Эта работа описывает два метода для изучения развития органов, улучшенная установка ксенотрансплантации на хориоаллантоической мембране (CAM) из птичьих эмбрионов, что позволяет васкуляризировать культивированные эмбриональные органы и органоиды и новый фиксированный z-направление метод культуры органов с измененными экспериментальными условиями, который позволяет с высоким разрешением замедленной конфокальной визуализации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оптимизация почечной органоидной и органотипической культуры для васкуляризации, расширенного развития и улучшенной микроскопии
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Эмбриональные почечные органотипические культуры, и особенно плюрипотентные органоиды почек, полученные из стволовых клеток, являются отличными инструментами для следующих процессов развития и моделирования заболеваний почек. Однако модели ограничены отсутствием васкуляризации и функциональности. Для решения этой проблемы был разработан усовершенствованный протокол для метода ксенотрансплантации клеток и тканей к хориоаллантоической мембране (CAM) птичьего эмбриона для получения васкуляризации и восстановления кровотока. Прививки накладываются на заказ мини-водохранилища, которые фиксируют образцы CAM и поставляют их с культурой среды, которая защищает трансплантаты от сушки. Улучшенный метод культуры позволяет ксенотрансвтатам расти до 9 дней. В рукописи также описывается, как обеспечить оптимальные условия для долгосрочной конфокальной визуализации почечных органоидов и органотипических культур с использованием ранее опубликованного метода Fixed -Direction (ФИЗД). Этот метод мягко сжимает эмбриональный орган или органоид между стеклянным крышкой и мембраной в большом количестве среды и обеспечивает отличные условия для визуализации на срок до 12 дней. Вместе эти методы позволяют васкуляризации и приток крови к почечной органоидов и органотипических культур почек с улучшенной конфокальной визуализации. Описанные здесь методы очень полезны для изучения фундаментальных и прикладных функций почек ex vivo. Оба метода применимы к различным типам тканей и органоидов.
Введение
Органотипическая культура эмбриональных почек стала важной моделью для изучения нефрогенеза десятилетия назад1,,2,,3. Почечные органоиды представляют собой передовую модельсистему для изучения развития здоровых и больных почек4. Основным недостатком обоих методов, однако, является то, что ни один метод не переоценивает основную функцию почек: фильтрацию крови. Нефроны и почечные сосуды развиваются в почечных органоидах и органотипических культурах подобно ранней стадии развития виво; однако, glomeruli формируется в пробирке остаются сосудистые5. Васкуляризация эмбриональных почек ex vivo и почечных органоидов ранее была продемонстрирована в экспериментах по трансплантации только в условиях in vivo. Например, трансплантация плюрипотентных стволовых клеток человека полученных почечных органоидов под капсулой мышиной почки позволяет развитие нефронов в органоидов к функциональной стадии6.
Промежуточный подход между чисто культурами in vitro и методами трансплантации in vivo – это ксенотрансплантация к CAM птичьих эмбрионов. Васкуляризация нетронутой мышиной почки примордии была продемонстрирована ранее с помощью этой системы7,,8. Тем не менее, было также показано, что почечные сосуды в ксенотрансплантации морин почки был получен из принимающей эндотелия, а не трансплантат9. Это наблюдение значительно снизило потенциал химерных (авиано-млекопитающих) моделей эмбриональных почек для изучения развития почечной сосуды, поскольку экспериментальные условия были недопустимыми для выживания эндотелиальных клеток, полученных донорами.
В первой части этого протокола представлен усовершенствованный метод выращивания эмбриональных почек мыши на CAM из птичьих яиц, сочетающий микроэкологические условия орханотипической культуры и ксенотрансплантации. Основное улучшение по сравнению с предыдущими методами заключается в том, что вместо размещения мыши эмбриональных почек и почечных органоидов непосредственно на CAM, область имплантации накладывается проницаемыми минивоилидами, заполненными культурой среды, которые поставляют пересаженную ткань с питательными веществами и защитить его от высыхания. Успешность экспериментов значительно возрастает, а условия для развития сосуд, полученных донорами, улучшаются. Применение этого метода ксенотрансплантационным культурам приводит к развитию гломерулярной сосуды, состоящей из эндогенных эндотелиальных клеток донорских почек.
Детальный анализ клеточного морфогенеза является еще одним важным применением моделей культуры почек. Ранее сообщенные методы замедленного получения изображений культур почек достаточны только для анализа общей морфологии и узорства эмбриональных почек, но не для отслеживания отдельных клеток10. Недавно былописанновый метод Fixed-Direction (ФИЗД), направленный на высокое разрешение конфокальной 3D-замедленной визуализации почечных органоидов и органотипических культур. В этом методе органоиды и эмбриональные органы аккуратно сжимаются между стеклянным покрытием и проницаемой мембраной вставки трансвелл в специально разработанной пластине до тех пор, пока толщина образца не достигнет 70 мкм, обеспечивая оптимальные оптические условия для визуализации. Во второй части методов описан подробный протокол для изготовления специально разработанной пластины и настройки экспериментов по физподготовке для долгосрочного органоидного изображения.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Уход за животными и процедуры соответствовали финскому национальному законодательству об использовании лабораторных животных, Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (ETS 123), и Директивы ЕС 86/609/EEC.
1. Изготовление минивоилидляций для выращивания эмбриональных почек мыши и почечных органоидов на курином CAM и создание экспериментов по ксенотрансплантации
- Используйте вставки культуры клеток Transwell, предназначенные для 6 скважин или 12 колодцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от конкретного эксперимента можно использовать большие или малые минивоили. Лучше всего использовать небольшие минивомеры для ксенотрансплантации до восьми эмбриональных почек или когда несколько минивоберных будет помещено на тот же куриный эмбрион (например, экспериментируйте и контролируют образцы на том же курином CAM). - Урежьте стороны вставок с помощью роторного мультиинструмента с круговым лезвием пилы или ручной пилой, чтобы создать пластиковое кольцо высотой 2 мм с прилагаемой к нему проницаемой мембраной.
- Польский края этих минивоили скальпелем или острым ножом.
- Стерилизовать минивоидоки в 70% этанола, по крайней мере 1 ч.
- Вымойте минивоили в автоклавированной двойной дистиллированной воде и дайте им высохнуть в ламинарном капюшоне.
- Промыть минивоили в PBS и культуры среды (высокоглюкозный DMEM/10% FBS/1% пенициллин-стрептомицин).
- Поместите резервуар в чашку Петри, на вершине капли (600 л/400 л) культуры среды с мембраной вверх.
- Равномерно расположите всхождные эмбриональные почки ex vivo или почечные органоиды на мембране с помощью пипетки или стеклянной капиллярной трубки. Не оставляйте много жидкости вокруг почек.
- Пусть образцы прикрепляются к мембране для 2-24 ч в инкубаторе клеточной культуры при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: До восьми E11.5 эмбриональных почек мыши или почек органоидов могут быть расположены на небольшой вставке. Большая вставка рекомендуется, если либо большие куски эмбриональной ткани будут использоваться для ксенотрансплантации или клеточной гидрогеля смеси на большей площади CAM. - Возьмите 8-дневный ex ovo культивированных эмбриональных кур, подготовленных в соответствии с ранее опубликованными методами из инкубатора клеточной культуры12,13.
- Передача минивоиликов в CAM так, что трансплантаты сталкиваются CAM, и мембрана накладывает их. Поместите минивоили на периферию CAM, чтобы они не покрывали куриный эмбрион.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании небольших минивоиливодов, изготовленных из вставок Transwell для 12 скважин ных пластин, до трех минивоберных вод можно разместить на одном CAM. - Добавьте 500 кЛ (6 хорошо вставить) или 300 кЛ (12 хорошо вставить) культуры среды для мини-водохранилища.
- Культивировать образцы на куриный CAM в течение максимум 9 дней. Заменить среду культуры в минивоили ежедневно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Васкуляризация образцов может наблюдаться, как только 24-48 ч после трансплантации.
2. Изготовление специально разработанных пластин и создание культур ФИЗД
- Просверлите отверстия диаметром 20 мм в нижней части 6 скважины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов с ФИЗД используйте 6 пластин скважин с глубиной 16 мм (указано в таблице материалов). - Польский ободки отверстий (особенно на верхней стороне) с помощью электрического сверла с контрсверлом бит, скальпель, или острый нож.
- Стерилизовать пластины в 70% этанола, по крайней мере 1 ч.
- Вымойте пластины в автоматической двойной дистиллированной воды и дайте им высохнуть в стерильных условиях.
- Тщательно мыть 22 мм х 22 мм стекла охватывает с 70% этанола или очистить их в соответствии с опубликованным протоколом Saarela et al.11.
- Клей крышкискользит к верхней стороне отверстия в 6 хорошо пластин с помощью нетоксичные ткани клея. Нанесите клей вокруг отверстия и аккуратно поместите крышку, чтобы покрыть его. Дайте клею высохнуть.
- Осмотрите пластины под стереомикроскопом и удалите избыток сушеного клея с поверхности покрывал, если это необходимо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что нет никакого клея над крышкой, чтобы обеспечить даже сжатие образцов. - Смешайте полистирол-бусин (размер частиц 70 мкм) с равным объемом гидрогеля. Достаточно объема 50-100 л на скважину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите смесь гидрогеля и полистирола шарики на льду. - Поместите трансвелл вставить под рассекающий микроскоп с мембраной вверх.
- Равномерно расположите образцы (например, эмбриональные почки ex vivo или почечные органоиды) равномерно.
- Добавить смесь гидрогеля / полистирола рядом с образцами тщательно, чтобы избежать повреждения хрупких тканей.
- Переверните вставку Transwell так, чтобы мембрана с собранными на ней образцами оказалась вниз.
- Аккуратно поместите вставку в колодец из модифицированной 6 хорошо пластины и аккуратно нажмите его вниз, чтобы образцы сжаты до уровня бисера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за ходом сжатия с помощью микроскопа. - Держите вставку слегка прижатой к колодцу одной рукой и зафиксировать ее к пластине, плавя пластик с паяльником в трех точках на периферии вставки.
- Когда вставка крепится к пластине, добавьте 2 мл культуры среды (DMEM/10% FBS/1% пенициллин-стрептомицин) в колодец и продолжить сборку оставшихся скважин в пластине таким же образом.
- Перенос готовой пластины в инкубатор на сцене перевернутого микроскопа для визуализации замедленного действия.
- Выполняйте замедленное изображение образцов с использованием соответствующих экспериментальных настроек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение культуры среды в колодцах пластины во время замедленного экспериментов не требуется, но может быть легко сделано через отверстия по бокам вставки.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Представленный здесь протокол культуры CAM позволил высокоэффективной васкуляризации почечных органоидов и эмбриональных почек в результате ксенотрансплантации на курином CAM(рисунок 1, Фильм 1). Минивоили, содержащие культурную среду, поставляли питательные вещества в донорскую ткань и защищали их от высыхания в период, предшествующий надлежащей васкуляризации. Этот метод обеспечил разрешительные условия для роста эндотелиальных клеток, полученных донорами. Таким образом, п...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Представлены два подробных протокола, которые усовершенствуют классический метод почечной арганотипической культуры и позволяют васкуляризировать, расширенное развитие и оптимальное 4D-изображение и время изображения эмбриональных почек и органоидов. В этом разделе освещаются критические шаги в методах и обсуждаются устранение неполадок.
Существенное различие между другими методами CAM культуры и этот улучшенный метод культуры куриного CAM является использование пользовательских минивоилив в к...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана финансово Suomen Akatemia (Академия Финляндии) (206038, 121647, 250900, 260056; Грант Центра Передового Опыта 2012-2017 251314), Мунуаиссютич - Финская ассоциация почек и печени, Сигрид Джуселиуксен Сютио, Викториастифтельсен, Шведский культурный фонд в Финляндии, Ново Нордиск, Сюпейярхештет (Онкологическое общество Финляндии), Седьмая рамочная программа Европейского сообщества (FP7/2007-2013; грант FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) и H2020 Мари Склодов-Кюри Инновационная сеть Авторы благодарят Паулу Хайпус, Джоанну Кеколахти-Лияс и Ханнеле Хёркман за техническую помощь.
Цифры 3, 4 и Movie 2 перепечатываются с разрешения разработки.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Регулируемое сверло лопатой | Bosch | 2609255277 | Для сверления отверстий диаметром 20 мм |
| Автоматический переворачиватель яиц | OLBA B.V., Нидерланды | AT-42 | Для инкубации яиц перед загрузкой ex ovo. |
| Клеточный инкубатор | Panasonic | 13090543 | Температура установлена на 37°С; C, 90% влажности, 5% CO2 |
| cell Инкубатор | SANYO | 10070347 | Куриный инкубатор CAM-культур. Температура установлена на уровне 37°С; C, 90% влажности, 5% CO2 |
| Cellstar 6-луночная пластина | Greiner | M9062 | Глубина лунок 16 мм для согласования со вставками |
| Дисковая пила для вращающегося инструмента | Dremel | SC690 | |
| Конфокальный микроскоп | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Многолуночная пластина с проницаемыми поликарбонатными мембранными вставками | Corning | 10301031 | Для 6-луночных планшетов. 40 & микро; m размер пор |
| Зенковка Сверло | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | Для полировки (20,5 мм, 1/4", HSS) |
| Одноразовая стеклянная капиллярная трубка | Blaubrand | 7087 33 | |
| Одноразовый скальпель | Swann-Morton | 0501 | |
| Препарирующий микроскоп | Olympus | SZ61 | |
| Сверлильный станок | Bosch | GSR 18 V-EC Профессиональный | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | высоким содержанием глюкозы |
| Compact S84 | Grumbach, Германия | 8012 | Для инкубации яиц перед установкой ex ovo. Температура установлена на уровне 38°С; C с относительной влажностью выше 60% |
| Этанол (70%) | VWR | ||
| Оплодотворенные яйца | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Финляндия | Hy-Line White and Nick | |
| Chick Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Щипцы DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Glä ser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22x22 мм |
| Клей Histoacryl Braun | 1050052 | ||
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Инкубатор на сцене | Okolab | Boldline, изготовленный на заказ | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Промывка мини-резервуаров. |
| Пенициллин и стрептомицин | Sigma | P4333 | |
| Гранулы из полистирола | корпускулярные | 1000263-10 | 70 &микро; m в диаметре |
| Ротационная многоинструментальная система | Dremel | 4000 | |
| Паяльник | Weller | TCP S | Стеклянный капилляр с подогревом также можно использовать |
| Thincert 12-луночные вставки для клеточных культур с 0,4 &; m-pore полистирольная мембрана | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-луночные вставки для клеточных культур с содержанием 0,4 и микро; m-поровая полистирольная мембрана | Greiner Bio-One | 657610 |
Ссылки
- Saxen, L., Wartiovaara, J. Cell contact and cell adhesion during tissue organization. International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).
- Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. Untersuchungen über die tubulogenese der niere. Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).
- Saxen, L. Organogenesis of the Kidney. 1st ed. , Cambridge University Press. Cambridge. (1987).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 536 (7615), 238(2016).
- Halt, K. J., et al. CD146+ cells are essential for kidney vasculature development. Kidney International. 90, 311-324 (2016).
- van den Berg, C. W., et al. Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane. Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).
- Sariola, H. Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli. Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).
- Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. The origin of the glomerular endothelium. Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).
- Short, K. M., et al. Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney. Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).
- Saarela, U., et al. Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging. Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. 44, e2154(2010).
- Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958(2013).
- Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract. Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).
- Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice. Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
