Методическая статья

Трансламинарная модель автономной системы для модуляции внутриглазного и внутричерепного давления в задних сегментах донора человека

DOI:

10.3791/61006

⸱

24 апреля 2020 г.

 ,  ,  , 
1North Texas Eye Research Institute, Department of Pharmacology and Neuroscience, University of North Texas Health Science Center, 2Mechanical Engineer Consultant, 3Department of Ophthalmology and Visual Sciences, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем и детализируем использование трансламинарной автономной системы. Эта система использует задний сегмент человека для независимого регулирования давления внутри сегмента (внутриглазного) и окружающего зрительного нерва (внутричерепного) для создания трансламинального градиента давления, который имитирует особенности глаукоматозной оптической невропатии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящее время существует неудовлетворенная потребность в новой доклинической модели человека, которая может быть нацелена на этиологию заболевания ex vivo с использованием внутричерепного давления (ВЧД) и внутриглазного давления (ВГД), которые могут идентифицировать различные патогенные парадигмы, связанные с патогенезом глаукомы. Модели культуры органов переднего сегмента человека ex vivo ранее успешно использовались и применялись в качестве эффективных технологий для открытия патогенеза глаукомы и тестирования терапевтических средств. Доклинический скрининг лекарств и исследования, проводимые на системах органов человека ex vivo, могут быть более трансформируемыми для клинических исследований. В этой статье подробно описывается создание и эксплуатация новой модели трансламинального давления человека ex vivo, называемой трансламинальной автономной системой (TAS). Модель TAS может независимо регулировать ВЧД и ВГД с использованием задних сегментов донора человека. Модель позволяет изучать патогенез доклиническим способом. Это может уменьшить использование живых животных в офтальмологических исследованиях. В отличие от экспериментальных моделей in vitro, структура, сложность и целостность ткани головки зрительного нерва (ONH) также могут поддерживаться в рамках модели ex vivo TAS.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Глобальные оценки в недавних опросах показывают, что 285 миллионов человек живут с нарушениями зрения, в том числе 39 миллионов слепых1. В 2010 году Всемирная организация здравоохранения задокументировала, что три из девяти перечисленных ведущих причин слепоты происходят в заднем сегменте глаза1. Заболевания заднего сегмента глаза включают сетчатку, сосудистую оболочку и зрительный нерв2. Сетчатка и зрительный нерв являются расширениями центральной нервной системы (ЦНС) мозга. Аксоны ганглиозных клеток сетчатки (RGC) уязвимы для повреждения, потому что они выходят из глаза через головку зрительного нерва (ONH) для формирования зрительного нерва3. ONH остается наиболее уязвимым местом для аксонов RGC из-за 3D-сетки пучков соединительной ткани, называемой lamina cribrosa (LC)4. ONH является начальным местом повреждения аксонов RGC при глаукоме5,6,7, а изменения экспрессии генов в ONH были изучены в моделях глазной гипертензии и глаукомы8,9,10. Аксоны RGC восприимчивы к ONH из-за перепадов давления между внутриглазным компартментом, называемым внутриглазным давлением (ВГД), и во внешнем периоптическом субарахноидальном пространстве, называемом внутричерепным давлением (ICP)11. Область LC разделяет обе области, поддерживая нормальные перепады давления, при этом ВГД колеблется от 10 до 21 мм рт.ст., а ВЧД от 5 до 15 мм рт.ст.12. Разность давлений через пластинку между двумя камерами называется трансламинарным градиентом давления (TLPG)13. Основным фактором риска глаукомы является повышенный IOP14.

Увеличение ВГД увеличивает нагрузку внутри и поперек ламинарной области6,15,16. Экспериментальные наблюдения на моделях людей и животных показывают, что ONH является начальным местом повреждения аксонов17,18. Биомеханическая парадигма стресса и деформации, связанных с ВГД, вызывающих глаукоматозное повреждение в ONH, также влияет на патофизиологию глаукомы19,20,21. Несмотря на то, что у людей изменения, вызванные давлением, механически повреждают аксоны RGC22, у грызунов, не имеющих коллагеновых пластин в ламине, также может развиться глаукома7,23. Кроме того, повышенное ВГД остается наиболее заметным фактором риска у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой, в то время как у пациентов с нормальной напряженной глаукомой развивается глаукоматозная оптическая нейропатия даже без повышенного ВГД. Кроме того, есть также подмножество глазных гипертоников, которые не показывают повреждения зрительного нерва. Также было высказано предположение, что давление спинномозговой жидкости (CSFp) может играть роль в патогенезе глаукомы. Данные свидетельствуют о том, что ВЧД снижается до ~ 5 мм рт.ст. у пациентов с глаукомой по сравнению с нормальными людьми, тем самым вызывая повышенное трансламинарное давление и играя решающую роль в заболевании24,25. Ранее в собачьей модели было продемонстрировано, что, контролируя изменения ВГД и CSFp, могут быть большие смещения оптического диска26. Повышение CSFp в глазах свиней также показало увеличение основного напряжения в области LC и ретроламинальной нервной ткани. Повышенная нагрузка на RGC и регион LC способствует блокировке аксонального транспорта и потере RGC27. Прогрессирующая дегенерация RGC была связана с потерей трофической поддержки28,29, стимуляцией воспалительных процессов/иммунной регуляции30,31 и апоптотических эффекторов29,32,33,34,35. Кроме того, аксональное повреждение (рисунок 3) оказывает пагубное воздействие на RGC, вызывая регенеративную недостаточность36,37,38,39. Несмотря на то, что эффекты ВГД были хорошо изучены, были проведены минимальные исследования аномальных изменений трансламинального давления. Большинство методов лечения глаукомы сосредоточены на стабилизации ВГД. Однако, несмотря на то, что снижение ВГД замедляет прогрессирование заболевания, оно не обращает вспять потерю поля зрения и не предотвращает полную потерю RGC. Понимание нейродегенеративных изменений при глаукоме, связанных с давлением, будет иметь решающее значение для предотвращения смерти RGC.

Современные данные свидетельствуют о том, что трансламинарные модуляции давления из-за различных механических, биологических или физиологических изменений у пациентов, страдающих травматическими или нейродегенеративными нарушениями зрения, могут вызвать значительную потерю зрения. В настоящее время не существует истинной доклинической модели заднего сегмента человека, которая могла бы позволить изучать глаукоматозные биомеханические повреждения в EX VIVO человека ONH. Наблюдение и лечение заднего сегмента глаза является огромной проблемой в офтальмологии27. Существуют физические и биологические барьеры для нацеливания на задний глаз, включая высокие показатели элиминации, гемато-ретинальный барьер и потенциальные иммунологические реакции40. Большинство тестов эффективности и безопасности для новых мишеней лекарств проводятся с использованием клеточных моделей in vitro и in vivo на животных41. Глазная анатомия сложна, и исследования in vitro не точно имитируют анатомические и физиологические барьеры, представленные тканевыми модельными системами. Несмотря на то, что животные модели являются необходимостью для фармакокинетических исследований, глазная физиология заднего глаза человека может варьироваться между различными видами животных, включая клеточную анатомию сетчатки, сосудистой системы и ONH41,42.

Использование живых животных требует интенсивных и подробных этических норм, высокой финансовой приверженности и эффективной воспроизводимости43. В последнее время появилось множество других руководящих принципов этического использования животных в экспериментальных исследованиях44,45,46. Альтернативой испытаниям на животных является использование моделей человеческого глаза ex vivo для исследования патогенеза заболеваний и потенциального анализа лекарств для защиты повреждения ONH. Посмертная ткань человека является ценным ресурсом для изучения парадигм заболеваний человека, особенно в случае нейродегенеративных заболеваний человека, поскольку идентификация потенциальных лекарств, разработанных на животных моделях, требует необходимости быть переведенной на людей47. Донорская ткань человека ex vivo широко использовалась для изучения расстройств человека47,48,49, а системы культуры органов переднего сегмента человека ранее предоставили уникальную модель ex vivo для изучения патофизиологии повышенного IOP50,51,52.

Для изучения трансламинального давления, связанного с ВГД и ВЧД в глазах человека, мы успешно спроектировали и разработали двухкамерную трансламинарную автономную систему (TAS), которая может независимо регулировать ВГД и ВЧД с использованием задних сегментов от глаз донора человека. Это первая человеческая модель ex vivo, изучающая трансламинарное давление и использующая биомеханическое воздействие TLPG на ONH.

Эта модель EX VIVO человека TAS может быть использована для обнаружения и классификации клеточных и функциональных модификаций, которые происходят из-за хронического повышения ВГД или ВЧД. В этом отчете мы подробно описываем пошаговый протокол препарирования, настройки и мониторинга модели заднего сегмента человека TAS. Протокол позволит другим исследователям эффективно воспроизвести эту новую модель заднего сегмента человека ex vivo под давлением для изучения патогенеза биомеханических заболеваний.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Глаза были получены в соответствии с положениями Хельсинкской декларации для исследований с участием тканей человека.

ПРИМЕЧАНИЕ: Глаза из авторитетных глазных банков (например, Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) были собраны в течение 6-12 часов после смерти, а донорская сыворотка была проверена на гепатит В, гепатит С и вирус иммунодефицита человека 1 и 2. После того, как они были получены, глаза были рассечены и установлены в модели TAS в течение 24 часов. Критерии исключения включали любую глазную патологию. Глаза не были исключены в зависимости от возраста, расы или пола. Чтобы обеспечить жизнеспособность сетчатки при поступлении, экспланты сетчатки собирали у доноров тканей и культивировали в течение 7 и 14 дней (дополнительный рисунок 1). Эти сетчатки также были диссоциированы и выращивали здоровые RGC в культуре в течение 7 дней с положительным окрашиванием для маркера RGC, РНК-связывающего белка с множественным сплайсингом (RBPMS), а также положительным окрашиванием легкой цепи нейрофиламента (NEFL) в их нейрофиламентах (Дополнительный рисунок 2). .

1. Подготовка и стерилизация оборудования и расходных материалов

  1. Обратитесь к Таблице материалов для получения полного списка необходимых расходных материалов, а также поставщиков и каталожных номеров.
  2. Перед использованием стерилизуйте все оборудование и инструменты путем автоклавирования или с использованием ампул окиси этилена.

2. Приготовление перфузионной среды

  1. Добавьте 1% пенициллина стрептомицина (10 000 Ед/мл пенициллина, 10 000 мкг/мл стрептомицина в 0,85% NaCl) и 1% L-глутамина (200 мМ) к 1000 мл высокой глюкозы модифицированной среды Дульбекко (DMEM).
  2. Стерилизуйте перфузионную среду, проходя через фильтр 0,22 мкм.

3. Настройка трансламинарной автономной системы (ТАС)

  1. Установите приточные шприцы (резервуары ВГД и ПМС).
    1. Добавьте 30 мл перфузионной среды (раздел 2) в шприц объемом 30 мл. Прикрепите 3-позиционный запорный кран к шприцу объемом 30 мл. Прикрепите гидрофильный фильтр 0,22 мкм к 3-ходовому запорному крану. Подключите адаптер-заглушку 15 G Luer к гидрофильному фильтру 0,22 мкм.
    2. Удалите пузырьки воздуха из шприца. Прикрепите трубку к адаптеру заглушки 15 G Luer. Закройте боковой порт запорного крана невентилируемым универсальным замковым колпачком. Повторите в общей сложности две настройки.
    3. Пометьте один шприц как внутричерепное давление канала 1 (CH1 ICP), а другой шприц как канал 2 внутриглазного давления (CH2 IOP).
  2. Установка шприцев для оттока (резервуаров ВГД и ПМС).
    1. Прикрепите 3-позиционный запорный кран к шприцу объемом 30 мл. Прикрепите адаптер заглушки 15 G Luer к 3-позиционному запорному крану. Прикрепите трубку к адаптеру заглушки 15 G Luer.
    2. Закройте боковой порт запорного крана невентилируемым универсальным замковым колпачком. Повторите в общей сложности две настройки. Пометьте один шприц как CH1 ICP, а другой шприц как CH2 IOP.

4. Подготовка человеческого глазного шара

ПРИМЕЧАНИЕ: Если получены целые глаза, следуйте приведенной ниже процедуре, чтобы отделить передний сегмент от заднего сегмента глаза. Если глаза получены пополам, начните с шага 4.4.

  1. Поместите целый глаз в раствор повидона-йода на 2 мин.
  2. Промыть глаз стерильным фосфатно-буферным раствором (PBS) для смывания повидона-йода. Повторите 2 раза.
  3. Удалите придатки со всего глазного шара с помощью щипцов и ножниц. Разделите глаз пополам на экваторе, чтобы разделить передний и задний сегменты глаза.
  4. Снимите оболочку зрительного нерва. Удалите стекловидное тело из заднего сегмента.
  5. При необходимости обрежьте дополнительные склеры из заднего сегмента, чтобы обеспечить хорошую посадку на круглом куполе ВГД (нижней) камеры. Используя щипцы, убедитесь, что сетчатка равномерно распределена по задней части сегмента.
  6. Установка камеры ВГД (нижняя)
    1. Поместите задний сегмент человека в ВГД (нижнюю) камеру TAS над круглым куполом с зрительным нервом, обращенным к верху.
    2. Запечатайте задний сегмент с помощью уплотнительного кольца из эпоксидной смолы с четырьмя винтами, обеспечив плотное уплотнение.
    3. Вставьте трубку в отверстия IN и OUT камеры ВГД (нижняя). Приточный шприц ВГД со средой, содержащей трубку, вставляется в входное отверстие, а пустой шприц для выхода ВГД с трубкой вставляется в выходной порт.
    4. Используйте метод push/pull, чтобы медленно вливать перфузионную среду в порт притока, чтобы заполнить заднюю глазную чашку, одновременно медленно вытягивая перфузионную среду через шприц оттока, чтобы удалить любые пузырьки воздуха из линий. Прекратите вливать среду, как только трубки IN и OUT будут лишены пузырьков воздуха.
    5. Зафиксируйте запорные краны в выключенном положении. Извлеките шприц объемом 30 мл из узла фильтра порта IOP IN и заправьте в общей сложности 30 мл среды. Замените шприц объемом 30 мл на фильтр в сборе.
  7. Установка камеры ICP (верхняя)
    1. Поместите камеру/крышку ICP (верхнюю) над задней частью заднего сегмента. Убедитесь, что зрительный нерв находится в верхней камере. Запечатайте верхнюю камеру четырьмя винтами.
    2. Вставьте трубку в отверстия IN и OUT камеры ICP (верхней). Приточный шприц ICP со средой, содержащей трубку, вставляется в in-порт, а пустой выходной шприц ICP с трубкой вставляется в out-порт.
    3. Осторожно и медленно вливайте среду в in-порт, чтобы заполнить камеру ICP и удалить пузырьки воздуха из линий с помощью метода push/pull. Прекратите вливание среды, как только камера ICP, а также трубки IN и OUT будут лишены пузырьков воздуха.
    4. Зафиксируйте запорные краны в выключенном положении. Извлеките шприц объемом 30 мл из ICP в узел портового фильтра и заправьте в общей сложности 30 мл среды. Замените шприц объемом 30 мл на фильтр в сборе.

5. Настройка системы записи данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Система регистрации данных состоит из 8-канального источника питания, многоканального мостового усилителя, гидростатических преобразователей давления и компьютера с программным обеспечением для сбора данных (см. Таблицу материалов). Ниже описано, как настроить и откалибровать систему.

  1. Подключите кабель питания к задней панели 8-канального источника питания и подключите к резервному устройству аккумулятора.
  2. Подключите кабель USB от 8-канального источника питания к задней панели компьютера.
  3. Подключите 8-канальный источник питания к многоканальному мостовому усилителю с помощью прилагаемого шнура I2C.
  4. Подключите кабели Байонета Нила-Консельмана (BNC) к канальным входам перед 8-канальным источником питания и конец кабелей к соответствующим каналам в задней части многоканального усилителя.
  5. Подключите кабели преобразователя к передней панели многоканального усилителя.
  6. Установите программное обеспечение для сбора данных на компьютер.
    1. Запустите установщик программы установки программного обеспечения для сбора данных с прилагаемого компакт-диска с программным обеспечением.
    2. Следуйте инструкциям на экране компьютера.
    3. После завершения установки нажмите кнопку Готово.
  7. Включите 8-канальный источник питания.
  8. Включите компьютер и запустите программное обеспечение для сбора данных.
    1. Выберите | файлов Новые функции.
    2. Выберите установочный | Настройки канала. Выберите три канала (в левом нижнем углу экрана). В столбце Название канала переименуйте каналы следующим образом: CH1 ICP; CH2 ВГД; CH3 TLPG (IOP-ICP).
    3. Выберите 2 мВ для параметра Диапазон на всех каналах. В столбце Расчет выберите Нет вычисления для каналов 1 и 2.
    4. В столбце Расчет выберите Арифметика для канала 3. В разделе Формула : Выберите каналы/CH2; Выберите арифметику "-"; Выберите каналы/CH1. В разделе Вывод выберите мм рт.ст. Нажмите кнопку ОК. Нажмите кнопку ОК еще раз.
  9. Настройте и откалибруйте гидростатические преобразователи давления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гидростатические преобразователи давления должны быть откалиброваны перед экспериментами с использованием следующего метода.
    1. Подключите гидростатические преобразователи давления к линиям преобразователя, прикрепленным к многоканальному мостовому усилителю.
    2. Прикрепите шприц объемом 30 мл, наполненный воздухом, к боковому порту датчика давления CH1 (ICP). Прикрепите сфигмоманометр к нижней части датчика давления CH1 (ICP).
    3. На графике просмотрите страницу программного обеспечения для сбора данных, установите скорость выборки, щелкнув левой кнопкой мыши стрелку рядом со временем выборки и выберите 100. Затем щелкните правой кнопкой мыши в области CH1 (ICP) страницы.
    4. Выберите Мостовой усилитель. Выберите Фильтр сети. Выберите Zero и подождите, пока система обнулится, следя за тем, чтобы датчик давления не перемещался.
    5. Зажмите белые вкладки датчика давления и протолкните воздух через датчик до тех пор, пока на сфигмоманометре не будет получено 40 мм рт.ст. Отпустите белые вкладки и снимите шприц и сфигмоманометр.
    6. На странице Преобразование единиц измерения выберите знак «минус (-)». Выделите самое высокое плато, чтобы указать 40 мм рт.ст. Щелкните стрелку для точки 1 и введите 40.
    7. Выделите самое низкое плато, чтобы указать 0 мм рт.ст. Щелкните стрелку для точки 2 и введите 0. Выберите мм рт.ст. для устройств. Нажмите кнопку ОК.
    8. Нажмите кнопку ОК (страница Мостовой усилитель). Повторите шаги 9,1–9,7 для CH2 (ВГД), используя 100 мм рт.ст. для самого высокого плато и 0 для самого низкого плато.
  10. Подключите блок TAS/задний сегмент к системе сбора данных.
    1. Поместите блок TAS/задний сегмент в инкубатор (37 °C, 5% CO2). Подключите трубку ICP от порта OUT к датчику давления CH1 (ICP).
    2. Подключите трубку ВГД от порта OUT к датчику давления CH2 (IOP).
    3. Подключите шприцевые установки (ICP и IOP) со средой от IN-портов к кольцевой подставке.
    4. На странице Представление диаграммы выберите Начать выборку. Установите скорость выборки, щелкнув левой кнопкой мыши стрелку рядом со временем выборки и выбрав Медленно и 1 минута.
    5. Отрегулируйте шприцы на кольцевой стойке вверх или вниз, чтобы регулировать давление ICP и IOP в соответствии с требованиями протокола.
    6. Выполняют системное пополнение среды в системе каждые 48–72 ч методом push and pull.

6. Поиск и анализ данных

  1. Откройте файл данных в программном обеспечении для сбора данных.
  2. В разделе Панель данных щелкните значок Множественное добавление в панель данных . Появится новое окно.
    1. В разделе Найти с помощью выберите в раскрывающемся меню пункт Время .
    2. В разделе Выбор выберите 1 час каждые 1 час из выпадающих меню.
    3. В разделе Пошаговое выполнение выберите Весь файл и нажмите кнопку Добавить.
  3. В разделе Панель данных щелкните значок Представление панели данных . Выделите все данные и скопируйте/вставьте в электронную таблицу.
  4. Рассчитайте средние и стандартные отклонения для ВГД, ВЧП и ТЛПГ за каждые 24 ч. Сопоставьте данные с помощью параметра сводной таблицы в программе для работы с электронными таблицами и графике.

7. Иммуногистохимия и окрашивание задних сегментов гематоксилином и эозином

  1. Удалите задние сегменты глаза после различных временных точек из модели TAS и зафиксируйте в формалине перед парафинизацией.
  2. Разрезание глаз для получения сагиттальных тканевых плоскостей.
  3. Депарафинизируйте парафиновые сегменты 100% ксилолом, 95% этанолом, 50% раствором этанола.
  4. Мойте горки с PBS в течение 10 мин и блокируйте блокирующим буфером при комнатной температуре в течение 1 ч.
  5. Участки этикетки с первичными антителами: антиколлаген IV (маркер внеклеточного матрикса (ECM), NB120-6586, 1:100) и антиламинин (маркер ECM, NB300-144, 1:100, анти-RBPMS (маркер RGC), GTX118619, 1:50).
  6. Обнаружение первичных антител с помощью вторичных антител Alexa Fluor (Alexa Fluor 488 козий анти-кролик, A11008, 1:500).
  7. Противодействует окрашиванию клеточных ядер с помощью антивядающего раствора DAPI.
  8. Захват изображений окрашенных участков и фазовых изображений с помощью объективов 4x и 10x с помощью флуоресцентного микроскопа (см. Таблицу материалов).
  9. Для окрашивания гематоксилином и эозином (H & E) обработайте участки в автоматизированной системе окрашивания (см. Таблицу материалов) для депарафинизации с использованием 100%, ксилола 95% этанола, 50% раствора этанола и окрашивания h &E.
  10. Делайте снимки с помощью объективов 4x и 10x с помощью микроскопа с ярким полевым источником света.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Проектирование и создание трансламинарной автономной системы
Трансламинарный перепад давления является потенциальным ключевым механизмом в патогенезе различных заболеваний, в том числе глаукомы. Использование описанной модели включает, но не ограничивается этим, изучение глаукомы (повышенное ВГД, возможно, снижение ВЧД), черепно-мозговой травмы (повышенное ВЧД) и долгосрочное воздействие связанных с микрогравитацией нарушений зрения (повышенный ВЧД, повышенный ВГД). Чтобы помочь обнаружить молекулярны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Посмертные ткани человека являются особенно ценным ресурсом для изучения нейродегенеративных заболеваний человека, поскольку идентификация потенциальных лекарств, разработанных на животных моделях, должна быть переведена на людей47. Эффекты повышения ВГД человека хорошо известны, но минимальные исследования были проведены для аномальных изменений трансламинального давления ONH. Несмотря на то, что существует несколько животных моделей и конечное моделирование ONH человека, не существует модели ex ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы рукописи не имеют потенциальных конфликтов интересов для раскрытия.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансирование этого проекта осуществлялось за счет дискреционных средств д-ра Коллин М. Макдауэлл. Эта работа была частично поддержана неограниченным грантом от Research to Prevent Blindness, Inc. департаменту офтальмологии и визуальных наук UW Madison. Мы благодарим д-ра Эббота Ф. Кларка и Веймин Мао за их техническую помощь с моделью культуры перфузионных органов. Мы благодарим Институт трансплантации и исследований Lions Eye (Тампа, Флорида) за предоставление глаз донора человека.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
#122, 1-1/8" внутри x 1-5/16" снаружи Diam, уплотнительное кольцо из витона, толщина 3/32",
755 Durometer 50 Pack		AmazonB07DRGPPZJ
114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, черный, 5/8" ID, 13/16" OD, ширина 3/32" (в упаковке 100)AmazonB000FMYRHK
шприцы 30 мл без иглыVitality Medical302832
3-позиционный запорный кран, 2 замка Luer с внутренней резьбой, поворотный замок Luer с наружной резьбой, вентилируемый колпачокQOSINA2C6201
4-40 x 1/2 PH PAN MS SS/CHROME и крестообразная отвертка соответствующего размераBrikksen Stainless Steel FastnersPPMSSSCH4C.5 
ANPROLENE 16 LARGE AMPULEFisher ScientificNC9085343 
BetadinePurduePUR1815001EACH 
Corning 100 x 20 мм обработанные тканевой культурой чашкидля культур Sigma-AldrichCLS430167-100EAstrong> 
Corning  L-глутаминовый растворFisher ScientificMT25005CI
Covidien 3033 Curity Марлевая губка, 4" x 4", 12-слойная, стерильная, 1200/CSMed Plus Medical SupplyCOV-3033-CS
Перевязочные щипцы деликатно изогнутые (зубчатые)KatenaK5-4010
Dumont #5 - Тонкие щипцыF.S.T.11254-20
Глазные ножницы стандартные изогнутыеKatenaK4-7410
Falcon 150 x 15 мм Простые стерильные одноразовые чашкиПетри Capitol Scientific351058
Fisherbrand 4 унции контейнеры для образцовFisherScientific 16-320-730
Fisherbrand Мгновенно запечатывающиеся стерилизационные мешочкиFisher Scientific01-812-54
Пакеты для стерилизации Fisherbrand Instant Sealing SturifyFisher Scientific01-812-55
Пакеты для мгновенной герметизации Fisherbrand FisherScientific01-812-58
HyClone Dulbecco's Modified Eagles MediumFisher ScientificSH3024302
HyClone Penicillin Streptomycin 100X РастворFisher ScientificSV30010
Гидрофильный фильтр с внутренней резьбой на входе Luer Lock, наружным выходом Luer Slip, синие и прозрачныегидростатического давления Qosina28217
, DELTRAN ® II, Каталог # DPT-200 с расходом 3CC/HRAD инструментыDPT-200
JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Дозирующий наконечник 50/boxJenson GlobalJG15-0.5HPX 15
Keyence B2? Микроскоп X710KeyenceB2-X710
LabChart 8 ADинструментыLabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainerLeicaST5020
Невентилируемый универсальный колпачок Luer Lock, белыйQOSINA65811
Восьмеричный мост Усилитель (модель # FE228)AD инструментыFE228
Pharmco Products ЭТИЛОВЫЙ СПИРТ, 200 PROOFFisher ScientificNC1675398
Фосфатный буферный раствор (PBS)Sigma-AldrichD8537-500ML
PowerLab 8/35 (модель # PL3508)AD instrumentsPL3508
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPIThermoFisherP36935
Push-to-Connect Tube Fitting для воздуха и воды  Прямой адаптер, наружный диаметр трубы 1/8 дюйма x наружная резьба 1/8 NPT Наружная резьбаMcMAster-Carr7880T113
Push-to-Connect с универсальной резьбой  для воздуха и воды, адаптер, трубка 1/8" наружный диаметр x труба 1/8McMAster-Carr51235K101
Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Гибкая трубка 500 футов.Fisher Scientific14-171-268
Superblock T20Хирургические ножницы Fisher ScientificPI37536
- Sharp-BluntF.S.T.14001-14
Тканевые щипцы тонкие 1x2 зуба изогнутыеKatenaK5-4110
Трансламинарная автономная система (TAS)Научный центр здоровья Университета Северного ТехасаН/Д
США размер 030 Уплотнительное кольцо Buna-N, B1000, 70 Твердость, черный, Buna-N
(NBR, нитрил, Buna)		Marco Rubber & ПластмассыВ1000-030
< преобразователи

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. The British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2012).
  2. Bastawrous, A., et al. Posterior segment eye disease in sub-Saharan Africa: review of recent population-based studies. Tropical Medicine & International Health. 19 (5), 600-609 (2014).
  3. Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye. 18 (11), 1089-1095 (2004).
  4. Burgoyne, C. F. A biomechanical paradigm for axonal insult within the optic nerve head in aging and glaucoma. Experimental Eye Research. 93 (2), 120-132 (2011).
  5. Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. II. Effect of extended intraocular pressure elevation on optic nerve head and axonal transport. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 19 (2), 137-152 (1980).
  6. Quigley, H. A., Addicks, E. M., Green, W. R., Maumenee, A. E. Optic nerve damage in human glaucoma. II. The site of injury and susceptibility to damage. Archives of Ophthalmology. 99 (4), 635-649 (1981).
  7. Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. The Journal of Cell Biology. 179 (7), 1523-1537 (2007).
  8. Johnson, E. C., Jia, L., Cepurna, W. O., Doser, T. A., Morrison, J. C. Global changes in optic nerve head gene expression after exposure to elevated intraocular pressure in a rat glaucoma model. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (7), 3161-3177 (2007).
  9. Howell, G. R., et al. Molecular clustering identifies complement and endothelin induction as early events in a mouse model of glaucoma. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1429-1444 (2011).
  10. Qu, J., Jakobs, T. C. The Time Course of Gene Expression during Reactive Gliosis in the Optic Nerve. PloS one. 8 (6), 67094(2013).
  11. Berdahl, J. P., Fautsch, M. P., Stinnett, S. S., Allingham, R. R. Intracranial pressure in primary open angle glaucoma, normal tension glaucoma, and ocular hypertension: a case-control study. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 49 (12), 5412-5418 (2008).
  12. Berdahl, J. P., Allingham, R. R. Intracranial pressure and glaucoma. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (2), 106-111 (2010).
  13. Morgan, W. H., et al. The correlation between cerebrospinal fluid pressure and retrolaminar tissue pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 39 (8), 1419-1428 (1998).
  14. Leske, M. C., Connell, A. M., Wu, S. Y., Hyman, L. G., Schachat, A. P. Risk factors for open-angle glaucoma. The Barbados Eye Study. Archives of Ophthalmology. 113 (7), 918-924 (1995).
  15. Quigley, H. A., Green, W. R. The histology of human glaucoma cupping and optic nerve damage: clinicopathologic correlation in 21 eyes. Ophthalmology. 86 (10), 1803-1830 (1979).
  16. Burgoyne, C. F., Downs, J. C., Bellezza, A. J., Hart, R. T. Three-dimensional reconstruction of normal and early glaucoma monkey optic nerve head connective tissues. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (12), 4388-4399 (2004).
  17. Diekmann, H., Fischer, D. Glaucoma and optic nerve repair. Cell and Tissue Research. 353 (2), 327-337 (2013).
  18. Nickells, R. W., Howell, G. R., Soto, I., John, S. W. Under pressure: cellular and molecular responses during glaucoma, a common neurodegeneration with axonopathy. Annual Review of Neuroscience. 35, 153-179 (2012).
  19. Burgoyne, C. F., Downs, J. C. Premise and prediction-how optic nerve head biomechanics underlies the susceptibility and clinical behavior of the aged optic nerve head. Journal of Glaucoma. 17 (4), 318-328 (2008).
  20. Sigal, I. A., Ethier, C. R. Biomechanics of the optic nerve head. Experimental Eye Research. 88 (4), 799-807 (2009).
  21. Sigal, I. A., Flanagan, J. G., Tertinegg, I., Ethier, C. R. Modeling individual-specific human optic nerve head biomechanics. Part I: IOP-induced deformations and influence of geometry. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 8 (2), 85-98 (2009).
  22. Morgan, J. E., Jeffery, G., Foss, A. J. Axon deviation in the human lamina cribrosa. The British Journal of Ophthalmology. 82 (6), 680-683 (1998).
  23. Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 44 (12), 5151-5162 (2003).
  24. Berdahl, J. P., Allingham, R. R., Johnson, D. H. Cerebrospinal fluid pressure is decreased in primary open-angle glaucoma. Ophthalmology. 115 (5), 763-768 (2008).
  25. Fleischman, D., Allingham, R. R. The role of cerebrospinal fluid pressure in glaucoma and other ophthalmic diseases: A review. Saudi Journal of Ophthalmology. 27 (2), 97-106 (2013).
  26. Morgan, W. H., et al. Optic disc movement with variations in intraocular and cerebrospinal fluid pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 43 (10), 3236-3242 (2002).
  27. Feola, A. J., et al. Deformation of the Lamina Cribrosa and Optic Nerve Due to Changes in Cerebrospinal Fluid Pressure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 2070-2078 (2017).
  28. Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. Journal of Neurobiology. 59 (1), 162-180 (2004).
  29. Kermer, P., Klocker, N., Bahr, M. Neuronal death after brain injury. Models, mechanisms, and therapeutic strategies in vivo. Cell and Tissue Research. 298 (3), 383-395 (1999).
  30. Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125 (4), 903-920 (2004).
  31. Kipnis, J., et al. Neuronal survival after CNS insult is determined by a genetically encoded autoimmune response. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (13), 4564-4571 (2001).
  32. Isenmann, S., Wahl, C., Krajewski, S., Reed, J. C., Bahr, M. Up-regulation of Bax protein in degenerating retinal ganglion cells precedes apoptotic cell death after optic nerve lesion in the rat. The European Journal of Neuroscience. 9 (8), 1763-1772 (1997).
  33. Kermer, P., et al. Caspase-9: involvement in secondary death of axotomized rat retinal ganglion cells in vivo. Brain research. Molecular Brain Research. 85 (1-2), 144-150 (2000).
  34. Kermer, P., Klocker, N., Labes, M., Bahr, M. Inhibition of CPP32-like proteases rescues axotomized retinal ganglion cells from secondary cell death in vivo. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 18 (12), 4656-4662 (1998).
  35. Kikuchi, M., Tenneti, L., Lipton, S. A. Role of p38 mitogen-activated protein kinase in axotomy-induced apoptosis of rat retinal ganglion cells. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (13), 5037-5044 (2000).
  36. Barron, K. D., Dentinger, M. P., Krohel, G., Easton, S. K., Mankes, R. Qualitative and quantitative ultrastructural observations on retinal ganglion cell layer of rat after intraorbital optic nerve crush. Journal of Neurocytology. 15 (3), 345-362 (1986).
  37. Misantone, L. J., Gershenbaum, M., Murray, M. Viability of retinal ganglion cells after optic nerve crush in adult rats. Journal of Neurocytology. 13 (3), 449-465 (1984).
  38. Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends in Neurosciences. 23 (10), 483-490 (2000).
  39. Klocker, N., Zerfowski, M., Gellrich, N. C., Bahr, M. Morphological and functional analysis of an incomplete CNS fiber tract lesion: graded crush of the rat optic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 110 (12), 147-153 (2001).
  40. Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
  41. Rousou, C., et al. A technical protocol for an experimental ex vivo model using arterially perfused porcine eyes. Experimental Eye Research. 181, 171-177 (2019).
  42. Vézina, M. Assessing Ocular Toxicology in Laboratory Animals. , Humana Press. 1-21 (2012).
  43. de Boo, J., Hendriksen, C. Reduction strategies in animal research: a review of scientific approaches at the intra-experimental, supra-experimental and extra-experimental levels. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (4), 369-377 (2005).
  44. Kirk, R. G. W. Recovering The Principles of Humane Experimental Technique: The 3Rs and the Human Essence of Animal Research. Science, Technology, & Human Values. 43 (4), 622-648 (2018).
  45. Burden, N., Chapman, K., Sewell, F., Robinson, V. Pioneering better science through the 3Rs: an introduction to the national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research (NC3Rs). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 198-208 (2015).
  46. Singh, J. The national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 3 (1), 87-89 (2012).
  47. White, K., et al. Effect of Postmortem Interval and Years in Storage on RNA Quality of Tissue at a Repository of the NIH NeuroBioBank. Biopreservation and Biobanking. 16 (2), 148-157 (2018).
  48. Ervin, J. F., et al. Postmortem delay has minimal effect on brain RNA integrity. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (12), 1093-1099 (2007).
  49. Heinrich, M., Matt, K., Lutz-Bonengel, S., Schmidt, U. Successful RNA extraction from various human postmortem tissues. International Journal of Legal Medicine. 121 (2), 136-142 (2007).
  50. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
  51. Gottanka, J., Chan, D., Eichhorn, M., Lutjen-Drecoll, E., Ethier, C. R. Effects of TGF-beta2 in perfused human eyes. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (1), 153-158 (2004).
  52. Pang, I. H., McCartney, M. D., Steely, H. T., Clark, A. F. Human ocular perfusion organ culture: a versatile ex vivo model for glaucoma research. Journal of Glaucoma. 9 (6), 468-479 (2000).
  53. Aryee, M. J., Gutierrez-Pabello, J. A., Kramnik, I., Maiti, T., Quackenbush, J. An improved empirical bayes approach to estimating differential gene expression in microarray time-course data: BETR (Bayesian Estimation of Temporal Regulation). BMC Bioinformatics. 10, 409(2009).
  54. Feola, A. J., et al. Finite Element Modeling of Factors Influencing Optic Nerve Head Deformation Due to Intracranial Pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (4), 1901-1911 (2016).
  55. Downs, J. C. Optic nerve head biomechanics in aging and disease. Experimental Eye Research. 133, 19-29 (2015).
  56. Downs, J. C., Roberts, M. D., Burgoyne, C. F. Mechanical environment of the optic nerve head in glaucoma. Optometry and Vision Science. 85 (6), 425-435 (2008).
  57. Downs, J. C., et al. Viscoelastic characterization of peripapillary sclera: material properties by quadrant in rabbit and monkey eyes. Journal of Biomechanical Engineering. 125 (1), 124-131 (2003).
  58. Wagner, A. H., et al. Exon-level expression profiling of ocular tissues. Experimental Eye Research. 111, 105-111 (2013).
  59. Pels, E., Beele, H., Claerhout, I. Eye bank issues: II. Preservation techniques: warm versus cold storage. International Ophthalmology. 28 (3), 155-163 (2008).
  60. Reinhard, K., et al. Hypothermia Promotes Survival of Ischemic Retinal Ganglion Cells. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (2), 658-663 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Translamanar Autonomous SystemIntraocular Pressure RegulationIntracranial Pressure ControlHuman Posterior SegmentOptic Nerve HeadPressure Gradient ModelingEx Vivo Ocular ModelHydrostatic Pressure TransducersPerfusion Fluid SetupData Acquisition System

Похожие статьи