Здесь представлен протокол для оценки контрактильные свойства полосатых мышечных миофибриллей с нано-ньютоновым разрешением. Протокол использует установку с интерферометрией на основе, оптический зонд силы. Эта установка генерирует данные с высоким соотношением сигнала к шуму и позволяет оценить контрактильной кинетики миофибрил.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изолировать миофибрили от биопсии скелетных мышц и определения контрактильной функции с помощью нано-ньютоновского разрешения силы трансдуцера
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Полосатые мышечные клетки незаменимы для активности человека и животных. Одиночные мышечные волокна состоят из миофибрил, которые состоят из последовательно связанных саркомеров, самых маленьких контрактильные единицы в мышцах. Саркомерная дисфункция способствует мышечной слабости у пациентов с мутациями в генах, кодирующих саркомерные белки. Изучение механики миофибриля позволяет оценить актин-миозин взаимодействия без потенциального путаницы эффекты поврежденных, смежных миофибрил при измерении контрактности одного мышечного волокна. Ультраструктурное повреждение и несогласованность миофибрил может способствовать нарушению контрактности. Если структурные повреждения присутствуют в миофибрилях, они, вероятно, ломаются во время процедуры изоляции или во время эксперимента. Кроме того, исследования в миофибрилях дают оценку актин-миозин взаимодействий в присутствии геометрических ограничений саркомеров. Например, измерения в миофибрилях могут выяснить, является ли дисфункция миофибриллярной является основным следствием мутации в саркомерных белках. Кроме того, перфузия с растворами кальция или соединений почти мгновенно из-за малого диаметра миофибриля. Это делает миофибриль в высшей степени подходящим для измерения темпов активации и релаксации во время силового производства. В протоколе, описанном в настоящем документе, используется оптический силовой зонд, основанный на принципе интерферометра Фабри-Перо, способного измерять силы в диапазоне нано-ньютона, в сочетании с двигателем длины пьезо и быстроступной системой перфузии. Эта установка позволяет изучать механику миофибриля с высоким разрешением измерения силы.
Введение
Полосатые мышечные клетки незаменимы для повседневной жизни. Движение конечностей, дыхательная функция и насосное движение сердца зависят от силы, генерируемой мышечными клетками. Скелетная мышца состоит из мышечных фасциклов, содержащих пучки одиночных мышечных волокон(рисунок 1A). Эти мышечные волокна состоят из миофибрил, которые образуются последовательно связанных саркомеров (Рисунок 1B,D). Саркомеры содержат тонкие и толстые нити. Они в основном состоят из цепей молекул актина и миозин, соответственно (Рисунок 1B). Взаимодействия Актин-миозин отвечают за си....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протокол для получения биопсии человека был одобрен институциональным советом по обзору в Медицинском центре Университета VU (#2014/396) и письменное информированное согласие было получено от испытуемых. Протокол для получения биопсии мышц животных был одобрен местным комитетом по этике животных университета VU (AVD114002016501)
1. Подготовка и изоляция миофибриля
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ранее описанные методы глицерината биопсии, подготовить различные концентрации кальция (pCa)решения 7,16,17, и изолировать миофибрили
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Следы данных были записаны и открыты с помощью программного обеспечения контроллера системы (см. таблицу материалов). Полные следы или выбранные сегменты были экспортированы в буфер обмена или текстовый файл для дальнейшего анализа с желаемым программным обеспечением. Клапаны для управления потоком различных решений были переключены с помощью пользовательского программного обеспечения или вручную. Пользовательский скрипт MATLAB был использован для анализа темпов активации, реконструкции напряжения и рела.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Описан протокол для оценки контрактильной функции миофибрил, изолированных от человеческих или животных скелетных мышечных тканей. Силовое разрешение этой установки было описано ранее Chavan et al.12. Короче говоря, это определяется случайными колебаниями длины полости Фабри-Перо, образовавав место между обнаружением волокна и кантилевером, которые производят доминирующую часть шума на выходе считывания (выраженного в V), который, помноженные на чувствительность отклонения (выраженную в м/в) и пру.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Михель Хельмес является акционером и совладельцем IONOptix Inc.
Благодарности
Этот проект финансировался AFM-Telethon и Фондом «Строительная сила для Немалин Миопати». Авторы хотели бы отметить создателя продуктов, упомянутых в этой статье, IONOptix Inc.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Био Спек Продактс, Инк. | 985370-XL | Для изоляции миофибрилл | |
| Изготовлен по индивидуальному заказу | Matlab | ||
| Изготовлен по индивидуальному заказу | Включает программу Labview для управления последовательным соединением; Для управления клапанами | ||
| Изготовлено | Для охлаждения модуля | ||
| Изготовлено | |||
| заказ Изготовлено | Камера из алюминиевой ткани | ||
| Изготовлено | Для управления клапанами; Включает в себя программное обеспечение для ПК для управления через USB | ||
| IonOptix | : программное обеспечение для записи данных с усовершенствованным генератором сигналов для пьезо и быстродействием | ||
| IonOptix | MCS100 | Для записи длины | |
| IonOptix | Включает в себя: Optiforce (интерферометр), микроманипуляторы, сигнальный интерфейс, пьезомотор и контроллер. На базе мышечного растяжителя | ||
| IonOptix | Силовой зонд | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | Для охлаждения модуля Пельтье Microsoft | |
| Регистрация | |||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | поли(2-гидроксиэтилметакрилат); Покрытие для предметных стекол микроскопа для предотвращения слипания тканей | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Кристаллы растворяются в этаноле с последующим образованием | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | Для охлаждения проточной камеры | |
| тканей TE Technology, Inc. | TC-720 | включает в себя программное обеспечение для ПК для управления USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Шприцевой насос для индуцирования фонового потока вместе с системой быстрой перфузии; Отток из тканевой проточной камеры | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Снятая с производства | альтернатива: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | Для перфузии тканей | |
| 1 ПК для IonWizard и 1 ПК для другого программного обеспечения |
Ссылки
- Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
- Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and f....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
