В этом протоколе мы описываем стабильную, высокоэффективную стратегию дифференциации для генерации постганглионических симпатических нейронов из человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Эта модель сделает нейроны доступными для использования исследований множественных вегетативных расстройств.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Эффективная дифференциация постгонглионических симпатических нейронов с использованием человеческих плюрипотентных стволовых клеток в соответствии с безкормовыми и химически определенными условиями культуры
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Плюрипотентные стволовые клетки человека (HPSCs) стали мощным инструментом для моделирования заболеваний и изучения эмбрионального развития человека в пробирке. Ранее мы представили протокол дифференциации для производности вегетативных нейронов с симпатическим характером, который был применен к пациентам с вегетативной невропатией. Тем не менее, протокол был построен на Knock Out Сыворотки Замена (KSR) и фидер основе условий культуры, и для обеспечения высокой эффективности дифференциации, сортировка клеток была необходима. Эти факторы вызывают высокую изменчивость, высокую стоимость и низкую воспроизводимость. Кроме того, не были проверены зрелые симпатические свойства, в ключая электрическая активность. Здесь мы представляем оптимизированный протокол, в котором культура и дифференциация PSC выполняются в условиях культуры, свободной от фидера и химически определенных. Идентифицированы генетические маркеры, идентифицирующие нервный гребень ствола. Дальнейшая дифференциация на постгнилионические симпатические нейроны достигается через 20 дней без необходимости сортировки клеток. Электрофизиологическая запись дополнительно показывает функциональную идентичность нейронов. Стрельба, обнаруженная у наших дифференцированных нейронов, может быть усилена никотином и подавлена атранергическим антагонистом-антагонистом. Промежуточные симпатические нейронные прародители в этом протоколе могут быть сохранены в качестве нейронных сфероидов на срок до 2 недель, что позволяет расширить культуры. В целом, наш обновленный протокол дифференциации нейронов показывает высокую эффективность дифференциации, лучшую воспроизводимость, большую гибкость и лучшее созревание нейронов по сравнению с предыдущей версией. Этот протокол предоставит исследователям клетки, необходимые для изучения человеческих расстройств, которые влияют на вегетативную нервную систему.
Введение
Постганглионические симпатические нейроны (симны) принадлежат к вегетативной нервной системе (ANS) и играют несколько важных ролей в реагировании и регулировании гомеостаза тела, независимого от сознания. Например, стресс стимулирует симны и вызывает ответ на борьбу или полет, что приводит к увеличению частоты сердечных приступов, артериального давления и потоотделения. Символы страдают от множественных расстройств человека из-за генетики, токсичности / травмы, или в качестве компаньонов к другим заболеваниям. Примером генетической невропатии является детское расстройство семейной дисавтотомии (FD), где тяжелая дисрегуляция симн вызывает дистостентомический кризис, оч....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: H9 PHOX2B: GFP репортер линия была предоставлена Oh et al.19. Некоторые праймеры qPCR, используемые в этой работе, были получены от OriGene Technologies, в то время как несколько последовательностей получены из Frith et al.20,30.
1. Настройка для посуды, подготовки средств массовой информации и обслуживания hPSC
- Блюдо покрытие
-
Покрытие витронектина (ВТН)
- Поместите флаконы VTN в воду 37 градусов по Цельсию до полного размораживания, а затем тщательно перемешайте.
- Для 100 мм Петри блюдо, сме....
-
Покрытие витронектина (ВТН)
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этом протоколе мы даем инструкции о том, как генерировать симнизмы из hPSCs. Культурные условия, продемонстрировавшиеся здесь, были улучшены по мимо ранее опубликованного протокола23,,24 (рисунок 1A)до условий, не связанных с подачей и химически определенных условий(рисунок 1B). Предусмотрены два варианта, один из которых, в течение чем делаются симнс, составляется в течение 20 дней, а другой, где НКК .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Недавно мы опубликовали два обзора, один из которых обсуждал использование симн-симнов, полученных hPSC, для моделирования заболеваний31, а также углубленное сравнение доступных протоколов дифференциации22. Таким образом, здесь мы сосредоточимся на устранении неполадок текущего протокола, чтобы помочь заинтересованному исследователю преуспеть в создании симнов. В течение всего процесса дифференциации, для того, чтобы получить последовательные данные, а также здоровые диффер.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Хайди Ульрихс за критическое чтение и редактирование рукописи.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 100 мм чашки для клеточных культур | Falcon | 353003 | |
| 15 мл конические пробирки для культуры тканей | VWR/Corning | 89039-664 | |
| 24-луночные планшеты для культивирования тканей | Falcon | 353047 | |
| 24-луночные планшеты со сверхнизким уровнем прикрепления | Corning | 07 200 601 и 07 200 602 | |
| инкубатор для культуры тканей 5% CO2/20% O2 | Thermo Fisher/Life Технологии | Heracell VIOS 160i | |
| 50 мл конические пробирки для культуры тканей | VWR/Corning | 89039-656 | |
| 6-луночные планшеты для культуры тканей | Costar | 3516 | |
| Accutase | Innovation Cell Technologies | AT104500 | раствор для диссоциации клеток |
| Антитело к AP2a | Abcam | ab108311 | Хозяин: Кролик; разведение |
| 1:400Антитело против Ascl1 | BD Pharmingen | 556604 | Хозяин: мышь IgG1; разведение 1:200 |
| Антитело Anti-CD49D | BioLegend | 304313 | Хозяин: мышь IgG1; 5 μ l/миллион ячеек в 100 μ l объем |
| антитела Anti-CD49D (изотип) | BioLegend | 400125 | хозяина: мышь IgG1; 5 μ l/миллион ячеек в 100 μ l объем |
| DAPI краситель | Sigma | D9542 | 1:1000 разведение |
| Anti-DBH антитело | Immunostar | 22806 | Хозяин: Кролик; 1:500 разведение |
| Anti-GFP антитело | Abcam | ab13970 | Хозяин: Курица; 1:1000 разведение |
| Anti-HOXC9 антитело | Abcam | ab50839 | Хозяин: Мышь; 1:100 разведение |
| Anti-NET1 антитело | Mab | NET17-1 | Хозяин: Мышь; 1:1000 разведение |
| Anti-PRPH антитело | Santa Cruz Biotechnology | SC-377093/H0112 | Хозяин: Мышь IgG2a; 1:200 разведение |
| Anti-SOX10 антитело | Santa Cruz | Biotechnology sc-365692 | Хозяин: Мышь IgG1; 1:100 разведение |
| Anti-TH антитело | Pel-Freez | P40101- 150 | Хозяин: Кролик; 1:500 разведение |
| Аскорбиновая кислота | Sigma | A8960-5G | Концентрация в запасе: 100 мМ |
| добавка B27 | Thermo Fisher/Life Technologies | 12587-010 | Концентрация в запасе: 50x |
| BDNF | R& D Systems | 248-BD | Концентрация запасов: 10 μ г/мл |
| BMP4 | R& D Systems | 314-BP | Концентрация запасов: 6 мМ |
| Счетчик клеток | Thermo Fisher/Life Technologies | Countess II | |
| Камеры для подсчета клеток | Invitrogen | C10312 | |
| Центрифуга | Eppendorf | 57021& 5424R | |
| CHIR99021 | R& D Systems | 4423 | Концентрация запаса: 6 мМ |
| Криофлакон | Thermo Fisher/Life Technologies | 375353 | |
| dbcAMP | Sigma | D0627 | Концентрация запаса: 100 мМ |
| DMEM | Thermo Fisher/Life Technologies | 10829-018 | Концентрация запаса: 1x |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher/Life Technologies | 11330-057 | Концентрация запаса: 1x |
| DMSO | Thermo Fisher/Life Technologies | BP231-100 | |
| E6 medium | gibco | A15165-01 | |
| E8 medium | gibco | A15169-01 | Концентрация запаса: 1x |
| добавка E8 | gibco | A15171-01 | Концентрация запаса: 50x |
| EDTA | Sigma | ED2SS | Концентрация запаса: 0,5 м |
| Электрофизиологические планшеты (AXION cytoview MEA96) | Axion BioSystems | M768-tMEA-96W | |
| Аппарат FACS | Beckman Coulter | CytoFLEX (для FACS) | |
| Аппарат FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios EQ (для сортировки) | |
| Трубки FACS (синий колпачок фильтра) | Пробирки Falcon | 352235 | |
| FACS (белый колпачок) | Falcon | 352063 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| GDNF | PeproTech | 450 | Исходная концентрация: 10 μ г/мл |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | матрицей базальной мембраны; Исходная концентрация: 100x |
| hPSCs | Thomson et al., (1998) | WA09 | |
| hPSCs | Oh et al. (2016) | H9-PHOX2B::eGFP | |
| Человеческий фибронектин (FN) | VWR/Corning | 47743-654 | Стоковая концентрация: 1 мг/мл |
| L-глутамин | Thermo Fisher/Gibco | 25030-081 | Стоковая концентрация: 200 мМ |
| LN бак | Custom Biogenic Systems | V-1500AB | |
| Считыватель MEA | Axion BioSystems | Maestro Pro | |
| Мышиный ламинин I (LM) | R& D Systems | 3400-010-01 | Исходная концентрация: 1x |
| NGF | PeproTech | 450-01 | Стоковая концентрация: 25 μ г/мл |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) | Gibco | 14190-136 | Исходная концентрация: 1x |
| Poly-L-орнитина гидробромид (PO) | Sigma | P3655 | Стоковая концентрация: 15 мг/мл |
| Примоцин (антибиотики) | InvivoGen | ANTPM1 | Стоковая концентрация: 50 мг/мл |
| кПЦР машина | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch | |
| кПЦР планшеты | Bio-Rad Laboratories | HSP9601 | |
| рекомбинантный FGF2 | R& D Systems | 233-FB/CF | Концентрация запасов: 10 μ г/мл |
| Ретиноевая кислота | Sigma | R2625 | Стоковая концентрация: 1 мМ |
| SB431542 | Tocris/R& D Systems | 1614 | Концентрация стока: 10 мМ |
| трипановый синий | Corning | MT-25-900-CI | |
| Витронектин (VTN) | Thermo Fisher/Life Technologies | A14700 | Концентрация стока: 0,5 мг/мл |
| Водяная баня | VWR/Corning | 706308 | |
| Y27632 | R& D Systems | 1254 | Концентрация запаса: 10 мМ |
Ссылки
- Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
- Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-ind....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
