Обычные конъюги BODIPY могут быть использованы для живой-клеточной одномолекулярной микроскопии локализации (SMLM) путем эксплуатации их преходящее, красно-сдвигаемых стриеров земли. Мы представляем оптимизированный протокол SMLM для отслеживания и разрешения субклеточных нейтральных липидов и жирных кислот в живых клетках млекопитающих и дрожжей в наноскопической шкале длины.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Обычные BODIPY конъюгирует для микроскопии с суперразрешением Live-Cell и одномолекулярного слежения
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Методы локализации одной молекулы (SMLM) преодолевают оптический предел дифракции обычной флуоресценционной микроскопии и могут разрешать внутриклеточные структуры и динамику биомолекул с точностью 20 нм. Предпосылкой для SMLM являются флюорофоры, которые переходят из темного в флуоресцентное состояние, чтобы избежать пространственно-временного перекрытия их функций точечного распространения в каждом из тысяч кадров для сбора данных. BODIPYs являются устоявшимися красителями с многочисленными конъюгами, используемыми в обычной микроскопии. Переходное образование красно-сдвигающихся димеров НАИППи (DII)приводит к яркому выбросу одной молекулы, позволяющему микроскопию локализации одной молекулы (SMLM). Здесь мы представляем простой, но универсальный протокол для SMLM с обычными спариями BODIPY в живых дрожжах и клетках млекопитающих. Эта процедура может быть использована для получения изображений супер-разрешения и для отслеживания одного состояния BODIPY-DII для извлечения пространственно-временной информации конъюгированных BODIPY. Мы применяем эту процедуру для разрешения липидных капель (ЛД), жирных кислот и лисосомы в живых дрожжах и клетках млекопитающих в наноскопической шкале длины. Кроме того, мы демонстрируем возможность многоцветной визуализации с красителями BODIPY при использовании в сочетании с другими флуоресцентными зондами. Наши репрезентативные результаты показывают дифференциальное пространственное распределение и подвижность БОДИПИ-жирных кислот и нейтральных липидов в дрожжах в условиях кормления и поста. Этот оптимизированный протокол для SMLM может быть использован с сотнями коммерчески доступных конъюгатов BODIPY и является полезным ресурсом для изучения биологических процессов на наноуровне, далеко за пределами применения этой работы.
Введение
Одномолекулярная локализация микроскопии (SMLM) методы, такие как стохастической оптической реконструкции микроскопии (STORM) и фото-активированной локализации микроскопии (PALM) появились как методы для генерации супер-разрешение изображения с информацией за пределами оптического дифракции Абба предел1,2 и для отслеживания динамики отдельных биомолекул3,4. Одним из требований к зондам, совместимым с SMLM, является возможность контролировать количество активных фторфоров в любое время, чтобы избежать пространственного перекрытия их функций точечного ра....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Для клонирования дрожжей и эндогенных пометок пожалуйста, обратитесь к нашей недавней публикации10.
1. Подготовка образцов дрожжевых клеток для визуализации
- Подготовьте жидкую ночную культуру штамма дрожжей w303. Используя стерильную деревянную палочку, пятно небольшое количество дрожжевых клеток из агар пластины, содержащей дрожжевой экстракт-пептон-декстрозя в культуре трубки с 2 мл синтетических полной декстроза (SCD) среды. Инкубировать трубку на ночь в трясущихся инкубатора при 270 об/мин и 30 градусов по Цельсию.
- Выполните 1:50 утреннее разбавление клеток в SCD. Продолжить культу....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Здесь мы представляем оптимизированную подготовку образца, процедуру сбора и анализа данных для SMLM с использованием конъюги для BODIPY на основе вышеуказанного протокола(рисунок 1A). Чтобы продемонстрировать пример рабочего процесса для получения и анализа данных SMLM, мы используем BODIPY (493/503) в дрожжах для разрешения LD под оптическим пределом дифракции(рисунок 1B-F). Примеры различных многоцветных режимов изображения BODIPY в сочетании.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом протоколе мы продемонстрировали, как обычные конъюгированные BODIPY могут быть использованы для получения изображений SMLM с улучшением пространственного разрешения на порядок. Этот метод основан на использовании ранее сообщалось, красно-сдвинутые DII состояния обычных красителей BODIPY, которые временно образуются через двухмолекулярные встречи. Эти состояния могут быть специально возбуждены и обнаружены с красными длинами волн и являются редкими и недолговечными достаточно для SMLM. При настройке конц.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих интересах.
Благодарности
Исследование, о проислизировавее в этой публикации, было поддержано Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером премии R21GM127965.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| BODIPY C12 | ThermoFisher | D3822 | Аналог зеленых жирных кислот |
| BODIPY C12 Красный | ThermoFisher | D3835 | Аналог красных жирных кислот |
| BODIPY(493/503) | ThermoFisher | D3922 | Нейтральный липидный маркер |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2010 | Иммобилизация клеток на поверхности стекла |
| Drop-out Mix Complete без азотной основы | US Biological | D9515 | Аминокислоты для SCD |
| Декстроза | Sigma-Aldrich | G7021 | Источник углерода для SCD |
| Eight Well | Cellvis | C8-1.58-N | Chambered Cover Glasses |
| Eight Well, Lb-Tek II | Sigma-Aldrich | Chambered Cover Glasses | |
| ET525/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET595/50 | Chroma | Полосовой фильтр | |
| ET610/75 | Хроматический | полосовой фильтр | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Gibco | 26140079 | сыворотка |
| FF652 | Semrock | Светоделитель | |
| FF731/137 | Semrock | Полосовой фильтр | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | Клеточная культуральная среда |
| Hal4000 | Zhuang Lab, Гарвардский университет | Программное обеспечение для сбора данных | |
| Ixon89Ultra DU-897U | Andor | EMCCD камера для детектирования фотонов | |
| Лазер 405, 488, 561, 640 нм | CW-OBIS | Лазеры для возбуждения | |
| Insight3 | Zhuang Lab, Гарвардский университет | Программное обеспечение для локализации одиночных молекул | |
| L-глутамин | Gibco | 25030-081 | Аминокислоты, необходимые для клеточной культуры |
| Раствор для визуализации живых клеток | ThermoFisher | A14291DJ | Буфер для визуализации |
| Lysotracker Green | ThermoFisher | L7526 | Маркер лизосом на основе бодипии |
| Клетки ATCC U2OS млекопитающих (Манассас, Вирджиния) | Д-р Йохен Мюллер (Университет Миннесоты) | ||
| Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.49 N.A | Nikon | иммерсионное цель | |
| Пенициллин стрептомицин | Gibco | 15140-122 | Антибиотики |
| Пируват натрия | Gibco | 11360-070 | Добавка для клеточной культуры |
| T562lpxr | Chroma | Beam Splitter | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Диссоциация адгезивной клетки |
| W303 MATa штамм | Horizon-Dharmacon | YSC1058 | Родительский штамм дрожжей |
| Дрожжевая азотная основа | Sigma-Aldrich | Y1250 | Азотная основа без аминокислот |
| zt405/488/561/640rdc | Chroma | Quadband дихроичное зеркало |
Ссылки
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
