Методическая статья

Использование многослойного гидрогеля Bioink в трехмерной биопечати для однородного распределения клеток

DOI:

10.3791/60920

⸱

2 мая 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiac Surgery and Shanghai Institute of Cardiovascular Diseases, Zhongshan Hospital, Fudan University, 2Shanghai Institute of Cardiovascular Diseases, 3Center for Medical Research and Innovation, Shanghai Pudong Hospital, Fudan University Pudong Medical Center, 4Institutes of Biomedical Sciences and Department of Systems Biology for Medicine, Shanghai Medical College, Fudan University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы разработали новую многослойную модифицированную стратегию для жидковидных биоинков (желатиновый метакрилоил с низкой вязкостью) для предотвращения осаждения инкапсулированных клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во время экструзио-основанного трехмерного процесса биопечати, жидко-подобные биоинки с низкой вязкостью могут защитить клетки от повреждения мембраны, вызванного стрессом сдвига и улучшить выживание инкапсулированных клеток. Однако быстрое гравитационно-управляемое осадок клеток в резервуаре может привести к неоднородному распределению клеток в биопечатных структурах и, следовательно, затруднить применение жидковидных биоинков. Здесь мы разработали новую многослойную модифицированную стратегию для жидкого биоинка (например, желатиновый метакрилоил с низкой вязкостью) для предотвращения осаждения инкапсулированных клеток. В многослойной биоинкации манипулировали несколькими жидкими интерфейсами, чтобы обеспечить межфрусное удержание. Следовательно, действие осаждения клеток, идущее через соседние слои в многослойной системе, было отложено в биоинковом резервуаре. Было установлено, что межфрагментальное удержание было гораздо выше, чем осадочный притяжение клеток, демонстрируя важную роль межфрагментационного удержания в предотвращении осаждения клеток и содействии более однородной дисперсации клеток в многослойной биомарке.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трехмерная (3D) биопечать была перспективным методом для производства сложных архитектурных и функциональных копий местных тканей в биофабрике и регенеративной медицине1,2,3. Общие стратегии биопечати, в том числе струйной, экструзии и стереолитографии печати, имеют плюсы и минусы с разных точек зрения4. Среди этих методов, экструзионная процедура наиболее часто используется из-за его рентабельности. Биоинк играет ключевую роль в процессе стабильности экструзионной биопечати. Идеальный клеточный биоинков должен быть не только биосовместимым, но и подходит для механических свойств5. Биоинки с низкой вязкостью обычно представлены как жидкое состояние. Эти биоinks могут быть легко и быстро хранение и избежать повреждения клеточной мембраны, вызванной высоким стрессом сдвига во время экструзии. Однако, в сложных случаях, требующих длительных периодов печати, низкая вязкость часто приводит к неизбежной осадки инкапсулированных клеток в биоинковом резервуаре, который обычно приводит к гравитации и приводит к дисперсии inhomogeneous клеток в биоинке6,7. Следовательно, биоинк с дисперсиями inhomogeneous клетки препятствует биопечати в пробирке функциональной конструкции ткани.

Несколько недавних исследований, посвященных биоинксам, сообщили о продвижении однородной дисперсии инкапсулированных клеток. Модифицированный биоинкт альгината на основе двухсценировки двухсценивания использовался для экструзионной биопечати8. Альгинатный полимер был модифицирован с пептидами и белками в этом исследовании. Клетки представили более однородное распределение в этом модифицированном альгинате, чем в широко используемом альгинате из-за участков вложения, предоставляемых пептидами и белками. Кроме того, смешанные биоинки были использованы для решения осаждения клеток в биоинк. В другом исследовании9был использован смешанный биоинк, содержащий полиэтиленгликоль (ПЭГ) и желатин или желатиновый метакрилоил (GelMA) с улучшенной механической прочностью. Инкапсулированные клетки представляли однородное распределение главным образом потому, что вязкость смешанного биоинка была улучшена. В целом, существует несколько факторов, влияющих на дисперсию инкапсулированных клеток в биоинке, такие как вязкость биоинка, гравитация клеток, плотность клеток и продолжительность рабочего периода. Среди этих факторов, гравитация клеток играет важную роль в содействии осаждения. Плавучесть и трение, предоставляемые вязкой биоинка были исследованы в качестве основных сил против тяжести на сегодняшний день10.

При этом мы разработали новую стратегию, направленную на содействие однородной дисперсии инкапсулированных клеток в биоинке путем манипулирования несколькими жидкими интерфейсами в биоинковом резервуаре. Эти жидкие интерфейсы, созданные многослойной модификацией биоинка, могут не только обеспечить межфодное удержание, которое замедляет осадок клеток, но и поддерживать подходящую биосовместимость и реологическое поведение биоинка. На практике мы модифицировали aqueous раствор GelMA (5%, w/v) с шелковым фиброном (SF) многослойным способом, чтобы продольно производить четыре интерфейса, обеспечивая межпараленийные напряжения в смешанном биоинке. В результате гравитационная нагрузка на клетки была компенсирована антропогенным межвидовым напряжением, и почти однородная дисперсия инкапсулированных клеток в биоинке была получена из-за меньшего осаждения через соседние слои клеток. До настоящего времени не было зарегистрировано ни одного подобного протокола, чтобы замедлить осаждение инкапсулированных клеток путем манипулирования межфомационным удержанием жидких бионавов. Мы представляем наш протокол здесь, чтобы продемонстрировать новый способ решения осаждения клеток в биопечати.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка клеточного нагруженных SF-GelMA

  1. Стериллизовать все материалы с помощью 0,22 м шприц фильтр единиц. Выполните все шаги в кабинете биологической безопасности.
  2. Теплый 1x PBS до 50 градусов по Цельсию, и растворить желатин в нагретом 1x PBS с перемешиванием. Окончательная концентрация желатина в PBS должна составлять 10% (w/v).
  3. Добавить метакриковый андирид в раствор желатина (соотношение веса метакрикового андирида до желатина 0,6 к 1) медленно с перемешиванием, и смешать комплекс, по крайней мере 1 ч (50 градусов по Цельсию). Как правило, подготовить 200 мл 10% раствора желатина с 12 г метакрила ангидрид; объем зависит от потребностей исследования.
  4. Перенесите смешанный раствор, содержащий желатин и метакриковый андилидид, в стерильную трубку 50 мЛ.
  5. Центрифуга смешанного раствора на 3500 х г. Это обычно занимает 3-5 мин, чтобы получить два слоя. Соберите верхний слой (GelMA) и отбросьте нижний слой (нереактированный метакриловый десидрид).
  6. Разбавить раствор верхнего слоя, полученный в шаге 1.5, двумя томами деионизированной воды (40–50 градусов по Цельсию).
  7. Диализ раствор, полученный в шаге 1.6 с 12-14 kDa молекулярной мембраны диализа веса против деионизированной воды в течение 5-7 дней (40-50 градусов по Цельсию). Меняйте воду два раза в день.
  8. Соберите и заморозьте раствор GelMA при цене 80 градусов по Цельсию на ночь.
  9. Лиофилизировать раствор GelMA в течение 3–5 дней в морозильной сушилке с температурой, установленной до -45 градусов по Цельсию, а давление устанавливается до 0,2 мбар.
  10. Растворите лиофилизированный гельма (степень замены примерно 75%) в 1x PBS, содержащий 10% FBS (фетальная сыворотка крупного рогатого скота, v/v), 25 mM HEPES (N-2-гидроксиэтилпатразин-N-этан-сульфоновая кислота) и фотоинициативатор (0,5%, ж/в) для получения препарата GelMA биоинков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Степень замещения GelMA может быть рассчитана по анализу нинигидрина3.
  11. Смешайте раствор GelMA (10%, w/v) с различными объемами первоначального решения SF (5%, w/v) и различными объемами 1x PBS для получения биоинков SF-GelMA с различными концентрациями SF. Пропорция на 1 мл раствор GelMA и SF в различных биоинксах представлена в таблице 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все биоинтоны должны содержать окончательную концентрацию 5% (w/v) GelMA, но концентрация SF варьируется: 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, и 1.5% (w/v) в различных биоинках SF-GelMA. Используйте SF-M-Layered-GelMA, чтобы термин GelMA биоинки изменены с SF в слой за слоем образом. Используйте SF-X-GelMA для того чтобы терминировать те GelMA доработанное с SF в однородной манере (например, GelMA с изменением 1% SF было названо SF-1-GelMA).
  12. Sonicate все биоинки в течение 10-20 мин.
  13. Расти NIH3T3 клетки с использованием DMEM (Dulbecco в модифицированной Eagle среды) содержащие 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин в инкубаторе (37 градусов по Цельсию с 5% CO2). Прохождение ячеек в соотношении 1:3, когда плотность достигает 80%.
  14. Центрифуга суспензия клеток NIH3T3 при 1500 об/мин в течение 5 мин. Удалить супернатант с всасыванием и повторно перенапись клеточной гранулы со свежим раствором биомарка в 15 мл стерильной трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация инкапсулированных клеток в биоинке должна быть 1 х 106 клеток/мЛ, а концентрация должна быть рассчитана с помощью цитометра.
  15. Используйте 2 мЛ различных биоинков SF-GelMA, чтобы приостановить клеточные гранулы для получения различных клеточных биоинков.

2. Загрузка, разогрев и биопечать SF-M-Layered-GelMA

  1. Загрузите 0,4 мл клеточного SF-0.5-GelMA в нижний слой шприца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте шприц 2 mL в качестве биомаркового резервуара в этом исследовании. Загрузите различные биоинки SF-GelMA в шприц с слоем.
  2. Поместите шприц в ледяную водяную ванну (0 градусов по Цельсию) в течение 5 минут, чтобы привести к превращению биоинка нижнего слоя в состояние геля.
  3. Нагрузка 0,4 мл клеточного нагруженного SF-0.75-GelMA биоинк над нижним слоем.
  4. Поместите шприц с двумя слоями биоinks в ванну с ледяной водой (0 градусов по Цельсию) в течение 5 минут, чтобы вызвать два слоя биоinks превратиться в состояние геля.
  5. Цикл погрузки и охлаждения шаги еще 3 раза с оставшимися 3 вида биоинков (SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA), чтобы получить многослойную биоинковую систему с различными концентрациями SF в различных слоях. Объем, используемый для загрузки всех биоинков, должен составлять 0,4 мл.
  6. Разогреть многослойный биоинк, поместив шприц в инкубатор (37 градусов по Цельсию) в течение 30 минут до биопечати.
  7. Используйте шприц 2 мЛ в качестве биомаркивного резервуара с соплом для печати 27 Г. Установите скорость потока на уровне 50 мл/мин, скорость движения сопла на 2 мм/с, а высота сопла - 1 мм. Выполните процедуру биопечати при комнатной температуре (примерно 20 градусов по Цельсию).
    1. Печать ткани построить в экструзии образом с помощью заказ биопринтера по параметрам, адаптированным из наших предыдущих исследований11,12.
  8. Используйте ультрафиолетовый свет (365 нм, 800 мВт) в течение 40 с для перекрестного пересечения конструкции биопечатной ткани.
  9. Культура поперечной ткани построить в DMEM (Dulbecco в модифицированных Eagle среды), содержащей 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин в инкубаторе (37 градусов по Цельсию с 5% CO2). Среда менялась каждые 8 ч в течение первых 2 дней и каждые 2-3 дня после этого.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схема подготовки клеточного биоинкаса показана на рисунке 1. После подготовки различных биоinks, погрузка, разогрев и биопечать были выполнены(рисунок 2). Для оценки распределения инкапсулированных клеток в биоинковом резервуаре была проведена процедура биопечати с использованием трех различных бионков, нагруженных клетками, в трех 96-ну пластинах(рисунок 3A). Для исследования дисперсии инкапсулированных клеток (bioinks) были исполь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стабильность многослойной системы является ключевым моментом для успешного выполнения этого протокола. Теоретически мы рассчитали диффузию молекул SF в решении GelMA на основе исследования Наумана13. Выяснилось, что диффузия белков в растворе связана с их молекулярным весом. Средний молекулярный вес (МВт) альбумина сыворотки крупного рогатого скота (BSA) составляет 66,5 кДа, а коэффициент диффузии составляет 64-72 мкм2/с. Средний МВт фибриногена составляет 339,7 кДа, а коэффициент диффу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают гранты Национального фонда естественных наук Китая (81771971, 81970442, 81703470 и 81570422), Национальная ключевая программа НИОКР Китая (2018YFC1005002), Комиссия по науке и технологиям муниципалитета Шанхая (17JC1400200), Шанхайский муниципальный научно-технический крупный проект (Грант No 2017H'S'X01), и Шанхайская комиссия по муниципальному образованию (Инновационная программа 2017-01-07) -00-07-E00027).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-гидрокси-4&прайм;-(2-гидроксиэтокси)-2-метилпропиофенон (PI2959)TCIM64BK-QD
4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинитанесульфоновая кислота (HEPES)Gibco15630080
Dulbecco' s модифицированный Eagle' s среда (DMEM)Gibco10569044
фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco10091
ЖелатинSigma-AldrichV900863MSDS
метакриловый ангидрид (MA)Sigma-Aldrich276685MSDS
Пенициллин– стрептомициновые антибиотикиGibco15140163
фосфатно-солевой буфер (PBS)Gibco10010049
фиброин шелкаAdvanced BioMatrix5154

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
  2. Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510(2019).
  3. Daniela, L., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
  4. Pedde, R. D., et al. Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs. Advanced Materials. 29 (19), (2017).
  5. Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002(2016).
  6. Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).
  7. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).
  8. Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).
  9. Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).
  10. Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).
  11. Chen, N., et al. Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).
  12. Zhu, K., et al. A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking. Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127(2018).
  13. Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels. Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи