение
Anti-SOX10 антителоSanta CruzBiotechnology sc-365692Хозяин: Мышь IgG1; 1:100 разведение
Anti-TH антителоPel-FreezP40101- 150Хозяин: Кролик; 1:500 разведение
Аскорбиновая кислотаSigmaA8960-5GКонцентрация в запасе: 100 мМ
добавка B27Thermo Fisher/Life Technologies12587-010Концентрация в запасе: 50x
BDNFR& D Systems248-BDКонцентрация запасов: 10 μ г/мл
BMP4R& D Systems314-BPКонцентрация запасов: 6 мМ
Счетчик клетокThermo Fisher/Life TechnologiesCountess II
Камеры для подсчета клетокInvitrogenC10312
ЦентрифугаEppendorf57021& 5424R
CHIR99021R& D Systems4423Концентрация запаса: 6 мМ
КриофлаконThermo Fisher/Life Technologies375353
dbcAMPSigmaD0627Концентрация запаса: 100 мМ
DMEMThermo Fisher/Life Technologies10829-018Концентрация запаса: 1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Life Technologies11330-057Концентрация запаса: 1x
DMSOThermo Fisher/Life TechnologiesBP231-100
E6 mediumgibcoA15165-01
E8 mediumgibcoA15169-01Концентрация запаса: 1x
добавка E8gibcoA15171-01Концентрация запаса: 50x
EDTASigmaED2SSКонцентрация запаса: 0,5 м
Электрофизиологические планшеты (AXION cytoview MEA96)Axion BioSystemsM768-tMEA-96W
Аппарат FACSBeckman CoulterCytoFLEX (для FACS)
Аппарат FACSBeckman CoulterMoFlo Astrios EQ (для сортировки)
Трубки FACS (синий колпачок фильтра)Пробирки Falcon352235
FACS (белый колпачок)Falcon352063
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
GDNFPeproTech450Исходная концентрация: 10 μ г/мл
GeltrexInvitrogenA1413202матрицей базальной мембраны; Исходная концентрация: 100x
hPSCsThomson et al., (1998)WA09
hPSCsOh et al. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
Человеческий фибронектин (FN)VWR/Corning47743-654Стоковая концентрация: 1 мг/мл
L-глутаминThermo Fisher/Gibco25030-081Стоковая концентрация: 200 мМ
LN бакCustom Biogenic SystemsV-1500AB
Считыватель MEAAxion BioSystemsMaestro Pro
Мышиный ламинин I (LM)R& D Systems3400-010-01Исходная концентрация: 1x
NGFPeproTech450-01Стоковая концентрация: 25 μ г/мл
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Gibco14190-136Исходная концентрация: 1x
Poly-L-орнитина гидробромид (PO)SigmaP3655Стоковая концентрация: 15 мг/мл
Примоцин (антибиотики)InvivoGenANTPM1Стоковая концентрация: 50 мг/мл
кПЦР машинаBio-Rad LaboratoriesC1000 Touch
кПЦР планшетыBio-Rad LaboratoriesHSP9601
рекомбинантный FGF2R& D Systems233-FB/CFКонцентрация запасов: 10 μ г/мл
Ретиноевая кислотаSigmaR2625Стоковая концентрация: 1 мМ
SB431542Tocris/R& D Systems1614Концентрация стока: 10 мМ
трипановый синийCorningMT-25-900-CI
Витронектин (VTN)Thermo Fisher/Life TechnologiesA14700Концентрация стока: 0,5 мг/мл
Водяная баняVWR/Corning706308
Y27632R& D Systems1254Концентрация запаса: 10 мМ
Стоковая концентрация: 1x NGF PeproTech 450-01

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
  3. Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
  4. Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
  5. Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
  6. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. (1999).
  7. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
  8. Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
  9. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
  10. Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).
  11. Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), Cambridge, England. 4220-4231 (2012).
  12. Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
  13. Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
  14. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
  15. Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), Cambridge, England. 473-481 (2008).
  16. Trainor, P. Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , Academic Press. (2013).
  17. Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).
  18. Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
  19. Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
  20. Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
  21. Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865(2018).
  22. Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92(2019).
  23. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
  24. Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78(2019).
  25. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  26. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
  29. Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
  30. Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81(2019).
  31. Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
  32. Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem CellsSympathetic Neuron DifferentiationFeeder free CultureChemically Defined ConditionsNeural Crest MarkersElectrophysiological RecordingRetinoic Acid TreatmentSpheroid Culture ExpansionPostganglionic Sympathetic NeuronsAutonomic Nervous System

Related Articles