Аксональный транспорт является важнейшим механизмом для здоровья моторных нейронов. В этом протоколе мы предоставляем подробный метод отслеживания аксональной транспортировки кислых отсеков и митохондрий в моторных нейронных аксонах с помощью микрофлюидных камер.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Аксональный Транспорт органелл в культурах моторных нейронов с использованием системы микрофлюидных камер
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Моторные нейроны (Инн) являются сильно поляризованными клетками с очень длинными аксонами. Аксональный транспорт является важнейшим механизмом для здоровья MN, способствуя росту нейронов, развитию и выживанию. Мы описываем подробный метод использования микрофлюидных камер (МФУ) для отслеживания аксональной транспортировки флуоресцентно маркированных органелл в аксонах MN. Этот метод является быстрым, относительно недорогим, и позволяет для мониторинга внутриклеточных сигналов в пространстве и времени. Мы описываем пошаговый протокол для: 1) Изготовление полидиметилсилоксана (PDMS) МФЦ; 2) Покрытие брюшной спинной мозг explants и MN диссоциированной культуры в МФЦ; 3) Маркировка митохондрий и кислых отсеков с последующим живым конфокальным воображением; 4) Ручной и полуавтоматизированный аксональный анализ транспорта. Наконец, мы демонстрируем разницу в транспортировке митохондрий и кислых отсеков HB9::GFP вентральный спинной мозг explant аксоны как доказательство действия системы. В целом, этот протокол обеспечивает эффективный инструмент для изучения аксонального переноса различных аксональных компонентов, а также упрощенное руководство по использованию MFC, чтобы помочь обнаружить пространственные экспериментальные возможности.
Введение
MNs являются сильно поляризованными клетками с длинными аксонами, достигающими до одного метра в длину у взрослых людей. Это явление создает критическую проблему для поддержания подключения и функции MN. Следовательно, MNs зависит от надлежащей транспортировки информации, органелл ы и материалов вдоль аксонов от их клеточного тела к синапсу и спине. Различные клеточные компоненты, такие как белки, РНК и органеллы регулярно переносятся через аксоны. Митохондрии являются важными органеллами, которые регулярно транспортируются в MNs. Митохондрии имеют важное значение для надлежащей деятельности и функции MNs, ответственных за предоставление АТФ, буферизации кальция, и си....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Уход и обращение с животными в этом протоколе осуществлялись под наблюдением и одобрением Комитета по этике животных Тель-Авивского университета.
1. Подготовка МФЦ
- PDMS литья в первичных форм(Рисунок 1)
- Покупка или создание первичных форм (вафель) после подробного протокола9.
- Используйте воздух под давлением, чтобы удалить любой тип грязи с вафельной платформы, прежде чем приступить к покрытию шаг. Поверхность вафель должна выглядеть гладкой и прозрачной.
- Заполните контейнер с 50 мл жидкого азота. Приготовьте 10 мл шприца и 23 G иглы.
ПРИМЕЧАНИЕ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
После описанного протокола, мышь эмбриональной HB9::GFP спинного мозга explants были культивированы в MFC(Рисунок 4A). Выращенные растения выращивались в течение 7 дней, когда аксоны полностью пересекались в дистальном отсеке. Mitotracker Deep Red и Lysotracker Red красители были добавлены в дистальные и проксимальные отсеки для обозначения митохондрий и кислых отсеков(рисунок 4C). Аксоны в диста.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом протоколе мы описываем систему отслеживания аксонального переноса митохондрий и кислых отсеков в моторных нейронах. Эта упрощенная платформа in vitro позволяет точно контролировать, контролировать и манипулировать субклеточными нейронными отсеками, позволяя экспериментальный анализ локальных функций моторных нейронов. Этот протокол может быть полезен для изучения заболеваний MN, таких как ALS, чтобы сосредоточиться на понимании основного механизма аксональной дисфункции транспорта при заболевании.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами Израильского научного фонда (ISF, 561/11) и Европейского исследовательского совета (ERC, 309377).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 35 мм Флуодиш – стеклянная нижняя тарелка | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50 мм Флуодиш – стеклянная нижняя тарелка | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD камера | Andor | ||
| ARA-C (цитозин &бета;-D-арабинофуранозид) | Sigma-Aldrich | C1768 | запас 2 мМ в фильтрованном DDW |
| B-27 Добавка (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | разбавить до 10 &; г/мл в отфильтрованном ddw с 0,01% BSA) |
| Биопсийный пуансон 1,25 мм | World Precision Instruments WPI | 504530 | Для подготовки большого MFC |
| Биопсийный пуансон 6 мм | World Precision Instruments | WPI 504533 | Для подготовки малого |
| биопсийного пуансов MFC 7 мм | World Precision Instruments | WPI 504534 | Для подготовки большого |
| программного обеспечения MFC Bitplane Imaris - версия 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Разбавить до 10 & микро; г/мл в фильтрованном ddw с 0,01% BSA) |
| Градиентная среда плотности - Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Дезоксирибонуклеаза I (ДНК) из поджелудочной железы крупного рогатого скота | Sigma-Aldrich | DN-25 | сток 10мг/мл в нейробазальном |
| Dow Corning Высоковакуумная силиконовая смазка | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | Для подготовки эпоксидных форм |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | Разбавить 1:10 в DDW |
| Тонкие щипцы Dumont #55 0.05 × 0.02 мм | F.S.T | ||
| Эпоксидный отвердитель | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | Для подготовки эпоксидной формы |
| Эпоксидная смола | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | Для подготовки эпоксидной формы |
| Программное обеспечение Фиджи ImageJ | |||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Разбавить до 10 &; г/мл в фильтрованном ddw с 0,01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP мышей штамм | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Разбавить 1:10 в ddw с добавлением 1% P/S и фильтровать |
| iQ программное обеспечение | Andor | ||
| Iris ножницы, изогнутые, 10 см | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Ножницы ирисовая оболочка, прямые, 9 см | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Нейробазальная среда | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti микорскоп | Nikon | ||
| Пенициллин-стрептомицин (P/S) Раствор | Биологическая промышленность | 03-031-1 | |
| поли-L-орнитин (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Разведить 1:1000 в разбавленном 1X |
| PBS Sylgard 184 силиконовый эластомер | набор DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Трипсин из поджелудочной железы крупного рогатого скота | Sigma-Aldrich | T1426 | сток 25 мг/мл в |
| пружинных ножницах для микродиссекции 1XPBS Vannas, лезвие 3 мм | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
Ссылки
- Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
- Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neu....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
