Целью этого протокола является индуцирование транзиторной in vivo продукции нелетальных уровней активных форм кислорода (АФК) в коже мышей, что способствует дальнейшему развитию физиологических реакций в тканях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Стимуляция ниш стволовых клеток и регенерация тканей в коже мышей с помощью переключаемой протопорфирина IX-зависимой фотогенерации активных форм кислорода in situ
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В данной статье мы опишем протокол индуцирования переключаемой фотогенерации in vivo эндогенных активных форм кислорода (АФК) в коже мышей. Эта транзиторная продукция АФК in situ эффективно активирует пролиферацию клеток в нишах стволовых клеток и стимулирует регенерацию тканей, что сильно проявляется через ускорение процессов заживления ожогов и роста волосяных фолликулов. Протокол основан на регулируемом фотодинамическом лечении, которое обрабатывает ткань предшественниками эндогенного фотосенсибилизатора протопорфирина IX и далее облучает ткань красным светом при строго контролируемых физико-химических параметрах. В целом, этот протокол представляет собой интересный экспериментальный инструмент для анализа биологии АФК.
Введение
Активные формы кислорода (АФК) являются результатом химического восстановления молекулярного кислорода с образованием воды и включают синглетный кислород, супероксид-анион, перекись водорода и гидроксильный радикал 1,2,3. АФК имеют очень короткий срок службы из-за их чрезвычайно химически активной природы. У аэробных организмов АФК случайно образуются внутри клеток как основной побочный продукт аэробного дыхания (цепь переноса электронов) в митохондриях. Временное накопление высоких уровней АФК в клетке приводит к окислительному стрессу, который может спровоцировать необратим....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры по разведению мышей и экспериментам должны проводиться в соответствии с местным, национальным, международным законодательством и рекомендациями по экспериментам на животных.
1. Индукция роста волос, индукция ожога и идентификация долгосрочных BrdU LRC в эпителии кожи хвоста в целом
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 10-дневных или 7-недельных мышей C57BL/6, предпочтительно однопометников, для экспериментального дизайна, описанного ниже. Во всех экспериментальных процедурах животные обезболиваются ингаляцией 3% изофлурана или эвтаназией при вывихе шейки матки, как показано.
- Индукция роста волос на зад....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Местное введение предшественника мАЛК в кожу спины и хвоста мыши приводит к значительному накоплению PpIX во всей ткани и, что заметно, в волосяном фолликуле, о чем свидетельствует красновато-розовая флуоресценция этого соединения при возбуждении синим светом (407 нм) (рис. 2A,C). Последующее облучение обработанной ткани красным светом (636 нм) с флюенсом 2,5−4 Дж/см2 способствует преходящей продукции АФК в ткани, особенно в области выпуклости волосяного фолликула.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В данной работе мы представляем методологию, которая позволяет осуществлять транзиторную активацию продукции эндогенных АФК in vivo в коже мышей с физиологическими эффектами. Методика основана на фотодинамической процедуре индуцирования контролируемой и локальной стимуляции эндогенного фотосенсибилизатора PpIX (рис. 1B). Этот экспериментальный подход является интересным инструментом для изучения биологии АФК in vivo экспериментальных систем, представляя собой значительный шаг вперед по сравн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Все коммерческие применения процедур, описанных в этой работе, защищены патентом CSIC-UAM (EP2932967A1), авторами которого являются EC, MIC и JE, и лицензированы Derma Innovate SL для коммерческого использования. JE и JJM являются консультантами в Derma Innovate SL.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами Министерства экономики и конкуренции (RTC-2014-2626-1 для JE) и Института Салуда Карлоса III (PI15/01458 для JE) Испании. ЕК получила поддержку гранта Atracción de Talento Investigador 2017-T2/BMD-5766 (Comunidad de Madrid и UAM).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2′,7′-дихлорфлюоресцина диацетат | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| 5'-бромо-2'-деоксиуридин | Sigma Aldrich | B5002-500MG | |
| Анти-бромодоксиуридин-флуоресцеин | Roche | 11202693001 | |
| крем для депиляции (например, Veet) | Veet | ||
| Dihydroethidium | Sigma Aldrich | 37291-25MG | |
| Система визуализации in Vivo, например, IVIS Lumina 2 | Perkin Elmer | ||
| mALA в виде крема для местного применения, например, измеритель энергии METVIX Crema 160 мг/г | Galderma | ||
| Power (например, ThorLabs Model PM100D) | ThorLabs | ||
| , например, светодиодная лампа Aktilite 636 нм | Photocure ASA |
Ссылки
- Blázquez-Castro, A. Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology. Redox Biology. 13, 39-59 (2017).
- Valko, M., et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Th....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
