Отбор проб и анализ сигналов запаха животных

Краткое содержание

Мы разработали эффективную методологию отбора проб и анализа сигналов запаха, чтобы понять, как они могут быть использованы в общении с животными. В частности, мы используем твердофазную микроэкстракцию пространства над головой в сочетании с газовой хроматографией-масс-спектрометрией для анализа летучих компонентов запахов животных и запаховых меток.

Аннотация

Мы разработали эффективную методологию отбора проб и анализа сигналов запаха, используя твердофазную микроэкстракцию пространства над головой в сочетании с газовой хроматографией-масс-спектрометрией, чтобы понять, как они могут быть использованы в общении животных. Этот метод позволяет проводить полуциплиматический анализ летучих компонентов секреций запаха, позволяя разделять и предварительно идентифицировать компоненты в образце с последующим анализом соотношений пиковой площади для поиска тенденций, которые могут означать соединения, которые могут быть вовлечены в передачу сигналов. Ключевыми сильными сторонами этого нынешнего подхода являются диапазон типов образцов, которые могут быть проанализированы; отсутствие необходимости в какой-либо сложной пробоподготовке или извлечении; возможность разделения и анализа компонентов смеси; идентификация обнаруженных компонентов; и способность предоставлять полу количественно-количественную и потенциально количественную информацию об обнаруженных компонентах. Основное ограничение методологии касается самих образцов. Поскольку компоненты, представляющие особый интерес, являются летучими, и они могут быть легко потеряны или их концентрации изменены, важно, чтобы образцы хранились и транспортировались надлежащим образом после их сбора. Это также означает, что условия хранения и транспортировки образцов являются относительно дорогостоящими. Этот метод может быть применен к различным образцам (включая мочу, кал, волосы и выделения запаха ароматических желез). Эти запахи состоят из сложных смесей, встречающихся в ряде матриц, и, таким образом, требуют использования методов для разделения отдельных компонентов и извлечения соединений, представляющих биологический интерес.

Введение

Очень мало известно о химических изменениях, лежащих в основе обонятельных сигналов у животных^1,в том же время из-за методологических проблем в регистрации и количественной оценке летучих химических профилей запахов^2. Существует несколько потенциальных ловушек при работе с очень сложными химическими матрицами; к ним относятся при отборе проб и анализе запаха образцов^3.

В Научном центре Розалинд Франклин Университета Вулверхэмптона мы проводим анализ запахов и запахов, чтобы понять, как они могут использоваться животными. Мы объединяем семиохимию с поведенческой экологией, эндокринологией и цитологией, чтобы улучшить наше понимание роли обонятельных сигналов в общении животных.

Мы разработали методологию, а затем проанализировали запахи и маркировку различных видов, включая нескольких нечеловеческих приматов (то есть коронованных лемуров, красно-взъерошенные лемуры, японские макаки, оливковые бабуины, шимпанзе) и других млекопитающих (то есть кошек, коров). Мы собрали и проанализировали различные образцы, включая мочу, фекалии, волосы и выделения запаха пахлочек. Эти запахи и запаховые метки состоят из сложных смесей соединений, и поэтому любая методология, используемая для их анализа, должна включать некоторую форму сепараторного метода. Как показано на рисунке, они также встречаются в ряде матриц, что обусловливает необходимость использования методов извлечения интересующих компонентов.

Предыдущие исследования Vaglio et al.⁴ и других авторов⁵ использовали динамическую экстракцию в пространстве над головой (DHS) с помощью газовой хроматографии-масс-спектрометрии (GC-MS), в то время как прямая экстракция растворителем⁶ и комплексная экстракция растворителем⁷ также использовались. В частности, динамический отбор проб в пространстве над головой включает очистку пространства над головой известным объемом инертного газа, который в конечном итоге удаляет все летучие соединения, за исключением тех, которые демонстрируют сильное сродство к матрице образца (например, полярные соединения в водных образцах).

Для текущей методологии мы приняли метод твердофазной микроэкстракции пространства над головой (HS-SPME) в сочетании с GC-MS. В частности, мы разработали и усовершенствовали методологию, уже используемую Vaglio et al. в своей предыдущей лаборатории GC-MS^8,9,10.

Методы экстракции без растворителя очень эффективны для анализа небольших, высоколетучих соединений (которые в противном случае могут быть легко потеряны из образца), поскольку эти методы иммобилизуют соединения на стабильной твердофазной опоре. HS-SPME использует волокно, покрытое адсорбентным полимером, для захвата летучих соединений в пространстве образца или для извлечения растворенных соединений путем погружения в водную биологическую жидкость^11. Полимерное покрытие не связывает соединения сильно, поэтому нагреванием в инжекционном порту ГК их можно удалить. Этот метод является более мощным, чем методы экстракции растворителем, а также более эффективным, чем DHS.

При нынешнем подходе образцы содержатся в стеклянных флаконах. Эти флаконы нагревают до температуры 40 °C для имитации температуры тела животного, чтобы способствовать тому, чтобы летучие компоненты аромата занимали пространство головы флакона. Волокно SPME, покрытое 65 мкм сорбентного материала полидиметилсилоксана/дивинилбензола (PDMS/DVB), подвергается воздействию среды пространства над головой, и летучие компоненты из образца адсорбируются на волокно. При нагревании волокна во входном порту GC-MS летучие компоненты десорбируются от волокна, а затем отделяются GC. Паттерны масс-спектральной фрагментации получены для каждого компонента с использованием MS. Сравнивая эти масс-спектры с масс-спектральными базами данных, можно предварительно определить компоненты ароматического знака. Благодаря использованию автоматического пробоотборщика мы можем последовательно анализировать несколько образцов партиями.

Учитывая, что каждый тип волокна SPME имеет различное сродство с полярными химическими веществами, волокно обычно выбирают в зависимости от полярности и/или молекулярной массы целевых химических соединений. Кроме того, условия ГК изменяются в зависимости от типа колонки ГК и характеристик целевых химических соединений.

Этот метод позволяет проводить полуциплиматический анализ летучих компонентов запаховой маркировки, позволяя разделять и предварительно идентифицировать компоненты в образце с последующим анализом коэффициентов пиковой площади для поиска тенденций, которые могли бы означать компоненты ароматовой маркировки, которые могут быть вовлечены в сигнализацию.

Ключевыми сильными сторонами этого нынешнего подхода являются:

• Диапазон типов образцов, которые могут быть проанализированы.
• Не требуется сложная пробоподготовка или экстракция.
• Возможность анализа летучих компонентов.
• Возможность разделения компонентов смеси.
• Чтобы иметь возможность идентифицировать обнаруженные компоненты.
• Способность предоставлять полу количественное и потенциально количественное представление об обнаруженных компонентах.

Протокол

1. Сбор образцов

1. Образцы запахов, которые являются одним из следующих:
   1. Собирать спонтанно высвобождаемые привычными субъектами исследования (например, приматами зоопарка) через ароматизаторы на стерильной фильтровальной бумаге (например, выделения запаха паховой железы) или непосредственно во флаконы (например, мочу).
   2. Собирайте, втирая стерильные ватные тампоны после тренировки, изучайте предметы с помощью обучения с положительным подкреплением.
   3. Собирают путем растирания стерильными ватными тампонами после сакдации испытуемых.
2. Поместите образцы в стерильные прозрачные стеклянные флаконы с винтовой крышкой 10 мл и запечатайте завинчивающимися крышками с FTFE / силиконовыми перегородками. Сразу же храните их при -20 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Жизненно важно использовать чистые средства индивидуальной защиты, такие как нитриловые перчатки; часто меняйте их; избегать прямого контакта кожи с образцами и флаконами. Предпочтительно использовать совершенно новые флаконы; однако, в случае использования флаконов, жизненно важно предварительно очистить флаконы, а затем использовать тот же протокол.
3. Берите экологические заготовки каждый раз, когда собираются ароматические метки. Например, собрать пробы (например, фильтровальную бумагу или тампон) и флакон в пространстве над головой, которые подвергаются воздействию окружающей среды во время отбора проб.

2. Пробоподготовка

1. Подготовьте образцы в полевых условиях, разрезав лезвием приблизительно 10 мм квадрат из ароматизированной фильтровальной бумаги или головки тампона и поместив его во флакон с винтовым верхом.
2. После того, как каждый образец был подготовлен, утилизируйте или очистите лезвие, используемое для разрезания среды для отбора проб, используя соответствующую антибактериальную салфетку и/или спирт, и тщательно высушите.
3. Храните все образцы при -20 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно при -20°C или иным образом как можно ниже в полевых условиях.

3. Подготовка к анализу

1. Извлеките образцы из морозильной камеры и дайте естественным образом нагреться до комнатной температуры не менее 1 ч.
2. Настройте аналитический метод на GC-MS следующим образом:
   1. Для условий анализа SPME следуйте указаниям производителя по кондиции волокон SPME перед первым использованием: предварительное условие волокна (260 °C в течение 5 мин), инкубация образца (40 °C в течение 2 мин), время экстракции (15 мин), время десорбции (2 мин) и состояние волокна после (260 °C в течение 20 мин).
   2. Используйте следующие условия ГК: колонна (HP5-MS 30 м x 0,25 мм; 0,25 мкм), температура инжектора (270 °C), расход (1 мл/мин), режим впрыска (без разделения), профиль печи GC (45 °C в течение 2 мин; 4 °C/мин до 170 °C; от 20 °C/мин до 300 °C), линия передачи MSD (280 °C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для улучшения согласованности времени удержания между образцами аналитический метод блокирует время хранения).
   3. Используйте следующие условия MSD: задержка растворителя (2,5 мин) и диапазон сканирования (от 29 до 400 аму).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон от 10 до 400 использовался в предыдущих протоколах^4.
3. Убедитесь, что подача продувочного газа в блок кондиционирования волокна включена.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы сборка SPME была правильно установлена в автопробоотборнике и чтобы она была выровнена с лотками автопроблонксера, блоком кондиционирования волокна и входным портом GC. Неправильное выравнивание может привести к повреждению или разрушению волокна SPME.

4. Анализ

1. Поместите пустой флакон с пространством над головой (чтобы действовать как системный бланк) в первое положение лотка автопроблемы GC-MS. Поместите заготовку окружающей среды во второе положение лотка автопроблемы. Поместите образцы для анализа в последующие положения лотка для автоматического отбора проб.
2. Создайте аналитическую последовательность для анализа каждого образца в лотке для образцов.
   1. На главном экране MassHunter выберите Sequence | Последовательность загрузки.
   2. Заполните таблицу последовательностей для всех заготовок и образцов, вставив соответствующую информацию. Сохраните заполненную таблицу последовательностей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точная информация для таблицы последовательностей будет зависеть от форматирования таблицы лабораториями. Минимальная информация обычно включает тип образца, имя образца, местоположение и номер флакона, аналитический метод и местоположение и имя файла данных (выделение имени файла данных, соответствующего имени образца, облегчает будущую обработку данных). Дополнительные образцы могут быть добавлены к последовательности во время анализа.
3. Запустите последовательность, выбрав Sequence | Последовательность выполнения.
4. После анализа верните образцы в морозильную камеру как можно скорее.
   ПРИМЕЧАНИЕ: возможно повторное анализ образцов, но следует отметить, что некоторые летучие компоненты, возможно, были полностью извлечены во время первоначального анализа, а некоторые соединения, возможно, подверглись термическому и бактериальному разложению при 40 °C, таким образом, полученная хроматограмма может быть не полностью репрезентативной для исходной ароматического маркировки.

5. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальный анализ данных включает интеграцию хроматограмм для получения данных о времени удержания и площади пиков вместе с предварительной идентификацией пиков с использованием программного обеспечения ChemStation и баз данных масс-спектральных баз данных NIST (Национальный институт стандартов и технологий), версия MSD F.01.01.2317. Анализ данных может проводиться как вручную, так и полуавтоматическим методом. Если используется полуавтоматический метод, то иногда полезно провести ряд ручного анализа данных для проверки предварительных идентификаций.

1. Откройте файл данных, щелкнув по соответствующему файлу на левой навигационной панели. Общая ионная хроматограмма (TIC) будет отображаться в верхнем окне экрана анализа данных.
2. Чтобы интегрировать TIC с помощью интегратора RTE, выберите Хроматограмма | Интеграция.
3. Настройте параметры интеграции таким образом, чтобы пики, превышающие 3 x базового шума, были интегрированы. Выберите | хроматограммы Параметры интеграции сигналов MS. В выходном поле отрегулируйте минимальную пиковую область соответствующим образом (1.0 дает приемлемые результаты в наших примерах).
4. Чтобы определить пиковые пики и создать сводный отчет, выберите Экспорт отчетов | Отчет о результатах поиска библиотеки в XLS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Спектральные библиотеки, которые будут искаться вместе с количеством отображаемых совпадений библиотек, должны быть предварительно установлены в программном обеспечении, прежде чем можно будет выполнить поиск библиотеки.
5. Полученный отчет электронной таблицы содержит данные интеграции для каждого пика и предварительное сопоставление спектральной библиотеки для назначения идентификатора. Как правило, соответствие качества библиотеки и библиотеки должно составлять >80, чтобы принять предварительную идентификацию. Сохраните электронную таблицу.
6. Определите пик непосредственно из TIC.
   1. Выберите пик интереса.
   2. Если пик маленький, увеличьте масштаб, нарисовав поле вокруг пика, удерживая левую кнопку мыши вниз, растяните поле над пиком и отпустите.
   3. Поместите курсор так, чтобы она находились в самой высокой точке пика (или сразу после).
   4. Дважды щелкните правой кнопкой мыши, и масс-спектр для пика появится в нижнем окне экрана анализа данных.
   5. Чтобы выполнить поиск в спектральной библиотеке, переместите курсор в любое место в спектральном окне и дважды щелкните правой кнопкой мыши. Результаты поиска библиотеки появятся в новом окне.
   6. Чтобы удалить фоновый шум из спектра интереса, сначала дважды щелкните правой кнопкой мыши на рассматриваемом пике. Затем дважды щелкните правой кнопкой мыши в области без пиков непосредственно перед пиком интереса. Выберите | хроматограммы Вычтите спектры. Вычитанный спектр будет отображаться в нижнем окне экрана анализа данных и будет отображаться '(-)' рядом с данными SCAN в заголовке окна.

Результаты

Следуя этому протоколу, мы предварительно идентифицировали в общей сложности 32 летучих химических соединения из анализа 14 аногелитических запаховых меток, спонтанно высвобождаемых на фильтровальной бумаге красно-взъерошенными лемурами (Varecia variegata rubra) и сравнили профили запаха с особенностями сигнальщика^12. Встречающиеся в природе летучие соединения, такие как углеводороды, терпены, терпеновые спирты и кетоны, присутствовали в этих профилях и включали соединения, которые, как б...

Обсуждение

Использование контрольных образцов, как экологических контрольных образцов, созданных во время отбора проб, так и системных заготовок, имеет решающее значение для интерпретации образцов с запаховым метками. Любые пики, приписываемые среде выборки или инструментальной системе, должны быть исключены из образцов ароматических меток, с тем чтобы в любую интерпретацию включались только пики, представляющие интерес. Эти средства контроля также могут играть роль в оценке и мониторинге «работоспособности» приборов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Флаконы автосэмплера 10 мл	Agilent	5188-5392	Флаконы 10 мл с крышками
флаконов 18 мм	Agilent	8010-0139	Магнитные с ПТФЭ/силиконовыми перегородками
Автоподатчик	Agilent	GC120 PAL автоподатчик
Капиллярная колонка	Agilent	HP5-MS	30 м x 0,25 мм; 0,25 &; m
Программное обеспечение для анализа данных	Agilent-ChemStation
Газовый хроматограф	Agilent	7890B
Входная перегородка	Agilent	5182-3442	Мерлин микропечать
Масс-селективный детектор	Agilent	5977A
Программное обеспечение для отчетности		Microsoft-Excel
Спектральная библиотека	NIST	-	NIST/EPA/NIH Масс-спектральная библиотека
Программа поиска спектральной библиотеки	NIST-MS		Search v.2.2
Бесразъемный вкладыш	Agilent	5190-4048
SPME волокна	Agilent	SU57345U	65 &; m PDMS/DVB волокно