Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Высокочастотная ультразвуковая эхокардиография для оценки сердечной функции зебры

9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60976

⸱

12 марта 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University, 2Division of Genetics, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем протокол для оценки морфологии сердца и функции у взрослых зебры с помощью высокочастотной эхокардиографии. Метод позволяет визуализировать сердце и последующую количественную оценку функциональных параметров, таких как частота сердечных приступов (HR), выход сердца (CO), изменение дробной области (FAC), фракция выброса (EF), а также скорость притока крови и оттока.

Аннотация

Зебрафиш(Danio rerio) стал очень популярным модельным организмом в сердечно-сосудистых исследованиях, включая сердечные заболевания человека, во многом благодаря своей эмбриональной прозрачности, генетической уступчивости и удобствам для быстрых, высокопроизводительных исследований. Однако потеря прозрачности ограничивает анализ функций сердца на взрослой стадии, что усложняет моделирование возрастных заболеваний сердца. Для преодоления таких ограничений, высокочастотная ультразвуковая эхокардиография у зебры становится жизнеспособным вариантом. Здесь мы представляем подробный протокол для оценки сердечной функции у взрослых зебры с помощью неинвазивной эхокардиографии с помощью высокочастотного ультразвука. Метод позволяет визуализировать и анализировать измерение сердца зебры и количественно ежемерскую оценку важных функциональных параметров, включая частоту сердечных приступов, объем инсульта, выход сердца и выброс фракции. В этом методе, рыбы под обезглавлены и хранятся под водой и могут быть восстановлены после процедуры. Хотя высокочастотный ультразвук является дорогостоящей технологией, одиниковую платформу визуализации можно использовать для различных видов (например, мурина и зебры) путем адаптации различных преобразователей. Эхокардиография зебры является надежным методом сердечного фенотипирования, полезным для проверки и характеристики моделей заболеваний, особенно позднего начала заболеваний; экраны наркотиков; и исследования сердечно-сотруднических травм, восстановления и регенеративной способности.

Введение

Зебрафиш(Danio rerio) является устоявшейся позвоночной моделью для изучения процессов развития и заболеваний человека1. Зебрафиш обладают высоким генетическим сходством с человеком (70%), генетической усваиваемостью, высокой плодовитостью и оптической прозрачностью во время эмбрионального развития, что позволяет прямо проводить визуальный анализ органов и тканей, в том числе сердца. Несмотря на наличие только одного предсердия и одного желудочка, сердце зебры(рисунок 1) физиологически похоже на четырехкамерные сердца млекопитающих. Важно отметить, что частота сердечных приступов зебры, морфология электрокардиограммы и потенциальная форма действия напоминают формы людей больше, чем виды мурин2. Эти особенности сделали зебрафиш отличной моделью для сердечно-сосудистых исследований и обеспечили основные идеи в сердечное развитие3,4, регенерация5, и патологические условия1,,3,4, в том числе атеросклероз, кардиомиопатии, аритмии, врожденные пороки сердца, и амилоидный свет сердечной токсичности1,43,6. Оценка сердечной функции стала возможной на эмбриональной стадии (1-дневное послеоплодное) путем прямого видеоанализа с использованием высокоскоростной видеомикроскопии7,,8. Тем не менее, зебрафиш теряют прозрачность за эмбриональной стадии, ограничивая функциональные оценки нормальных зрелых сердец и поздних сердечных заболеваний. Чтобы преодолеть это ограничение, эхокардиография была успешно использована в качестве высокого разрешения, в режиме реального времени, неинвазивные альтернативы изображений для оценки функции сердца зебры взрослых9,10,11,12,13,14,15.

У зебры сердце расположено венцомально в грудной полости сразу же застежки с предсердием, расположенным в дорсе к желудочку. Атриум собирает венозную кровь из синусовой веносики и передает ее в желудочек, где он далее перекачивается в артериоз пулезного(рисунок 1). Здесь мы описываем физиологический, подводный протокол для оценки сердечной функции у взрослых зебры с помощью неинвазивной эхокардиографии с помощью линейного ультразвукового зонда с центральной частотой 50 МГц для Визуализации B-режима с разрешением 30 мкм. Так как ультразвуковые волны могут легко путешествовать через воду, сохраняя близость между рыбой и сканирующий зонд под водой обеспечивает достаточную контактную поверхность для обнаружения сердца без необходимости для ультразвукового геля и в целом менее напряженным для рыбы. Хотя альтернативные системы эхокардиографии зебры были зарегистрированы несколькими авторами9,12,13, здесь мы представляем общие и наиболее часто используемые установки, которая применяется к высокочастотной ультразвука у животных.

Метод позволяет с высоким разрешением изображения сердца взрослого зебры, отслеживание сердечных структур, а также количественное измерение пиковых скоростей от измерений кровотока доплеров. Мы показываем надежную виво-количественную оценку важных систолических и диастолических параметров, таких как фракция выброса (EF), изменение дробной области (FAC), скорость притока и оттока желудочков, частота сердечных приступов (HR) и сердечный выброс (CO). Мы вносим свой вклад в создание надежного диапазона нормальных здоровых взрослых зебры сердечных функциональных и размерных параметров, чтобы позволить более точное обследование патологических состояний. В целом, мы предоставляем надежный метод для оценки сердечной функции у зебры, которая оказалась чрезвычайно полезной в создании и проверке моделей болезни сердца зебры6,16, травмы сердца и восстановления10,13, и регенерации11,12, и может быть дополнительно использован для оценки потенциальных препаратов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, связанные с зебрафишами, были одобрены нашим Институциональным Комитетом по уходу за животными и эксплуатации и соответствуют Закону о защите животных Министерства сельского хозяйства США.

1. Экспериментальная настройка

  1. Настройка платформы для приобретения изображений
    1. Используя небольшие ножницы или скальпель сделать разрез на губку в положении 12 часов, чтобы держать рыбу во время сканирования. Поместите губку в стеклянный контейнер(рисунок 2A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Положение разреза должно позволить достаточно места для перемещения преобразователя, а также держать рыбу ниже линии воды, когда платформа наклонена для сканирования (Рисунок 2). Разрез может варьироваться в зависимости от размера рыбы; однако для стандартного размера и веса разрез должен составить примерно 2,5 см х 0,7 см х 0,5 см (длина, ширина и глубина соответственно). Стеклянный контейнер должен быть не менее 6 см глубиной, чтобы избежать утечки воды во время визуализации рыбы.
    2. Прикрепите стеклянную коробку, содержащую губку на ультразвуковой платформе, например, с помощью двусторонней ленты. Убедитесь, что стеклянная коробка находится в центре платформы и прочно прикрепляется(рисунок 2B).
    3. Наклоните платформу вперед около 30 ", используя ручку на левой стороне держателя платформы (Рисунок 2B). Заполните стеклянный квадрат 200-250 мл воды рыбной системы, содержащей 0,2 мг/мл трикатульфона (MS222).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трикаин может быть подготовлен в виде 4 мг/мл бульонного раствора в Tris 40 mM pH 7 и далее разбавлен до нужной концентрации в воде рыбной системы; 0,2 мг/мл было установлено, что лучшая концентрация16. Раствор из 4 мг/мл трикаина может храниться в течение длительного периода времени при -20 градусах Цельсия или при 4 градусах По области в течение одного месяца.
    4. Вставьте преобразователь в держатель микроманипулятора на работающую железнодорожную станцию, поворачивая выемку преобразователя к оператору. Держите массив параллельно земле с рабочей стороны продольной по отношению к сцене (см. Рисунок 2B). Оставьте достаточно места (10 см с обеих сторон) для теперь подключенной трансдуктер-железнодорожной системы для перемещения по x- и y-axes.
    5. Войти в программное обеспечение управления и выбрать мышь (малый) сосудистые. Создайте новое исследование, а также новую серию для каждого животного, включенного в исследование. Найдите новую кнопку исследования, расположенную в нижней левой части экрана, на странице браузера (представление начинается в B-режиме).

2. Обработка рыбы

ПРИМЕЧАНИЕ: Зебрафиш, используемых в этом исследовании были взрослые, 11-месячные самцы дикого типа штаммab/Tuebingen (AB/TU). Зебрафиш поддерживался в автономной системы протекать через аквариум на 28 градусов по Цельсию в постоянном световом цикле, установленном как 14 h свет/10 ч темно. Зебрафиш кормили два раза в день с рассолом креветки(Artemia nauplii) и сухих пищевых хлопьев.

  1. Используя рыбную сеть, перенесите рыбу в небольшой резервуар, содержащий системную воду с 0,2 мг/мл трикаина. Подождите, пока рыба полностью анестезируется (без движения и никакого ответа на ощупь).
  2. Используя пластиковую чайную ложку, аккуратно и быстро перенесите рыбу в стеклянную коробку, содержащую губку, в ранее сделанный разрез с брюшной стороной рыбы вверх.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что голова рыбы расположена к оператору (то же направление, как выемка преобразователя) и на несколько более высоком уровне по сравнению с остальной частью тела для достижения лучшей визуализации сердца.
  3. Аккуратно опустите преобразователь (сохраняя исходное положение) с помощью ручки на железнодорожной системе, поместив его продольно и близко к брюшной стороне рыбы с выемкой преобразователя, обращенной к оператору. Оставьте 2-3 мм (не более 1 см) клиренс от рыбы. Отрегулируйте платформу в отношении преобразователя с помощью микроманипулятора во всех 3 осях, пока сердце рыбы не будет визуализировано, а затем начать приобретение изображения. Угол преобразователя не должен изменяться в течение всего приобретения изображения(рисунок 2C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: До тех пор, пока существует достаточная близость (до 1 см), вода в верхней части рыбы обеспечит контактную поверхность через жидкое поверхностное натяжение, что позволяет передавать ультразвуковые волны между зондом и рыбой. Поэтому нет необходимости толкать преобразователя против рыбы. Попробуйте завершить этот шаг и закончить сканирование менее чем за 3 минуты, чтобы предотвратить гибель рыбы или снижение частоты сердечных сокращений во время приобретения изображения. При необходимости используйте таймер. Сердце может быть найдено на верхней стороне экрана к левой стороне глаза, которая может быть легко визуализирована при перемещении x-оси вплоть до правой. Если есть постоянные трудности в поиске сердца в то время как в B-Mode, переключиться на цвет Доплера режиме, который позволит для отслеживания кровотока (красный указывает крови течет к оператору) и размещения сердца.

3. Приобретение изображения

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Таблицу Материалов для системы визуализации и программного обеспечения для анализа изображений.

  1. Продольное представление B-Mode
    1. После локализации сердца, выберите или остаться в B-Mode (находится в нижней левой стороне сенсорного экрана после начала новой серии) и уменьшить поле для того, чтобы увеличить и присмотреться к сердцу для облегчения отслеживания во время анализа.
    2. Для того, чтобы иметь более четкое и четкое представление о сердце в b-Mode приобретение изображения, уменьшить поле путем увеличения дюйма Используйте сенсорный экран, чтобы вручную сузить поле на обоих x- и y-axes.
    3. При необходимости увеличьте качество/контраст изображения, установив динамический диапазон до 45-50 дБ. Перейдите к элементам управления B-режимом в опции More Controls и затем сохраните изменение в пресетах режима. Нажмите режим пресетов, чтобы выбрать оптимизированную настройку приобретения изображения каждый раз, прежде чем начать изображение новой серии.
    4. Возьмите столько изображений, сколько пожелает в длинной плоскости оси, выбрав Сохранить изображение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию и учебные ресурсы по приобретению изображений можно найти в https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab и https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
  2. Продольное представление Импульсная волна
    1. Переключитесь на Color Doppler для обнаружения кровотока (выберите кнопку Color) и приобретения (найден в нижней левой части сенсорного экрана после начала новой серии).
    2. Используя положение сенсорного экрана, квадрант поверх атриовентрикулярного клапана и локализуйте приток, который будет отличаться красным цветовым сигналом(рисунок 3А). Сократите площадь квадранта как можно больше, чтобы увеличить частоту кадров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нижняя цвет импульсно-повторение-частота (Цвет PRF) (диапазон скорости), чтобы обеспечить желтый цвет можно увидеть в профиле скорости изображения Цвет доплера. Это увеличит диапазон скоростей, которые можно увидеть, и поможет создать мозаику цвета, которая позволит более четко визуализировать пиковые скорости.
    3. Активировать импульсную волну (выберите PW) Доплеровский режим для образца скорости притока желудочковой крови. Расположите ворота объема образца в центре атриовентрикулярного клапана (где красный цветной сигнал становится более желтоватым), чтобы определить максимальную скорость потока. Отрегулируйте угол PW на экране с помощью пальцев, чтобы он выравнивался в направлении притока крови. Нажмите начать или обновить, чтобы начать выборку скорости крови, поступающей в желудочек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что угол правильной линии параллельно кровоток для того, чтобы обеспечить последовательные и воспроизводимые результаты. Размещение правильной линии угла, чтобы она соответствовала направлению кровотока, гарантирует точное захват скорости.
    4. Повторите шаг 3.2.3 для определения скорости оттока, разместив квадрант Color Doppler на стыке желудочка и луковицы (буллювентрикулярный клапан) и локализуйте поток, который будет отличаться сигналом синего цвета(рисунок 3B). Расположите ворота объема образца прямо перед соединением желудочка-бульбуса и отрегулируйте линию коррекции угла в соответствии с направлением кровотока.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как упоминалось ранее, для достижения точных значений скорости, убедитесь, что угол PW выравнивается с кровотоком.
    5. Отрегулируйте исходную линию (бар), опустив или подняв ее в панели скорости потока, чтобы полностью обнаружить и отследить пики сигнала(рисунок 3C,D). Определите пики притока в верхнем/положительном квадранте (сигнал, идущий к зонду) и пики оттока в нижнем/отрицательном квадранте (сигнал, уходящий от зонда).

4. Восстановление рыбы

  1. Как только приобретение изображения завершено, используя чайную ложку, передать рыбу в регулярную систему атерированную воду без трикаина и пусть рыба восстановить (обычно занимает от 30 с до 2 минут, чтобы возобновить движение жаберных и плавание).
  2. Чтобы помочь восстановлению, шприц воды неоднократно над жабры с помощью передачи пипетки для содействия аэрации воды и кислорода передачи.

5. Анализ изображений

  1. Откройте программное обеспечение для анализа изображений.
  2. Выберите изображение и нажмите на значок обработки изображений(рисунок 4). Используя имеющуюся шкалу(рисунок 4),отрегулируйте яркость и контрастность изображения, чтобы обеспечить четкую визуализацию стенок желудочков или шаблонкровного потока.
  3. Используя изображение B-режима, откройте выпадающий список из PSLAX (парастернальной длинной оси) вариант на сердечный пакет / измерения (Рисунок 4). Выберите LV след и проследить желудочковой внутренней стенки в систолы и диастолии для получения желудочковой области (VA) в систоле (VAs) и диастоле (VAd), конец диастолического объема (EDV), и конец систолического объема (ESV) (Рисунок 5A, B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значения объема экстраполируются из отслеживания 2D-изображений и могут отклоняться от 3D-сущности. Для всех измерений, в среднем по крайней мере 3 репрезентативных сердечных циклов на одно животное.
  4. Обратите внимание на объем хода и фракцию выброса, которые будут автоматически вычисляться и отображаться программным обеспечением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем хода и фракция выброса также могут быть вычисляться вручную с помощью формул
    СВ и EDV-ESV
    ЭФ -З. (EDV-ESV)/EDV
    где SV является объем инсульта, EDV является конец диастолический объем, ESV конец систолического объема, и EF является выброс фракции
  5. Рассчитайте изменения дробной области с помощью формулы
    FAC = (VAd - VAs)/ VAd
    где FAC является дробное изменение области, VAd является желудочковой области в диастоле, и VAs является желудочковой области в систоле.
  6. Рассчитайте сердечный выход с помощью формулы
    CO и HR x SV
    где CO является сердечный выход, HR частота сердечных приступов, и SV является объем инсульта
  7. Используя изображение Pulsed Wave Doppler Mode, измерьте скорость притока крови, выбрав опцию MV Flow под сердечным пакетом (рисунок 4). Выберите E или A для ранней диастолы и поздней диастолы, соответственно, и определите пиковые скорости на графике(рисунок 3C).
  8. Измерьте скорость оттока крови, выбрав AoV Flow и определите пики на трассировке(рисунок 3D).
  9. Измерьте частоту сердечных приступов с помощью 2 различных методологий для более надежной оценки:
    1. Когда сердце визуализировано на экране во время приобретения изображения, подсчитайте удары в пределах 10 с и умножьте их на 6.
    2. Используя изображение Pulse Wave Doppler на программном обеспечении Vevo LAB, выберите кнопку частоты сердечных приступов и интервалы трассировки между 3 последовательными пиками аортального потока(рисунок 4 и рисунок 6).
    3. Для экспорта данных в электронную таблицу после того, как прослеживается LV и пики кровотока, нажмите на отчет и экспорт и сохранить, как excel.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Описанный протокол позволяет измерять важные сердечные мерные и функциональные параметры, аналогичные технике, используемой в эхокардиографии человека и животных. B-Mode изображения позволяют отслеживания желудочковой внутренней стенки в систолы и диастолы(Рисунок 5) и получения размерных данных, таких как камеры и стены размеры, и функциональные данные, такие как частота сердечных ударов, объем инсульта, и сердечный выход, а также параметры желудочковой сист...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы описываем систематический метод эхокардиографической визуализации и оценки сердечной функции у взрослых зебры. Эхокардиография является единственным доступным неинвазивным и наиболее надежным методом для живой взрослой рыбы сердечной визуализации и функционального анализа, и она становится все более популярным в зебрафиш сердечно-сосудистых исследований. Время, необходимое, является коротким и позволяет высокой пропускной и продольной исследований. Вместе с тем существуют значительные различия в используемой методолог...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Фреда Робертса за техническую поддержку и пересмотр рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Двусторонняя лента
Сетка
для рыбы Стеклянный контейнер - 100 дюймов Высокочастотный
преобразовательFujifilm/VisualSonicsMX700Ширина полосы 29-71 МГц, Центральная передача 50 МГц, Осевое разрешение 30 и микро; м
Пластиковая чайная ложка
Скальпель или ножницы
Маленькие аквариумы
Губка (кухонная губка)
Переводная пипетка (градуированная 3 мл)Samco Scientific212
Tricaine (MS-222)Sigma-AldrichA5040
Vevo 3100 Система формирования изображений и станция формирования изображенийFujifilm/VisualSonics
Vevo LAB sofware v 1.7.1Fujifilm/VisualSonics

Ссылки

  1. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
  2. Verkerk, A. O., Remme, C. A. Zebrafish: a novel research tool for cardiac (patho)electrophysiology and ion channel disorders. Frontiers in Physiology. 3, 255(2012).
  3. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular research. 91 (2), 279-288 (2011).
  4. Poon, K. L., Brand, T. The zebrafish model system in cardiovascular research: A tiny fish with mighty prospects. Global Cardiology Science and Practise. 2013 (1), 9-28 (2013).
  5. Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
  6. Mishra, S., et al. Zebrafish model of amyloid light chain cardiotoxicity: regeneration versus degeneration. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (5), H1158-H1166 (2019).
  7. Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish. Physiologycal Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).
  8. Mishra, S., et al. Human amyloidogenic light chain proteins result in cardiac dysfunction, cell death, and early mortality in zebrafish. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 305 (1), H95-H103 (2013).
  9. Ernens, I., Lumley, A. I., Devaux, Y., Wagner, D. R. Use of Coronary Ultrasound Imaging to Evaluate Ventricular Function in Adult Zebrafish. Zebrafish. 13 (6), 477-480 (2016).
  10. González-Rosa, J. M., et al. Use of Echocardiography Reveals Reestablishment of Ventricular Pumping Efficiency and Partial Ventricular Wall Motion Recovery upon Ventricular Cryoinjury in the Zebrafish. PLoS One. 9 (12), (2014).
  11. Huang, C. C., Su, T. H., Shih, C. C. High-resolution tissue Doppler imaging of the zebrafish heart during its regeneration. Zebrafish. 12 (1), 48-57 (2015).
  12. Kang, B. J., et al. High-frequency dual mode pulsed wave Doppler imaging for monitoring the functional regeneration of adult zebrafish hearts. Journal of the Royal Society Interface. 12 (103), (2015).
  13. Lee, J., et al. Hemodynamics and ventricular function in a zebrafish model of injury and repair. Zebrafish. 11 (5), 447-454 (2014).
  14. Sun, L., Lien, C. L., Xu, X., Shung, K. K. In Vivo Cardiac Imaging of Adult Zebrafish Using High Frequency Ultrasound (45-75 MHz). Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (1), 31-39 (2008).
  15. Wang, L. W., Kesteven, S. H., Huttner, I. G., Feneley, M. P., Fatkin, D. High-Frequency Echocardiography- Transformative Clinical and Research Applications in Humans, Mice, and Zebrafish. Circulation Journal. 82 (3), 620-628 (2018).
  16. Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Models & Mechanisms. 10 (1), 63(2017).
  17. Lee, L., et al. Functional Assessment of Cardiac Responses of Adult Zebrafish (Danio rerio) to Acute and Chronic Temperature Change Using High-Resolution Echocardiography. PLOS ONE. 11 (1), e0145163(2016).
  18. Genge, C. E., et al. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. Nilius, B., et al. 171, Springer International Publishing. 99-136 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Эхокардиография рыб-зебраоценка сердечной функциивзрослые рыбы-зебранеинвазивная визуализацияизмерение частоты сердечных сокращенийанализ ударного объемаколичественное определение сердечного выбросарасчет фракции выбросацветовое допплеровское картирование
Высокочастотная ультразвуковая эхокардиография для оценки сердечной функции зебры
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.