Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Создание In Situ закрытого цепи перфузии нижних органов брюшной полости и задних конечностей у мышей

6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60847

⸱

13 августа 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Thoracic Surgery, The First Hospital of Jilin University, 2The Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Department of Pharmaceutical Sciences, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Key Laboratory of Zoonoses Research, Ministry of Education, Jilin University, 4Department of Cardiology, China-Japan Union Hospital of Jilin University, 5Department of Gastrointestinal, Colorectal and Anal Surgery, China-Japan Union Hospital of Jilin University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Протокол описан для in situ перфузии нижней части тела мыши, в том числе мочевого пузыря, простаты, половых органов, кости, мышцы и стопы кожи.

Аннотация

Ex vivo перфузии является важным физиологическим инструментом для изучения функции изолированных органов (например, печени, почек). В то же время, из-за небольшого размера органов мыши, ex vivo перфузии кости, мочевого пузыря, кожи, простаты и репродуктивных органов является сложной или неосуществимой. Здесь мы впервые сообщаем о схеме перфузии нижней части тела у мышей, которая включает в себя вышеуказанные ткани, но обходит основные органы очистки (почки, печень и селезенка). Схема устанавливается путем канниелирования брюшной аорты и нижней полой вены над подвздошной артерией и венами и прижигания периферических кровеносных сосудов. Перфузия осуществляется через перистальтический насос с перфузионным потоком, поддерживаемым до 2 ч. На месте окрашивания флуоресцентным лектином и раствором Hoechst подтверждается, что микроваскулатура была успешно пронизана. Эта модель мыши может быть очень полезным инструментом для изучения патологических процессов, а также механизмов доставки лекарств, миграции/метастазирования циркулирующих опухолевых клеток в/из опухоли, а также взаимодействия иммунной системы с переполнимыми органами и тканями.

Введение

Изолированный орган перфузии был первоначально разработан для изучения физиологии органов для трансплантации1,2,3, и позволило понимание функций органов без вмешательства со стороны других систем организма. Например, изолированная перфузия почек и сердца была чрезвычайно полезна для понимания основных принципов гемодинамики и эффектов вазоактивных агентов, в то время как перфузия печени была важна для понимания метаболической функции, включая метаболизм наркотиков в здоровой и больной ткани4,,5,,6,,7. Кроме того, исследования перфузии имеют решающее значение для понимания жизнеспособности и функции органов, предназначенных для трансплантации. В Cancer Researchearch, изолированные перфузии опухоли была описана несколькими группами с помощью мыши, крысы, и свежестекованные человеческие ткани8,9. В некоторых изолированных перфузии опухоли, опухоль была имплантирована в яичников жира площадку, чтобы заставить рост опухоли, снабжающей кровеносные сосуды из мезентерии артерии10. Группа Jain выполнила новаторские исследования с использованием изолированных перфузии аденокарциномы толстой кишки, чтобы понять опухолевую гемодинамику и метастазы8,,11,,12,13. Другие инновационные инженерии ex vivo установки включают 96-ну пластины на основе перфузии устройства для культуры первичных человеческих множественных клеток миеломы14 и модульной камерой потока для инженерной архитектуры костного мозга и функции исследований15.

В дополнение к исследованиям физиологии и патологии, перфузия органов была использована для изучения основных принципов доставки лекарств. Так, одна группа описала изолированную перфузию конечностей крыс и изучила накопление липосом в имплантированных саркомах16,в то время как другая группа выполнила расчлененную перфузию почек человека для изучения эндотелиального таргетинга наночастиц17. Ternullo et al. использовали изолированный переполох кожи человека как близко к vivo модели проникновения препарата кожи18.

Несмотря на эти достижения в перфузии крупных органов и тканей, не было никаких сообщений о на месте перфузии моделей у мышей, что: а) шунтирование органов очистки, таких как печень, селезенка и почки; б) включают органы малого таза, кожу, мышцы, репродуктивные органы (у мужчин), мочевой пузырь, простату и костный мозг. Из-за небольшого размера этих органов и поставки сосудов, ex vivo каннуляция и создание перфузии цепи не представляется возможным. Мышь является наиболее важной моделью животных в исследованиях рака и иммунологии, а также в доставке лекарств. Способность взлетать маленькие органы мыши позволит ответить на интересные вопросы, касающиеся доставки лекарств в эти органы, в том числе к опухолям, имплантированных в таз (пузырь, простата, яичник, костный мозг), а также исследования фундаментальной физиологии и иммунологии заболеваний этих органов. Для решения этой проблемы мы разработали схему перфузии на мышах, которая потенциально может избежать повреждения тканей и гораздо лучше подходит для функциональных исследований, чем изолированные перфузии органов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Университета Колорадо (IACUC).

1. Предварительное нагревание системы перфузии

  1. Подготовьте систему перфузии перед операцией, начав циркулирующую водяную ванну с 37 градусами по Цельсию для всех компонентов с водяными куртками (перфузиотный резервуар, влажная камера и крышка), как показано в индивидуальной конфигурации на рисунке 1A. Убедитесь, что трубки чистые и заменить, если это необходимо. Чтобы ограничить объем перфузии, используйте ловушку пузыря во влажной камере в качестве перфузиохранилища(рисунок 1B-6).

2. Васкулярная катетеризация

  1. Индуцировать анестезию в 8-10 недельной мыши BALB/c с помощью изофлоурана ветеринарной анестезии с 3-5% изофлуран и скорость потока кислорода на 0,3 л/мин. В качестве альтернативы, использование кетамина / ксилазина или любой другой тип интраперитонеальной анестезии. Оцените глубину анестезии 2 методами: щепоткой ног и рефлектором роговицы.
  2. Преветте 4-0 шелковый шов с иглой в двойной дистиллированной воде.
  3. Поместите анестезируемую мышь в положение на спине на доске из пенополистирола с головой, обращенной к хирургу, и обездвижьте передние конечности и задние конечности лентой. Протрите живот изопропиловым спиртом и разрежьте брюшко вдоль средней линии ножницами. Остановить кровотечение по краю разреза с помощью электрокоагуляции (прижигания).
  4. Нажмите на желудок, jejunum и толстой кишки в правой части живота, чтобы выявить брюшной аорты, вена кава, и общие подвздошные и iliolumbar артерий и вен.
  5. Под микроскопом вскрытия, найти и ligate iliolumbar артерии / вены в мужской, и яичников артерии / вены и iliolumbar артерии / вены в женщине с помощью 4-0 шелковых швов (Рисунок 2 желтые линии).
  6. Под микроскопом рассечения, петля два 4-0 шелковых швов под брюшной аорты и нижней полой вены (около 1 см выше подвздошной артерии и вены, 1 мм друг от друга, Рисунок 2), и сделать свободный узел в шв ближе всего к подвучей сосудов(рисунок 2, белая пунктирная линия). Кроме того, 6-0 шелковый шов может быть использован для этого узла.
  7. Под микроскопом рассечения горизонтально выравнивается и растягиваются как нижняя вена-кава, так и брюшная аорта с порт-айгюй. Используйте 24-g крылатый катетер I.V. для прокола брюшной аорты, нажмите кнопку, чтобы втягивать ядро иглы и вставить катетер около 5 мм в сосуд.
    1. Повторите ту же процедуру с нижней полой вены и свяжите узлы обоих швов вокруг катетеризированных сосудов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Игла может легко проколоть через кровеносный сосуд; поэтому держите сосуды растянутыми и игольчатой параллельно с сосудом. Втягивай сердцевина иглы, как только игла проникает примерно на 1 мм в сосуд. Брюшная аорта находится под нижней полой вены и гораздо тоньше и упругой из-за того, что заключена в соединительной ткани. Таким образом, аорта может "держаться" к катетеру, и, таким образом, должны быть катетеризированы до вена кава, чтобы уменьшить вероятность выскальзывания катетера.
  8. Нанесите мгновенный клей, чтобы обездвижить катетеры к вереце, заменить органы брюшной полости, и закончить операцию при сохранении анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Органы, которые не могут быть полностью заменены в брюшной полости необходимо будет периодически увлажнять с перфузионной среды во время процесса перфузии.

3. Настройка системы перфузии

  1. Перенесите мышь в водяную во влажную камеру, предварительно разогрелую до 37 градусов по Цельсию на кремниевой подушечке и обездвижить крылья катетера к колодке с 19 G иглами.
  2. Заполните конец артериального катетера (вход) с преосвёзенным буфером перфузии (лактатное решение Ringer, дополненное 5% BSA), а затем соедините конец катетера с входным перфузионного тюбинга с помощью разъема винта(рисунок 1B,красная стрелка).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите разъем с гемостатическими щипцами и обездвижить трубки с лентой, чтобы избежать перемещения катетеров.
  3. Отрегулируйте скорость перистальтического потока до 0,6 м/мин и держите отток перфузии(рисунок 1B,синяя стрелка) открытым в течение 5-10 мин, чтобы промыть кровь через венозный катетер. Там будет несколько сгустков в выходе катетер; промыть сгустки с перфузионной буфера перед закрытием перфузии цепи.
  4. Подключите конец венозного катетера с розеткой трубки с помощью разъема винта, чтобы закрыть схему(Рисунок 1B). На данный момент, выполнить CO2 газовой эвтаназии и проверить по груди прокол или любой другой метод.
  5. Накройте влажную камеру разогретой крышкой. Проверьте уровень перфузии периодически и добавить больше, если это необходимо. Перфузия может быть выполнена до 2 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 5 мЛ перфузии потребуется для создания закрытой системы перфузии. Если утечки или отеков нет, объем перфузии уменьшится менее чем на 1 мл и дополнительный буфер не потребуется. Чтобы избежать отеков, вызванных периферическим циркулирующим тромбом, буфер перфузии, содержащий 0,002% гепарина, может быть использован в первые 10 минут перфузии, но должен быть изменен на буфер без гепарина, чтобы избежать утечки на краю разрезов.
  6. При необходимости добавьте реагент выбора в перфузионный резервуар или в порт впрыска в любое время(рисунок 1B-5). Например, 10 мл 10 мг/мл Hoechst33342 могут быть добавлены в перфузиат, чтобы окрашивать ядра клеток 2 ч до конца перфузии, или 50 мл 1 мг/мл DyLight 649-lectin, чтобы окрашивать сосудистые эндотелиальные клетки за 30 мин до конца перфутиона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При попытке пятна костного мозга с hoechst решение, мышей необходимо предварительно вводить 30 минут до операции.
  7. После перфузии флуоресцентными реагентами, промыть с буфером перфузии еще 10 минут, чтобы свести к минимуму фон флуоресценции.

4. Анализ перфузированных органов

  1. Собирайте органы, включая яички, простату, мочевой пузырь, бедренную кость, мышцы и кожу (например, ноги). Акциз на кусок органа около 1 мм3 и сгладить между двумя стеклянными слайдами.
    1. Исследование под перевернутым флуоресцентным конфокальным микроскопом с использованием DAPI/Cy5 excitation и эмиссионных фильтров (возбуждение лазеров : DAPI, 405 нм; Cy5,640 нм). Используйте по крайней мере 200-ю цель увеличения с численной диафрагмой 0,45.
    2. Кроме того, исправить органы с 4% формальдегида раствор для 24 ч и выполнять гематоксилин-эозин окрашивания19.
  2. Чтобы создать окно кости для нетронутого наблюдения костного мозга, обездвижить оба конца бедренной кости или голени и соскребать корковую кость с боковой кромкой 19 G иглы подвергать периостюм; заботиться, чтобы сохранить тонкий слой остаточной кости. Поместите кость на крышку скольжения с окном, обращенным к стеклу и изображение с перевернутым флуоресцентным конфокальным микроскопом с использованием DAPI и Cy5 каналов, как описано выше. Клетки и сосудистая сеть в полости костного мозга можно легко наблюдать.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы создали замкнутую систему перфузии цепи через каннулуля брюшной аорты и нижней полой вены 8-10 недельных мышей, сохраняя при этом объем буфера перфузии менее 10 мл. Рисунок 3A показывает конфокалные изображения после перфузии тканей с раствором Ringer, содержащим Hoechst 33342 и DyLight 649-lectin. Мышцы, костный мозг, яички, мочевой пузырь, простата и кожа ног показывают эффективное ядерное и сосудистое окрашивание. Рисунок 3B показывает гематоксилин-эозин о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанная схема может быть использована для зондирования различных вопросов исследований, например, роли различных компонентов сыворотки и тканевых барьеров в доставке лекарств или торговле иммунной и стволовыми клетками. Различные системы доставки лекарств (например, липосомы и наночастицы) могут быть добавлены в перфузию, чтобы понять роль физиологических и биохимических факторов в доставке. Продолжительность перфузии может варьироваться, в зависимости от исследуемой ткани, научных целей и состава перфузии. Мы представ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Исследование было поддержано NIH грант CA194058 DS, Skaggs школа фармации ADR программы субсидирования семян (DS); Национальный фонд естественных наук Китая (Грант No 317771093), Проект международного сотрудничества провинции Цзилинь (No.20180414085Г), Фонд фундаментальных исследований для центральных университетов, Программа для JLU Science and Technology Innovative Research Team (2017TD-27, 2019TD-36).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильное>Оборудование
3,5-90-кратный стерео зум на стойке со светодиодной подсветкойAmscopeАртикул: SM-3BZ-80S
Углекислый газ, USPAirgas healthcare19087-5283
Конфокальный микроскопNIKONECLIPSE Ti2
Одноразовая стерильная ручка для прижигания с высокой температуройFIABF7244
Пузырьковая ловушка для влажной камеры (часть 6 на рисунке 1)Аппарат Гарварда733692изготовлен по индивидуальному заказу в качестве контейнера для перфизата; также обеспечивается перфузия под постоянным давлением
Крышка влажной камеры с кварцевым окном (часть 3 на рисунке 1)Аппарат Гарварда 733524поддержания температуры камеры
Влажная камера с теплообменником из металлической трубкиАппарат Гарварда 732901Влажная камера с водяной рубашкой и крышкой для поддержания температуры перфузата и мыши
Иглодержатели Олсена-Хегара со шовными фрезамиFine Science Tools (FST)125014
Кислород сжатый, USPAirgas healthcareC2649150AE06
Роликовый насос (часть 4 на рисунке 1)Аппарат Гарварда730113подачи перфузата в канюлю во влажной камере
SCP plugsys сервоуправление F/Perfusion (часть 1 на рисунке 1)Гарвардский аппарат732806контроля скорости пурфузии
Силиконовая прокладкаГарвардский аппарат
Набор силиконовых трубок (стрелки на рисунке 1)Гарвардский аппарат (TYGON)733456
Студенческие стандартные щипцыFine Science Tools (FST)91100-12
Хирургические ножницыFine Science Tools (FST)14001-14
Стол для влажной камерыГарвардский аппарат734198
термоциркулятор (часть 2 на рисунке 1)Гарвардский аппарат724927циркуляционной водяной баней для всех компонентов с водяной рубашкой
Трехходовой запорный кран (часть 5 на рисунке 1)Cole-Palmer30600-02
Ветеринарный наркозный аппаратHighlandHME109
Materials
19-G BD PrecisionGlide иглаBD305186Для обездвиживания иглы Insyte Autoguard Winged и царапания кортикальной кости
4-0 шелковые шовные нитиKeebomed-Hopemedical427411
6-0 шелковые шовные нитиKeebomed-Hopemedical427401
Filter ( 0,2 & микро; m)Фильтр ThermoFisher42225-CAдля 5% BSA-RINGER' S
Перманентный маркерStaedtler342-9
Шприц (10 мл)Шприц Fisher Scientific14-823-2E
(60 мл)BD309653фильтр для 5% BSA-RINGER' S
<стронг>реагенты
1% Эванс синий ( б/в ) в фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,5)Sigma314-13-6
10% буферизованный формалинвеллейвет36692
BALB/c мыши ( 8-10 недель )Charles River Baxter
Viaflex лактат растворРингера EMRN Medical Supplies Inc.JB2324
Бычий сывороточный альбуминThermo Fisher11021-037
Цианоакрилатный клейKrazy Glue
DyLight-649-лектинVector Laboratories, Inc.ZB1214
Этанол (70% (об./об.))Pharmco111000190
Hoechst33342Life TechnologiesH3570
ИзофлуранPiramal Enterprises Limited66794-017-25
Фосфатный буферный растворGibco10010023

Ссылки

  1. Ghaidan, H., et al. Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion. Journal of Cardiothoracic Surgery. 14 (1), 125(2019).
  2. Kabagambe, S. K., et al. Combined Ex vivo Hypothermic and Normothermic Perfusion for Assessment of High-risk Deceased Donor Human Kidneys for Transplantation. Transplantation. 103 (2), 392-400 (2019).
  3. Knaak, J. M., et al. Technique of subnormothermic ex vivo liver perfusion for the storage, assessment, and repair of marginal liver grafts. Journal of Visualized Experiments. (90), e51419(2014).
  4. Hems, R., Ross, B. D., Berry, M. N., Krebs, H. A. Gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochemical Journal. 101 (2), 284-292 (1966).
  5. Nielsen, S., et al. Vasopressin increases water permeability of kidney collecting duct by inducing translocation of aquaporin-CD water channels to plasma membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (4), 1013-1017 (1995).
  6. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  7. Schreiter, T., et al. An ex vivo perfusion system emulating in vivo conditions in noncirrhotic and cirrhotic human liver. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 342 (3), 730-741 (2012).
  8. Sevick, E. M., Jain, R. K. Viscous resistance to blood flow in solid tumors: effect of hematocrit on intratumor blood viscosity. Cancer Research. 49 (13), 3513-3519 (1989).
  9. Duyverman, A. M., et al. An isolated tumor perfusion model in mice. Nature Protocols. 7 (4), 749-755 (2012).
  10. Sears, H. F., et al. Ex vivo perfusion of a tumor-containing colon with monoclonal antibody. J Surg Res. 31 (2), 145-150 (1981).
  11. Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21677-21682 (2010).
  12. Kristjansen, P. E., Boucher, Y., Jain, R. K. Dexamethasone reduces the interstitial fluid pressure in a human colon adenocarcinoma xenograft. Cancer Research. 53 (20), 4764-4766 (1993).
  13. Sevick, E. M., Jain, R. K. Geometric resistance to blood flow in solid tumors perfused ex vivo: effects of tumor size and perfusion pressure. Cancer Research. 49 (13), 3506-3512 (1989).
  14. Zhang, W. T., et al. Ex vivo Maintenance of Primary Human Multiple Myeloma Cells through the Optimization of the Osteoblastic Niche. PLoS One. 10 (5), (2015).
  15. Di Buduo, C. A., et al. Modular flow chamber for engineering bone marrow architecture and function. Biomaterials. 146, 60-71 (2017).
  16. Lokerse, W. J. M., Eggermont, A. M. M., Grull, H., Koning, G. A. Development and evaluation of an isolated limb infusion model for investigation of drug delivery kinetics to solid tumors by thermosensitive liposomes and hyperthermia. Journal of Controlled Release. 270, 282-289 (2018).
  17. Tietjen, G. T., et al. Nanoparticle targeting to the endothelium during normothermic machine perfusion of human kidneys. Science Translational Medicine. 9 (418), (2017).
  18. Ternullo, S., de Weerd, L., Flaten, G. E., Holsaeter, A. M., Skalko-Basnet, N. The isolated perfused human skin flap model: A missing link in skin penetration studies. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 96, 334-341 (2017).
  19. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, 4986(2008).
  20. Hekman, M. C., et al. Targeted Dual-Modality Imaging in Renal Cell Carcinoma: An Ex vivo Kidney Perfusion Study. Clinical Cancer Research. 22 (18), 4634-4642 (2016).
  21. Graham, R. A., Brown, T. R., Meyer, R. A. An ex vivo model for the study of tumor metabolism by nuclear magnetic resonance: characterization of the phosphorus-31 spectrum of the isolated perfused Morris hepatoma 7777. Cancer Research. 51 (3), 841-849 (1991).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in situHoechst
Создание In Situ закрытого цепи перфузии нижних органов брюшной полости и задних конечностей у мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.