Методическая статья

В Ситу Обнаружение Рибонуклеопротеин комплекс сборки в C. elegans Germline с использованием Близость Ligation Анализ

DOI:

10.3791/60982

⸱

5 мая 2020 г.

 ,  , 
1Division of Biological Sciences, University of Montana

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол демонстрирует использование проверки перевязки близости для зондирования белково-белковых взаимодействий на месте в зародышевой линии C. elegans.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание того, когда и где происходят белково-белковые взаимодействия (PPI), имеет решающее значение для понимания функции белка в клетке и как затрагиваются более широкие процессы, такие как развитие. Зародышевой линии Caenorhabditis elegans является отличной модельной системой для изучения ИЦП, которые связаны с регулированием стволовых клеток, мейозом и развитием. Существуют различные хорошо разработанные методы, которые позволяют белки, представляющие интерес быть помечены для распознавания стандартными антителами, что делает эту систему выгодной для анализа перевязки близости (PLA) реакций. В результате НОАК может показать, где ИЦП происходят пространственным и временным образом в зародышевых чертах более эффективно, чем альтернативные подходы. Описано здесь протокол для применения и количественной оценки этой технологии для зондирования ИЦП в Зародыше C. elegans.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Более 80% белков, по оценкам, имеют взаимодействия с другими молекулами1, что подчеркивает, насколько важны ИЦП для выполнения конкретных биологических функций в клетке2. Некоторые белки функционируют как концентраторы, облегчающие сборку более крупных комплексов, необходимых для выживания клеток1. Эти концентраторы посредничают в нескольких ИЦП и помогают организовать белки в сеть, которая облегчает конкретные функции в ячейке3. Формирование белковых комплексов также зависит от биологического контекста, такого как наличие или отсутствие конкретных взаимодействующих партнеров4,события клеточной сигнализации и стадия развития клетки.

C. elegans обычно используется в качестве образцового организма для различных исследований, включая развитие. Простая анатомия этого животного состоит из нескольких органов, в ключая гонад, кишечник и прозрачную кутикулу, которая облегчает анализ развития червя. Зародышевая линия, проживающая в гонаде, является отличным инструментом для изучения того, как зародышевые стволовые клетки созревают в гаметы5, которые превращаются в эмбрионы и, в конечном итоге, следующее поколение потомства. Дистальная область кончика зародышевой линии содержит пул самообновляющихся стволовых клеток(рисунок 1). Как стволовые клетки покидают нишу, они прогрессируют в мейотический пахитен и в конечном итоге превращаются в яйцеклетки в стадии молодых взрослых (Рисунок 1). Эта программа развития в зародышевой плотно регулируется с помощью различных механизмов, в том числе после транскрипционной регуляторной сети при содействии РНК-связывающих белков (RBPs)6. ИЦП имеют важное значение для этой регулятивной деятельности, поскольку ОРП связываются с другими кофакторами для осуществления своих функций.

Есть несколько подходов, которые могут быть использованы для зондирования Для ИЦП в червя, но каждый из них имеет уникальные ограничения. In vivo immunoprecipitation (IP) может быть использован для изоляции белково-белковых комплексов из экстрактов цельного червя; однако этот подход не указывает, где происходит ИЦП у червя. Кроме того, белковые комплексы, которые являются преходящими и только образуются на определенном этапе развития или в ограниченном количестве клеток может быть трудно восстановить путем совместного иммунопреципции. Наконец, IP-эксперименты должны решать проблемы белкового комплекса reassortment после лиза и неспецифического удержания белков на матрице сродства.

Альтернативными подходами к обнаружению ИЦП на месте являются совместное иммуносохранение, рецензирование фюрстерской резонансной передачи энергии (ФРЭТ) и бимолекулярная флуоресценция (BiFC). Совместное иммуностоирование опирается на одновременное обнаружение двух белков, представляющих интерес для фиксированной ткани червя, и измерение степени колокализации сигнала. Использование микроскопии сверхразрешения, которая предлагает более подробную информацию, чем стандартная микроскопия7,помогает более строго проверить колокализацию белка за пределами дифракционно-ограниченного барьера 200-300 нм8. Тем не менее, совместное иммуноскопии с использованием как обычных, так и супер-разрешение микроскопии лучше всего подходит для белков с четко определенными шаблонами локализации. В отличие от этого, он становится гораздо менее информативным для диффузно распределенных взаимодействующих партнеров. Измерение для совместной локализации сигналов на основе перекрытия не дает точной информации о том, являются ли белки в комплексе друг с другом9,,10.

Кроме того, совместное иммунопрецитификации и совместное иммуно-дентинирование белково-белковых комплексов не являются количественными, что затрудняет определение того, являются ли такие взаимодействия значительными. FRET и BiFC являются методами флуоресцентной основе. FRET опирается на пометки белков, представляющих интерес с флуоресцентными белками (FPs), которые имеют спектральное перекрытие, при котором энергия от одного FP (донор) передается другому FP (приемору)11. Эта нерадиационная передача энергии приводит к флуоресценции принимающего FP, которые могут быть обнаружены на соответствующей длине волны выбросов. BiFC основан на восстановлении флуоресцентного белка in vivo. Это влечет за собой разделение GFP на два дополнительных фрагмента, таких как сиксы 1-10 и сугнишие 1112, которые затем сливается с двумя белками, представляющими интерес. Если эти два белка взаимодействуют, дополнительные фрагменты GFP становятся достаточно близкими в непосредственной близости к разить и собрать, воскворуя фторфор GFP. Восстановленный GFP затем непосредственно наблюдается как флуоресценция и указывает, где иЦП произошло.

Таким образом, как FRET и BiFC зависит от больших флуоресцентных тегов, которые могут нарушить функцию помечены белка. Кроме того, FRET и BiFC требуют обильного и сопоставимого выражения помеченных белков для получения точных данных. FRET не может быть пригодным для экспериментов, где один партнер превышает другой, что может привести к высокому фону13. Следует также избегать переэкспрессии в экспериментах BiFC, так как это может вызвать неспецифическую сборку14, что приводит к увеличению фона. Оба метода требуют оптимизации экспрессии и условий визуализации помеченных белков, что может продлить время, необходимое для завершения экспериментов.

Перегоняемая близость анализа (PLA) является альтернативным подходом, который может решить ограничения методов, упомянутых выше. НОАК использует первичные антитела, которые распознают белки, представляющие интерес (или их теги). Эти первичные антитела затем связаны вторичными антителами, содержащими олигонуклеотидные зонды, которые могут гибридизироваться друг с другом, когда в пределах 40 нм (или короче) расстояние15. В результате гибридизированная ДНК усиливается через реакцию ПЦР, которая обнаруживается зондами, которые дополняют ДНК. Это приводит к foci, которые визуализированы микроскопом. Эта технология может обнаружить ИЦП на месте в сложных тканях (т.е. червь гонад), который организован как сборочная линия, содержащая клетки на различных стадиях развития и дифференциации. С PLA, ИЦП могут быть непосредственно визуализированы в фиксированной гонад червя, что выгодно для расследования ли ИЦП происходят на определенном этапе развития. НОАК предлагает более четкое разрешение ИЦП в отличие от анализов на основе совместной локализации, что идеально подходит для проведения точных измерений. При использовании микроскопия сверхразрешения может обеспечить более подробную информацию о местонахождении очагов PLA в клетке. Еще одним преимуществом является то, что фокусы, возникающие в результате реакций НОАК, могут быть подсчитаны по рабочему процессу на основе анализа ImageJ, что делает этот метод количественным.

Семейство световых цепей dynein было впервые описано как подразделение динейнского моторного комплекса16 и предположило, что служит грузовым адаптером. С момента своего первого открытия, LC8 был найден в нескольких белковых комплексов в дополнение к динейн моторный комплекс17,18,19,20. Сканирование для белковыхпоследовательностей,которые содержат мотив взаимодействия LC819 предполагает, что LC8 может иметь много взаимодействий с широким спектром различных белков17,18,19,20,21,22. В результате, LC8 семейные белки в настоящее время считаются концентраторами, которые помогают содействовать сборке больших белковых комплексов19,,22, таких как сборки внутренне неупорядоченных белков21.

Один C. elegans LC8-семейный белок, динеин световой цепи-1 (DLC-1), широко выражается во многих тканях и не обогащается в конкретных подклеточных структурах23,24. Следовательно, выявление биологически значимых партнеров in vivo DLC-1 в C. elegans является сложной задачей по ряду причин: 1) совместное иммунопрецитность не указывает источник ткани, где происходит взаимодействие; 2) ограниченное выражение конкретных партнеров или переходных взаимодействий может препятствовать способности обнаруживать взаимодействие путем совместного иммунопреципции; и 3) диффуза распределения DLC-1 приводит к неспецифическому совпадению с потенциальными белками партнера путем совместного иммуносохранения. Основываясь на этих проблемах, PLA является идеальным подходом для тестирования взаимодействия in vivo с DLC-1.

Ранее сообщалось, что DLC-1 напрямую взаимодействует и служит кофактором для РНК-связывающих белков (RBPs) FBF-223 и GLD-125. Наша работа поддерживает модель DLC-1, выступающей в качестве концентратора белка и предполагает, что DLC-1 облегчает взаимодействие сети, которая охватывает за dynein19,22. Используя GST выпадение ассс, новый DLC-1-взаимодействующих RBP имени OMA-1 был определен26. OMA-1 имеет важное значение для роста яйцеклеток и мейотического созревания27 и функционирует в сочетании с рядом переводческих репрессаторов и активаторов28. В то время как FBF-2 и GLD-1 выражены в стволовых клетках и мейотических областях пахитена, соответственно, OMA-1 диффузно выражается в зародыше из мейотического пахитена через яоциты27 (Рисунок 1). Это говорит о том, что DLC-1 формирует комплексы с ОДП в разных регионах гонада. Было также установлено, что прямое взаимодействие между DLC-1 и OMA-1 наблюдается in vitro не восстанавливается in vivo IP. НОАК была успешно использована в качестве альтернативного подхода для дальнейшего изучения этого взаимодействия в Зародышевой линии C. elegans, и результаты показывают, что НОАК может быть использован для зондирования многих других ИЦП у червя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует штаммы C. elegans, в которых помечены потенциальные взаимодействующие партнеры. Настоятельно рекомендуется использовать отрицательный контрольный штамм, в котором один помеченный белок не должен взаимодействовать с другим помеченным партнером по взаимодействию кандидата. Здесь, GFP только был использован в качестве отрицательного контроля для оценки фона, как DLC-1 не ожидается, взаимодействовать с GFP в червя. В качестве экспериментального штамма использовалась пометка ГФП OMA-1, поскольку предварительные данные свидетельствуют о взаимодействии с DLC-1. Штаммы Nematode, совместно выражающие контроль и тестовые белки с 3xFLAG-тегами DLC-1, упоминаются в этом тексте как 3xFLAG::DLC-1; GFP и 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (напряжения доступны по запросу; более подробная информацияв таблице материалов), соответственно. Здесь используются теги 3xFLAG и GFP; однако, другие метки могут быть заменены до тех пор, пока их антитела совместимы с реагентами комплекта НОАК.

1. Уход за животными

  1. Держите червей на пластинах роста нематод (NGM), которые посеяны с штаммом OP50 кишечной палочки и поддерживать на уровне 24 градусов по Цельсию для оптимального выражения GFP.
  2. Проход взрослых червей каждые 2-3 дня для распространения червей и держать их сытыми.

2. Подготовка синхронной культуры

  1. Синхронизируйте червей, отбеливая тарелку сытых, гравидных гермафродитов. Протокол отбеливания описан в Porta-de-la-Riva et al.29. Пусть эмбрионы люк на ночь в центрифуге трубки при 24 градусах По Цельсию при повороте конца над концом в 10 мл M9 минимального медиа (M9) буфера. Это создасти культуру арестованных личинок L1.
  2. Инкубировать трубку арестованных личинок l1 стадии на льду в течение 10 минут, а затем довершение трубки с холодным 1x M9.
  3. Используйте центрифугу, чтобы гранулы личинки на 600 х г в течение 5 мин при 4 c. Тщательно аспирируйте супернатант так, чтобы оставалось только 1-2 мл супернатанта.
  4. Повторно приостановить гранулы личинок и использовать микропайпет для передачи 2 Зл подвесной культуры личинок на стеклянную горку. Подсчитайте, сколько личинок присутствуют, чтобы определить плотность культуры личинок, которые помогут направлять посев червей в шаге 2.5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность 10-15 l1 личинок /1 Л хорошо работает для посева.
  5. Используйте микропипетт для передачи объема культуры личинок, необходимых для семени примерно 100-120 L1 этап личинок на 60 мм OP50 пластины. Например, семена 10 зл культуры личинок, плотность которого составляет 10 l1 личинок/1 л культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышать объем 40 qL для семени личинок, или избыток жидкости будет нарушать OP50 газон. Если объем культуры превышает 40 кл,5, повторите шаги 2.3-2.4 для дальнейшего уменьшения объема и увеличения плотности культуры личинок.
  6. Выращивайте червей при 24 градусах Цельсия. Запишите время, когда L1s посеяны на тарелке и периодически проверяйте стадию разработки, чтобы определить идеальное время для вскрытия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На 52 h после посева L1s, черви культивируется на 24 КС, как правило, в стадии молодых взрослых, что является идеальной стадией для вскрытия для гонад-целевых PLA. Однако фактическое время, когда синхронизированные черви достигают стадии молодых взрослых, может варьироваться между штаммами и температурой инкубации.

3. Рассечение/гонадная экструзия

ПРИМЕЧАНИЕ: Рассечение, чтобы выдыхать гонад, необходимо для того, чтобы PLA, нацеленная на гонад, успешно работала. Этот подход может также выпустить эмбрионы, которые также работают с использованием этого протокола для НОАК (см. Обсуждение для получения дополнительной информации). После вскрытия, как отрицательный контроль и экспериментальные образцы фиксируются и обрабатываются для НОАК вместе параллельно. Предлагается также подготовить дополнительный набор образцов для флуоресцентного коиммунотирования23 для демонстрации моделей экспрессии белковых партнеров, представляющих интерес.

  1. Выберите 30-40 молодых взрослых червей в стеклянную тарелку, содержащую 500 зл 1x M9 и левамизол (2,5 мМ конечной концентрации). После сбора червей, тщательно удалить и отбросить большинство средств массовой информации, чтобы удалить бактерии, которые передаются вместе с червями.
  2. Добавить в свежие 500 л л 1x M9 и levamisole и использовать пипетку, чтобы аккуратно составить и обойтись средства массовой информации для промывки червей. Тщательно удалить и отбросить большинство средств массовой информации, чтобы очистить бактерии, которые передаются вместе с червями.
    1. Повторите этот шаг 2x-3x, пока все бактерии не будут удалены. После стирки завершены, оставьте червей примерно в 100 л носителей, чтобы держать гидратированных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте червям сидеть в средствах массовой информации дольше, чем 7 мин, так как это ухудшит экструзию гонад во время вскрытия. Выполните стих под помощью рассекающего микроскопа для мониторинга удаления носителей, чтобы черви не терялись.
  3. Используя стеклянный или полиэтиленовый пипетка, перенесите червей на микроскоп 25 мм x 75 мм, покрытый 0,001% поли-л-лизином (слайды, используемые в этой процедуре, имеют эпоксидно-покрытый периметр, оставляя три рабочих места, 14 мм х 14 мм каждый). Удалите избыток носителей так, чтобы оставалось примерно 10-15 л носителей.
  4. Под помощью рассекающего микроскопа и с помощью двух игл калибровочных 261 х 2, поместите одну иглу над другой так, чтобы концы образуют ножницы. Используя иглы ориентированных таким образом, вырезать червей за глотки, чтобы освободить зародыши. Вскрыть все черви в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию о том, как выполнять вскрытия можно найти в предыдущей публикации Gervaise и Arur30.
  5. После того, как все черви расчленены, аккуратно поместите 22 мм х 40 мм крышкой над слайдом так, чтобы он перпендикулярно слайду. Концы крышки должны свисать с слайда.
  6. Заморозить слайды на предварительно охлажденной алюминиевой блок поддерживается на сухом льду, по крайней мере 20 мин. Аккуратно поместите охлажденный карандаш на верхней части крышки, чтобы предотвратить coverslip стать свободным из-за расширения льда.

4. Фиксация/блокировка

  1. Когда готовы к фиксации, откинуть крышки с карандашом или другим тупым краем инструмент и немедленно окунуть слайд в банку, содержащую свежий, ледяной метанол (охлажденный до -20 градусов по Цельсию) в течение 1 мин.
  2. Аккуратно протрите края слайда, которые окружают образец, так что следующий реагент удерживается поверхностным натяжением вокруг образца. Нанесите 150 кл фиксатора (2% формальдегида в 100 мМ KH2PO4, рН 7,2) в течение 5 мин на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы также протестировали процедуру фиксации метанола/ацетона31,32 и обнаружили, что она совместима с реакцией НОАК.
  3. Прикоснитесь к слайду с бумажным полотенцем под перпендикулярным углом 90 градусов, чтобы фиксатор убежал с горки и впитывался в бумажное полотенце. Блок слайды 2x в течение 15 минут на RT в коплин банку с 50 мл 1x PBS/1% Тритон X-100/1% бычьей сыворотки альбумина (PBT/BSA).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коплин банки или другие виды окрашивания банки рекомендуются для этого блокирующего шага и стирки шаги ниже в разделах 6-9. Они обеспечивают достаточные объемы для эффективного обмена блокированием или мытьем буфера с образцом.
  4. Блок слайды с раствором PBT/BSA, содержащим 10% нормальную козью сыворотку. Аккуратно протрите края, которые окружают слайд и применить 100 зл и раствора на слайде. Инкубировать 1 ч на RT во влажной камере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг настоятельно рекомендуется для окрашивания с первичными антителами ЗФЛАГ. Влажная камера построена путем обеспечения стеклянных пипетки с лентой в лоток для слайдов, чтобы лежать на, как они инкубируют. Смоченные салфетки задачи(Таблица материалов) помещаются в лоток, чтобы поднять внутреннюю влажность лотка, чтобы предотвратить испарение. Крышка и лоток покрыты фольгой, чтобы защитить образцы от света во время светочувствительных шагов.
  5. Поместите слайд на бумажное полотенце, чтобы PBT/BSA/10%NGS решение убежать слайд и аккуратно протрите края слайда. Используйте блокирующий реагент(Таблица материалов) для блокирования слайдов. Нанесите одну каплю на пространство 14 мм x 14 мм. Инкубировать слайды для 1 ч при 37 градусах по Цельсию во влажной камере.

5. Первичная инкубация антител

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения лучших результатов НОАК и минимального фона, фактор разбавления первичных антител может потребовать оптимизации (подробнее см. Обсуждение). Кроме того, первичные антитела должны быть подняты в различных хостах, которые соответствуют специфике вторичных антител, используемых для НОАК.

  1. Поместите слайд на бумажное полотенце, чтобы блокирующий реагент убежал с горки и аккуратно протрите края. Используйте разбавитель антител(Таблица материалов)для разбавления первичных антител. Нанесите 40 зл первичного раствора антитела на 14 мм х 14 мм пространства.
  2. Инкубировать слайды во влажной камере на ночь при 4 градусах Цельсия.

6. Зонд НОАК (вторичное антитело) инкубации

ПРИМЕЧАНИЕ: Для шагов 6-9 используйте буферы для мытья A и B на RT. Если буферы хранятся при 4 градусах Цельсия, то дайте им подогреть RT перед использованием.

  1. Вымойте слайды 2x в течение 5 минут с 50 мл 1x мыть буфера А (Таблица материалов) на RT в банку Коплин. Установите банку Коплин на орбитальный шейкер установлен до 60 об /мин.
  2. Поместите слайд на бумажное полотенце, чтобы мыть буфер бежать слайд и осторожно протрите края. Подготовьте раствор 40 л, содержащий зонды PLUS и MINUS (разбавленные 1:5 с разбавителем антител). Нанесите раствор на каждый 14 мм х 14 мм пространства.
  3. Инкубировать слайды во влажной камере на 1 ч при 37 градусах Цельсия.

7. Лигация

  1. Вымойте слайды 2x в течение 5 минут с 50 мл 1x мыть буфера а на RT в банку Коплин. Установите банку Коплин на орбитальный шейкер установлен до 60 об /мин.
  2. Разбавить буфер перевязки(Таблица материалов) 1:5 с ультрачистой водой. Используйте этот буфер, чтобы разбавить лигазу(Таблица материалов) 1:40 для подготовки рабочего запаса раствора перевязки.
    1. Поместите слайд на бумажное полотенце, чтобы буфер для мытья убежал от горки и аккуратно протрите края. Нанесите 40 л раствора перевязки на каждый 14 мм х 14 мм пространства.
  3. Инкубировать слайды во влажной камере в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия.

8. Усиление

ПРИМЕЧАНИЕ: Использование обнаружения реагентов с красными фторофорами(Таблица материалов) приводит к наименьшему количеству фона в ткани C. elegans.

  1. Вымойте слайды 2x в течение 5 минут с 50 мл 1x мыть буфера а на RT в банку Коплин. Установите банку Коплин на орбитальный шейкер установлен до 60 об /мин.
  2. Разбавить усиление красного буфера(Таблица материалов) 1:5 с ультрачистой водой. Используйте этот буфер, чтобы разбавить полимеразу(Таблица материалов) 1:80, чтобы подготовить рабочий запас раствора усиления и защитить от света.
    1. Поместите слайд на бумажное полотенце, чтобы буфер для мытья убежал от горки и аккуратно протрите края. Нанесите 40 зл имулятельного раствора на каждый 14 мм х 14 мм пространства.
  3. Инкубировать слайды во влажной камере в течение 1 ч и 40 мин при 37 градусах Цельсия. Убедитесь, что влажная камера покрыта фольгой, чтобы защитить образцы от света.

9. Окончательные смывы

  1. Вымойте слайды 2x в течение 10 минут с 50 мл 1x мыть буфер B (Таблица материалов) на RT в банку Коплин. Установите банку Коплин на орбитальный шейкер установлен до 60 об /мин.
  2. Вымойте слайды 1x в течение 1 мин с 50 мл 0,01x мыть буфер B на RT в банку Коплин. Установите банку Коплин на орбитальный шейкер установлен до 60 об /мин. Этот буфер готовится путем разбавления буфера для мытья B ультрачистой водой.

10. Монтаж coverslip

  1. Пусть избыточный буфер мытьбежать слайд на бумажное полотенце и стереть любой остаточный буфер, оставшийся на эпоксидно-покрытом периметре слайда.
  2. Добавьте 10 злителк монтажной среды(Таблица материалов)в образец и аккуратно положите наверх крышку, что позволит для монтажной среды распространиться.
  3. Краска вокруг края крышки с лаком для ногтей, чтобы запечатать coverslip и слайд. Будьте нежны с применением лака для ногтей, чтобы избежать перемещения coverslip, который повредит зародыши. Пусть лак для ногтей затвердеть, по крайней мере 20 мин на RT, в то время как слайды защищены от света, перед просмотром его под микроскопом.
  4. Храните слайды в темном контейнере или держателе слайда, так как образцы с маркировкой PLA светочувствительны. Производитель предлагает, чтобы слайды можно хранить при -20 градусов для длительного хранения или при 4 градусах Цельсия для кратковременного хранения. Слайды, подготовленные с помощью этого протокола, продлятся не менее 2 месяцев при хранении при 20 градусах Цельсия.

11. Приобретение изображений

  1. Для количественной оценки используйте конфокальный микроскоп для захвата изображений экструдированных зародышевых существ, которые находятся на ясном виду, неповреждены и беспрепятственны. Захват z-стек зародышевой линии, которая охватывает всю зародышную линию в z-плоскости и создайте максимальное проекционное изображение для использования для количественной оценки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конфокальная микроскопия идеально подходит для получения и количественной оценки изображений PLA с меньшим фоном по сравнению с теми, которые получены с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.
    1. Если зародышевая линия не вписывается в одно поле зрения, захватывайте перекрывающиеся поля зрения по мере необходимости для изображения всей зародышевой линии. Максимальные проекции этих изображений могут быть сшиты вместе в FIJI.
  2. Убедитесь в том, чтобы условия изображения были одинаковыми между контрольными и экспериментальными образцами, чтобы установить справедливый и надлежащий порог для идентификации очагов во время анализа изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запись по крайней мере 8-10 зародышевых линий из каждого образца на реплику для облегчения статистического анализа количественной оценки НОАК. По крайней мере три биологические репликации рекомендуется для НОАК для получения надежных и последовательных количественных результатов.

12. Анализ изображений и количественная оценка с использованием FIJI/ImageJ

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий рабочий процесс основан на изображениях, полученных с помощью 40x цели на конфокальном микроскопе, в котором изображения сохраняются в формате .czi. Эти изображения .czi и сопровождающие их метаданные, включая размеры, могут быть доступны и открыты в FIJI/ImageJ для дальнейшего анализа. Следует проверить, принимает ли FIJI формат конфокальных файлов из конфокального файла, доступного конкретному пользователю. Если нет, то изображения в формате .tiff могут быть использованы в качестве альтернативы для анализа, но пользователю необходимо установить масштаб изображения вручную в FIJI/ImageJ (Анализ Установить масштаб). Рекомендуется сначала проанализировать все отрицательные контрольные изображения, чтобы установить уровень фона.

  1. Начните процесс анализа, сначала проанализировав все отрицательные контрольные изображения, а затем перейдите к экспериментальным образцам. Откройте максимальное проекционное изображение в FIJI/ImageJ для анализа(рисунок 2A). При использовании файла .czi будет предложено поле для опций импорта Bio-Formats.
    1. Включите следующие варианты, чтобы открыть изображение: просмотреть стек с data Browser; цветовой режим - Цветные. Окно с изображением теперь должно открываться с помощью панели слайдов для переключения между различными каналами, захваченными confocal (например, DAPI или PLA).
    2. Если изображения должны быть сшиты, создайте дубликаты каждого канала с каждого изображения, правильно выбрав изображение с помощью мыши и выбрав Duplicate, чтобы открыть дубликат окна. Укажите только номер канала (c), который соответствует каналу PLA или DAPI (например, 2)и отоверьте поле для Duplicate Hyperstack.
    3. С обоими изображениями, которые будут сшиты открытыми, выберите Плагины Сшивание Обеззараженный 2D сшивание. Откроется окно 2D-изображений. Выберите, какие изображения будут использоваться для сшивания, и используйте параметры по умолчанию, которые установлены в окне, а затем выберите Ok. Полученное изображение будет собрано серого изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если подизображения не идеально выравниваются, регулировка параметров (т.е. увеличение количества пиков, которые должны быть проверены с 5 до 500 или изменение метода синтеза от линейного смешивания до Макса. Интенсивность) может помочь получить желаемое изображение. В то время как другие инструменты сшивания доступны, этот подход сохраняет размерность изображения, что важно для количественной оценки.
  2. Откройте рентабельность инвестиций (регион интересов), нажав T на клавиатуре. Откроется новое окно под названием ROI Manager.
  3. Выберите инструмент полигона из коробки инструментов FIJI. Падение точек вокруг зародышевой линии, чтобы наметить его и генерировать рентабельность инвестиций(Рисунок 2B). Подключите последнюю точку к первой для создания полной рентабельности инвестиций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для более темных изображений, полезно настроить контраст для улучшения видимости зародышевой линии (которая обратима), так что она может быть изложена более точно.
    1. Сразу же после завершения рентабельности инвестиций, перейдите к менеджеру roI и выберите Добавить для хранения рентабельности инвестиций. Крайне важно, чтобы любые изменения в рентабельности инвестиций, включая добавление/удаление точек или движения рентабельности инвестиций и точек, обновлялись (выберите обновление от менеджера roI), прежде чем перейти к следующему шагу, иначе они будут потеряны. Более подробную информацию о манипуляциях с рентабельностью инвестиций и их точках можно найти в руководстве пользователя FIJI/ImageJ.
  4. После установки ориентации ROI она может быть сохранена для последующей ссылки, выбрав имя рентабельности инвестиций в менеджере ROI, за которым следует More Сохранить (англ.) (файл имени и указать пункт назначения, где сохранить). Сохраненные roIs могут быть открыты в roI менеджера, выбрав Подробнее Открыто (ru) (выберите файл).
  5. Измерьте область внутри рентабельности инвестиций, выбрав название roI от менеджера ROI, а затем выберите кнопку Измерения на менеджере ROI. Окно результатов откроется с информацией о рентабельности инвестиций, включая область, которую она охватывает на изображении (мМ2) (врез рисунка 2B). Запись этой информации в электронной таблице для последующих вычислений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что масштаб изображения был установлен должным образом, так что правильные размеры рентабельности инвестиций собираются. Типы измерений, зарегистрированных в поле Результатов, могут быть изменены, перейдя на анализ Набор измерений....
  6. Откройте дубликат изображения только канала PLA, правильно выбрав изображение PLA и выбрав Duplicate (рисунок 2C). Откроется двойное окно. Укажите только номер канала (c), который соответствует каналу PLA (например, 2) и отоверьте поле для duplicate Hyperstack. Дублирование этого изображения рекомендуется таким образом, чтобы исходное изображение не было изменено.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры будут отображаться только при просмотре изображений, содержащих несколько каналов на FIJI/ImageJ. Альтернативный подход заключается в разделении каналов Изображение Цветовая гамма Разделите каналы,но это изменит исходный файл изображения.
  7. С только изображением канала PLA выбрано, перейдите к изображению Отрегулируйте (англ.) Пороговый . Откроется пороговое окно для изображения. Выберите по умолчанию в качестве порогового метода, красный цвет, и проверьте темный фон овый ящик. Используя верхний трек на окне, сдвиньте планку вправо до тех пор, пока все фокусы PLA не будут четко выделены на изображении.
    1. Запишите значение в поле справа от верхней дорожки и обратите внимание на то, какое значение было использовано для установки порога. Выберите Применить в окне порога для завершения порога, и изображение будет конвертироваться в белый фон только с пороговым фоком видны как черные точки(рисунок 2D). Проверьте порог на нескольких отрицательных контрольных изображениях, чтобы убедиться, что он подходит для захвата всех фокусов PLA от изображения к изображению до количественной оценки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для просмотра пороговых очагов в виде черных точек на белом фоне, перейдите к процессу Двоичные Варианты... и отменить черный фон окно. Пороговое значение между 30-40 является хорошей отправной точкой для выявления PLA в зародышевой линии; однако, идеальное значение может варьироваться в зависимости от фона.
  8. Для количественной оценки foci PLA примените рентабельность инвестиций, генерируемую от шагов 12.3-12.3.1 к изображению порога, выбрав имя рентабельности инвестиций из окна менеджера ROI. Контур рентабельности инвестиций должен отображаться на изображении в том же месте, что и на исходном изображении(рисунок 2E).
    1. Перейти к анализу Анализ частиц. Окно Анализ частиц откроется и выберет следующие параметры: размер (микрон-2) - 0-Бесконечность, круговость 0,00-1,00, шоу . Проверьте окно Суммировать.
    2. Выберите Ok, и Резюме таблица появится с информацией о рентабельности инвестиций (т.е. общее количество foci PLA, общая площадь, занимаемая ПЛАКов внутри в рентабельности инвестиций, средний размер foci PLA, и процент площади, занимаемой ПЛААК foci относительно размера рентабельности инвестиций) (вставка рисунок 2E). Запись этих измерений в электронной таблице.
  9. Повторите шаги 12.1-12.8 для нескольких отрицательных контрольных изображений с использованием одного и того же порога.
    1. После анализа всех отрицательных контрольных изображений повторите шаги 12.1-12.8 для всех экспериментальных образцов с использованием того же порога, который был определен отрицательным контролем для выявления и количественной оценки foci PLA.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Совместное иммуносирование обоих 3xFLAG::DLC-1; GFP и 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP зародышевые линии с антителами FLAG и GFP показали свои модели экспрессии в зародышевой линии(Рисунок 3Aii-iii,3Bii-iii). В то время как GFP был выражен по всей зародыше(Рисунок 3Aiii), OMA-1::GFP выражение было ограничено конце pachytene и яйцеклетки (Рисунок 3Biii)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При изучении ИЦП в зародышевой линии C. elegans более высокое разрешение, предлагаемое PLA, по сравнению с коиммуностоированием, позволяет визуализировать и количественно оценивать места, где взаимодействия происходят в зародышевой линии. Ранее сообщалось, что DLC-1 напрямую взаимодействует с OMA-1, используя анализ выпадения в пробирке GST26; однако, это взаимодействие не было восстановлено в in vivo вытягивании. флуоресцентное коиммуноирование 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP зародыше...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Некоторые штаммы нематод, используемые в этом исследовании, были предоставлены Центром генетики Канеорхаблита, финансируемым NIH (P40OD010440). Конфокальная микроскопия была проведена в Университете Монтаны BioSpectroscopy Core Research Laboratory работал при поддержке NIH Награды P20GM103546 и S10OD021806. Эта работа была частично поддержана грантом NIH GM109053 для E.V., Стипендией Американской ассоциации сердца 18PRE34070028 до X.W., и Монтана Академия наук награда XW. Спонсоры не участвовали в разработке исследования или написании доклада. Мы благодарим М. Элленбекера за обсуждение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
16% раствор параформальдегидаУслуги электронной микроскопии15710используется для получения 4% рабочего
раствора 1М KH2PO4SigmaP0662Готовьте 1М оборотный состав
1x M9различныеподготовленные как 10x запас, используемый при 1x; см. wormbook.org протокол
1x PBSразличныеразные см. wormbook.org для протокола
26.5 ИглаExel International26402Иглы для вскрытия
BSAЛампайр7500802
Центрифужные трубкиThermo Scientific05-529C50мл Oak Ridge центрифужная трубка используется для синхронизации
Конфокальный микроскопZeiss880
Coplin JarPolyLab62101
Покровное стекло для заморозки образцаGlobe Scientific1411-1022x40 мм, No1
Покровное стекло для герметизации SlideGlobe Scientific1404-1522x22 мм, No1.5
DAPI Монтажная среда для иммунофлуоресцентноговектораH-1200
ЛигазаSigma-AldrichDUO82029Duolink 1x Лигаза, входит в комплект Duolink In Situ Detection Reagents Red DUO92008
Амплификационный красный буферSigma-AldrichDUO82011Duolink 5x Amplification Red buffer, входит в состав набора Duolink In Situ Detection Reagents Red DUO92008
Ligation BufferSigma-AldrichDUO82009Duolink 5x Ligation buffer, Входит в состав Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Антитела DiluentSigma-AldrichDUO82008Разбавитель антител Duolink, поставляется с DUO92004 и DUO92002, Примечание: 1x раствор PBS / 1% BSA также может быть использован в качестве заменителя для разбавления антител.
Решение для блокировкиSigma-AldrichDUO82007Duolink Решение для блокировки, поставляется с DUO92004 и DUO92002
монтажной средой для PLASigma-AldrichDUO82040Duolink Монтажная среда In Situ
датчиком DAPI MINUSSigma-AldrichDUO92004Duolink Датчик In Situ Зонд Anti-Mouse МИНУС
ПЛЮС ДатчикSigma-AldrichDUO92002Duolink Датчик In Situ Anti-rabbit PLUS
Wash Buffer ASigma-AldrichDUO82046Duolink In Situ Wash Buffer
A Буфер промывки BSigma-AldrichDUO82048Duolink In Situ Wash Buffer B
ПолимеразаSigma-AldrichDUO82030Duolink Polymeraza, входит в состав Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Epifluorescent MicroscopeLeicaDFC300G камера, DM5500B микроскоп
Козья анти-мышь Alexa 594JacksonImmuno115-585-146Использовать в 1:500
Козья анти-кроличья Alexa 488JacksonImmuno111-545-144Использовать в 1:200
Программное обеспечение для обработки изображенийAdobeAdobe Photoshop + Illsutrator CS3
Стеклянная пипеткаCorning7095B-5X
LevamisoleACROS Органические 187870100Приготовьте 250mM рабочего запаса
МетанолFisher ScientificA454
Mouse anti-FLAGSigmaF1804Используйте при 1:1000 для иммунофлюоресценции и PLA, предварительно блокируйте нормальной козьей сывороткой рекомендуется
NailpolishL.A. цветаCNP195
Нематода Growth Medium (NGM)Смотрите wormbook.org для протокол
Нормальная козья сывороткаJacksonImmuno005-000-121
Полиэтиленовая пастеровская пипеткаGlobe Scientific135030
Поли-L-лизинSigma-AldrichP1524Приготовлен в виде 0,1% исходного раствора в воде, хранится при -20С и разведен в соотношении 1:100 в воде для покрытия предметных стекол Чашки
Петри TritechPD7060диаметр 60 мм
Кролик anti-GFPThermo FisherG10362Используйте при 1:200 для иммунофлюоресценции, 1:4000 для PLA
СлайдыThermo Fisher30-2066A-BrownТрехугольные автоклавируемые слайды 14x14 мм с стержнями заказываются по индивидуальному заказу через Fisher Scientific. Поли-L-лизин добавлен на предметные стекла в лаборатории
Раствор гипохлорита натрияFisher ScientificSS290-1
для работы салфетокKimtech341204,4x8,4 дюйма для задач салфеток
Лотки (242x241x20 мм)Thermo Fisher240845Используется для изготовления влажной камеры
Triton X-100ACROS Organics327372500
ультрачистой водойMilli-QСверхчистая вода, полученная из интегральной системы очистки воды Milli-Q
WatchglassCarolina Biological742300-20
° С морозильной камерой-80
° C морозильная камера
Алюминиевая фольга
OP50 штамм E. coli
Orbital Shaker
Tape
Nematode штаммы, использованные в этом исследовании (оба доступны по запросу)
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]UMT 376dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Ссылка 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) IIIUMT 422dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Справка: данное исследование
калибра с различные

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Nooren, I. M., Thornton, J. M. Diversity of protein-protein interactions. EMBO Journal. 22 (14), 3486-3492 (2003).
  3. Patil, A., Kinosselecta, K., Nakamura, H. Hub promiscuity in protein-protein interaction networks. International Journal of Molecular Science. 11 (4), 1930-1943 (2010).
  4. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), e1000807(2010).
  5. Pazdernik, N., Schedl, T. Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 1-16 (2013).
  6. Nousch, M., Eckmann, C. R. Translational control in the Caenorhabditis elegans germ line. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 205-247 (2013).
  7. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003(2018).
  8. Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
  9. Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  10. Wang, S., et al. Detection of in situ protein-protein complexes at the Drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (95), 52139(2015).
  11. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  12. Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
  13. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Science. 32 (9), 407-414 (2007).
  14. Hiatt, S. M., Shyu, Y. J., Duren, H. M., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45 (3), 185-191 (2008).
  15. Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
  16. Wilson, M. J., Salata, M. W., Susalka, S. J., Pfister, K. K. Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains. Cell Motility and Cytoskeleton. 49 (4), 229-240 (2001).
  17. Erdős, G., et al. Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway. PLoS Computational Biology. 13 (12), e1005885(2017).
  18. Navarro-Lérida, I., et al. Proteomic identification of brain proteins that interact with dynein light chain LC8. Proteomics. 4 (2), 339-346 (2004).
  19. Rapali, P., et al. DYNLL/LC8: a light chain subunit of the dynein motor complex and beyond. FEBS Journal. 278 (17), 2980-2996 (2011).
  20. Rapali, P., et al. Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome. PLoS One. 6 (4), e18818(2011).
  21. Clark, S. A., Jespersen, N., Woodward, C., Barbar, E. Multivalent IDP assemblies: Unique properties of LC8-associated, IDP duplex scaffolds. FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2543-2551 (2015).
  22. Jespersen, N., et al. Systematic identification of recognition motifs for the hub protein LC8. Life Science Alliance. 2 (4), (2019).
  23. Wang, X., et al. Dynein light chain DLC-1 promotes localization and function of the PUF protein FBF-2 in germline progenitor cells. Development. 143 (24), 4643-4653 (2016).
  24. Dorsett, M., Schedl, T. A role for dynein in the inhibition of germ cell proliferative fate. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 6128-6139 (2009).
  25. Ellenbecker, M., et al. Dynein Light Chain DLC-1 Facilitates the Function of the Germline Cell Fate Regulator GLD-1 in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (2), 665-681 (2019).
  26. Day, N. J., Ellenbecker, M., Voronina, E. Caenorhabditis elegans DLC-1 associates with ribonucleoprotein complexes to promote mRNA regulation. FEBS Letters. 592 (22), 3683-3695 (2018).
  27. Detwiler, M. R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., Lin, R. Two zinc finger proteins, OMA-1 and OMA-2, are redundantly required for oocyte maturation in C. elegans. Developmental Cell. 1 (2), 187-199 (2001).
  28. Spike, C. A., et al. Translational control of the oogenic program by components of OMA ribonucleoprotein particles in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (4), 1513-1533 (2014).
  29. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
  30. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  31. Duerr, J. S. Antibody staining in C. elegans using "freeze-cracking". Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  32. Crittenden, S., Kimble, J. Preparation and immunolabeling of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Protein Protein InteractionsWorm DissectionConfocal MicroscopyImageJ QuantificationAntibody IncubationFluorescent LabelingGermline DevelopmentSpatial Temporal Analysis

Похожие статьи