Мы представляем свободно доступный рабочий процесс, построенный для быстрого исследования и точного анализа клеточных тел в конкретных клеточных отсеках в изображениях флуоресценции микроскопии. Этот удобный рабочий процесс разработан на программном обеспечении с открытым исходным кодом Icy, а также использует функции ImageJ. Трубопровод доступен без знания в анализе изображений.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализатор подструктуры: удобный для пользователя рабочий процесс для быстрого исследования и точного анализа клеточных тел в флуоресценции Микроскопия изображения
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Последнее десятилетие характеризовалось прорывами в методах флуоресценции микроскопии, иллюстрируемых улучшением пространственного разрешения, а также в методах визуализации живых клеток и высокопроизводительной микроскопии. Это привело к постоянному увеличению количества и сложности данных микроскопии для одного эксперимента. Поскольку ручной анализ данных микроскопии занимает очень много времени, субъективен и запрещает количественный анализ, автоматизация анализа биоизображений становится почти неизбежной. Мы создали информационный рабочий процесс под названием Substructure Analyzer, чтобы полностью автоматизировать анализ сигналов в биоизображениях из флуоресцентной микроскопии. Этот рабочий процесс разработан на удобной для пользователя платформе с открытым исходным кодом Icy и завершается функциональными работами от ImageJ. Она включает в себя предварительную обработку изображений для улучшения соотношения сигнала к шуму, индивидуальную сегментацию клеток (обнаружение границ клеток) и обнаружение/количественное число тел клеток, обогащенных определенными отсеками клеток. Основным преимуществом этого рабочего процесса является предложение сложных функций биовизионства пользователям без опыта анализа изображений через удобный интерфейс. Кроме того, он является высоко модульным и адаптирован к нескольким вопросам от характеристики ядерного/цитоплазмического транслокации до сравнительного анализа различных клеточных тел в различных клеточных подструктурах. Функциональность этого рабочего процесса иллюстрируется в ходе изучения Cajal (спиральный) органов в условиях окислительного стресса (ОС). Данные флуоресценции микроскопии показывают, что их целостность в клетках человека влияет через несколько часов после индукции ОС. Этот эффект характеризуется уменьшением ядра катина в характерные Каджаальные тела, связанное с нуклеоплазматическим перераспределением катина в увеличенное число меньших очагов. Центральная роль катушкина в обмене между компонентами CB и окружающей нуклеоплазмой предполагает, что индуцированное распространение катушки может повлиять на состав и функциональность Cajal Bodies.
Введение
Легкая микроскопия и, в частности, флуоресценция микроскопии являются надежными и универсальными методами, обычно используемыми в биологических науках. Они дают доступ к точной локализации различных биомолекул, таких как белки или РНК, через их специфическую флуоресцентную маркировку. Последнее десятилетие характеризовалось быстрыми достижениями в области микроскопии и технологий визуализации, о чем свидетельствует Нобелевская премия по химии 2014 года, присужденная Эрику Бетцигу, Стефану У. Аду и Уильяму Е. Мёрнеру за разработку суперрешенной флуоресценции микроскопии (SRFM)1. SFRM обходит предел дифракции традиционной оптической микроскопии, ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Удобные для пользователя учебники доступны на веб-сайте Icy http://icy.bioimageanalysis.org.
1. Скачать icy и протокол анализа подструктур
- Скачать Icy с сайта Icy(http://icy.bioimageanalysis.org/download) и скачать протокол Подструктуры Анализатор: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании 64-разрядной ОС, не забудьте использовать 64-битную версию Java. Эта версия позволяет увеличить память, выделенную icy(Предпочтения Общие Макс памяти....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Все описанные анализы были выполнены на стандартном ноутбуке (64-разрядный четырехъядерный процессор на 2,80 ГГц с 16 ГБ памяти случайного доступа (RAM)), работающей с 64-битной версией Java. Память случайного доступа является важным параметром для рассмотрения, в зависимости от количества и разрешения изображений для анализа. Использование 32-битной версии Java ограничивает память примерно 1300 МБ, что может быть непригодено для анализа больших данных, в то время как 64-битная версия позволяет увеличить память, выделенн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Для анализа изображений флуоресценций клетки имеется все большее число свободных программных средств. Пользователи должны правильно выбирать адекватное программное обеспечение в соответствии со сложностью их проблематично, к их знаниям в обработке изображений, и к времени, которое они хотят потратить на их анализ. Icy, CellProfiler, или ImageJ/Fiji являются мощными инструментами, сочетая в себе удобство использования и функциональность3. Icy является автономным инструментом, который представляет с.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Г.Х. был поддержан дипломом магистра в Министере Делегуэ а-ля Рехерш и Aux Технологии. Л.Х. был поддержан стипендией выпускника в Институте де Канчериотии Лотарингии (ICL), в то время как З.Т. был поддержан государственным грантом под надзором Французского национального исследовательского агентства (ANR) в рамках второй программы FIGHT-HF (справка: ANR-15-RHU457004). Эта работа была профинансирована CNRS и Университетом Лотарингии (UMR 7365).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 16% раствор формальдегида (w/v) без метанола | Thermo Fisher Scientific | 28908 | для фиксации клеток |
| Alexa Fluor 488 козы против кролика | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | флуоресцентное вторичное антитело |
| Alexa Fluor 555 козы против мыши | Thermo Fisher Scientific | A-21425 | флуоресцентное вторичное антитело |
| Alexa Fluor 555 фаллоидин | Thermo Fisher Scientific | A34055 | флуоресцентное вторичное антитело |
| Стандарт альбумина бычьей сыворотки крови (BSA) | euromedex | 04-100-812-E | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796-500ml | среда для клеточной культуры |
| Duolink In Situ Монтажная среда с DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040-5ML | монтажная среда |
| Человек: HeLa S3 клетки | IGBMC, Страсбург, Франция | клеточная линия, используемая для проведения экспериментов | |
| Раствор перекиси водорода 30% (H2O2) | Sigma-Aldrich | H1009-100ml, | используемый в качестве стрессового агента |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | реактив для трансфекции |
| Мышиный моноклональный анти-коилин | abcam | ab11822 | Койлин-специфическое антитело |
| Nikon Optiphot-2 флуоресцентный микроскоп | Nikon | эпифлуоресцентный микроскоп | |
| I Уменьшенная сыворотка Thermo | Fisher Scientific | 31985062 | трансфекционная среда |
| PBS pH 7.4 (10x) | gibco | 70011-036 | для промывания клеток |
| Кролик поликлональный анти-53BP1 | Thermo Fisher Scientific | PA1-16565 | 53BP1-специфическое антитело |
| Кролик поликлональный анти-EDC4 | Sigma-Aldrich | SAB4200114 | EDC4-специфичное антитело |
| Triton X-100 | Roth | 6683 | для проникновения в клетки |
Ссылки
- Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner. Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).
- Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -C.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
