Method Article

Характеристика амилоидных структур в старении C. Elegans использованием флуоресценции пожизненной визуализации

DOI:

10.3791/61004

⸱

March 27th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology im Forschungsverbund Berlin, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Molecular Neuroscience Group, Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge, 4Cell Biology, University of Bremen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Флуоресценция жизни визуализации мониторов, количественно и отличает агрегации тенденции белков в жизни, старение, и подчеркнул C. elegans модели болезни.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Амилоидные фибрилки связаны с рядом нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Гентингтона, Паркинсона или болезнь Альцгеймера. Эти амилоидные фибриллы могут секвестировать эндогенные метастабильные белки, а также компоненты сети протеостаза (PN) и тем самым усугубить неправильное сворачивание белка в клетке. Существует ограниченное количество инструментов для оценки процесса амилоидных белков в животном. Мы представляем протокол для флуоресценции жизни микроскопии (FLIM), что позволяет контролировать, а также количественноать амилоидной фибрилизации в конкретных клетках, таких как нейроны, в неинвазивной образом и с прогрессированием старения и при возмущении PN. FLIM не зависит от уровня экспрессии фторофора и позволяет анализпроцесса агрегации без каких-либо дальнейших окрашивания или отбеливания. Флюорофоры угасают, когда они находятся в непосредственной близости от амилоидных структур, что приводит к снижению срока службы флуоресценции. Закалка напрямую коррелирует с агрегацией амилоидного белка. FLIM является универсальным методом, который может быть применен для сравнения процесса фибрилизации различных амилоидных белков, экологических стимулов, или генетических фонов in vivo в неинвазивной манере.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Агрегация белка происходит как при старении, так и при заболеваниях. Пути, которые приводят к образованию и осаждению крупных амилоидов или аморфных включений трудно следовать и их кинетика также сложно разгадать. Белки могут неправильно сложиться из-за внутренних мутаций в их последовательности кодирования, как и в случае генетических заболеваний. Белки также неправильно, потому что протеостаз сети (PN), что держит их растворимыми и правильно сложены нарушается, как это происходит во время старения. PN включает в себя молекулярные сопровождающие и машины деградации и отвечает за биогенез, складные, торговые и деградации белков1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Синхронизация C. elegans

  1. Синхронизируйте C. elegans либо с помощью щелочной гипохлоритной обработки раствора, либо с помощью простого откладывания яйцеклеток в течение 4 ч при 20 градусах По цельсии8.
  2. Выращивайте и поддерживайте нематоды при 20 градусах по Цельсию на пластинах роста нематод (NGM), посеянных с помощью OP50 E. coli в соответствии со стандартными процедурами9. Возраст нематод до желаемой стадии развития или день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе, молодые взрослые изображены на 4-й день и старые нематоды изображены на 8-й день жизни.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол показывает, как точно контролировать формирование агрегированных видов в живых C. elegans,как во время его естественного старения и при воздействии стресса. Мы отобрали четыре различных штамма трансгенных нематод, выражающих полиглутамин белки либо 40 ", 44" или 85 "повторов. Эти белки синтезируются в различных тканях и были слиты с различными флюорофорами. Штаммы C. elegans либо выражали 40-mRFP в мышцах стенки тела (m'40-RFP), q40-CFP в нервной системе (n'40-C.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный здесь протокол описывает метод на основе микроскопии для выявления агрегированных видов в модели системы C. elegans. FLIM может точно охарактеризовать наличие как агрегированных, так и растворимых видов, слитых с фторфором, путем измерения их распада флуоресценции. Когда термоядерный белок начинает агрегировать свой зарегистрированный средний срок службы, он смещается от более высокого к более низкому значению16. Склонность к агрегации может быть выведена падением в жизни: .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Напряжение мышц-40-mRFP, предоставляемое CGC, которое финансируется NiH Управлением научно-исследовательских инфраструктурных программ (P40 OD010440). Нейрон-40-CFP был добрым подарком лаборатории Моримото. Мы признаем DFG (KI-1988/5-1 в JK, NeuroCure PhD стипендий по NeuroCure кластера передового опыта в MLP), EMBO (краткосрочные стипендии для MLP) и компании биологов (путешествия гранты CG и MLP) для финансирования. Мы также признаем, что центр расширенной световой микроскопии в Центре молекулярной медицины Макса Дельбрюка в Берлине предоставляет установку для изображения, построенного YFP.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agar-Agar Kobe ICarl Roth GmbH + Co. KG5210.2NGM компонент Ahringer
Library hsp-1 siRNASource BioScience UK LimitedF26D10.3
АмпициллинCarl Roth GmbH + Co. KGK029.3Антибиотик
B& H DCS-120 SPC-150Becker & Hickl GmbHFLIM Aquisition программное обеспечение
B& H SPC830-SPC ИзображениеBecker & Hickl GmbHFLIM Программное обеспечение
для приобретения BD Bacto PeptoneBD-Bionsciences211677компонент NGM
C. elegans iQ44-YFPCAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)OG412
C. elegans iQ85-YFPДобрый подарок от Morimoto Lab
C. elegans mQ40-RFPДобрый подарок от Morimoto Lab
C. elegans nQ40-CFPДобрый подарок от Morimoto Lab
Deckglä ser-18x18mmCarl Roth GmbH + Co. KG0657.2Защитные накладки
Изопропил-&бета;-D-тиогалактопиранозид (IPTG)Carl Roth GmbH + Co. KG2316.4
Leica M165 FCLeica Camera AGМонтажный стереомикроскоп
Leica TCS SP5Leica Camera AGКонфокальный микроскоп
Левамизол гидрохлоридAppliChem GmbHA4341Анестетик
OP50 Escherichia coliCAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)50
PicoQuant PicoHarp300PicoQuant GmbHFLIM Программное обеспечение для эквизиции
Азид натрияCarl Roth GmbH + Co. KGK305.1Анестетик
хлорид натрияCarl Roth GmbH + Co. KG3957.2Компонент
NGMStandard-Objektträ gerCarl Roth GmbH + Co. KG0656.1Предметные стекла
Universal AgaroseBio & Продам GmbHBS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1Carl Zeiss AGКонфокальный микроскоп
Zeiss LSM510-Meta NLOCarl Zeiss AGКонфокальный микроскоп

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
  2. Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Bio....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Lifetime ImagingAmyloid FibrilizationC Elegans ModelProtein Aggregation AnalysisNoninvasive MonitoringFLIM AcquisitionLifetime MeasurementPhoton DetectionAgarose Pad PreparationNeurodegenerative Disease Study

Related Articles