Terahertz Imaging и протокол характеристик для свежевырезанных опухолей рака молочной железы

Summary

Свежевырезанные опухоли рака молочной железы человека характеризуются терагерц спектроскопией и визуализацией в соответствии с протоколами обработки свежих тканей. Позиционирование тканей принимается во внимание для обеспечения эффективной характеристики при своевременном проведении анализа для будущих интраоперационных приложений.

Abstract

Данная рукопись представляет протокол для обработки, характеристики и изображения свежевырезанных опухолей молочной железы человека с использованием импульсных методов терагерца и спектроскопии. Протокол включает режим передачи терагерца при нормальной частоте и режим отражения терагерца под наклонным углом 30 градусов. Собранные экспериментальные данные представляют импульсы домена времени электрического поля. Сигнал терагерца электрического поля, передаваемый через фиксированную точку на вырезокной ткани, обрабатывается с помощью аналитической модели для извлечения рефракционного индекса и коэффициента абсорбции ткани. Используя ступенчатый моторный сканер, терагерц, излучаемый пульс, отражается от каждого пикселя на опухоли, обеспечивая планарное изображение различных областей тканей. Изображение может быть представлено в домене времени или частоты. Кроме того, извлекаемые данные рефракционного индекса и коэффициента поглощения на каждом пикселе используются для обеспечения томографического терагерца изображения опухоли. Протокол демонстрирует четкую дифференциацию раковых и здоровых тканей. С другой стороны, несогласование протокола может привести к шумным или неточным изображениям из-за присутствия пузырьков воздуха и остатков жидкости на поверхности опухоли. Протокол предоставляет метод хирургической оценки опухолей молочной железы.

Introduction

Терахерц (ТГц) изображений и спектроскопии была быстро растущей области исследований в последнее десятилетие. Продолжение разработки более эффективных и последовательных излучателей ТГц в диапазоне 0,1-4 ТГц сделало их приложения значительно расти¹. Одной из областей, где THz показал обещание и значительный рост биомедицинской области². Было показано, что излучение THz является неизлечимым и биологически безопасным на уровне мощности, обычно используемом для анализа фиксированных тканей^3. В результате, THz изображений и спектроскопии был использован для классификации и дифференцировать различные особенности ткани, такие как содержание воды, чтобы указать повреждения ожога и исцеления⁴, цирроз печени⁵, и рак в вырезанных^{тканей 6,7}. Оценка рака, в частности, охватывает широкий спектр потенциальных клинических и хирургических приложений, и был исследован для рака головного мозга⁸, печень⁹, яичники¹⁰, желудочно-кишечного тракта¹¹, и грудь^{7,12,13,14,15,16,17,18,19}.

THz приложений для рака молочной железы в первую очередь сосредоточены на поддержке груди сохранения хирургии, или lumpectomy, через маржи оценки. Целью лампэктомии является удаление опухоли и небольшого слоя окружающих здоровых тканей, в отличие от полной мастэктомии, которая удаляет всю грудь. Хирургическая маржа вырезанной ткани затем оценивается с помощью патологии, как только образец был зафиксирован в формалине, секционирован, встроен в парафин, и установлен в 4 мкм-5 мкм ломтиками на слайдах микроскопа. Этот процесс может занять много времени и требует вторичной хирургической процедуры на более позднее время, если положительный запас наблюдается²⁰. Текущие руководящие принципы Американского общества радиационной онкологии определить этот положительный запас, как наличие раковых клеток, контактирующих с поверхностным уровнем чернил²¹. ТГц-изображение для высокоабсорбционной гидратированной ткани в первую очередь ограничивается поверхностной визуализацией с различным проникновением в зависимости от типа ткани, что достаточно для удовлетворения хирургических потребностей быстрой оценки маржи. Быстрый анализ маржинальных условий во время хирургической настройки значительно снизит хирургические расходы и частоту последующих процедур. На сегодняшний день, THz доказал свою эффективность в дифференциациации между раком и здоровой ткани в формин-фиксированной, парафин-встроенных (FFPE) тканей, но дополнительное исследование необходимо обеспечить надежное обнаружение рака в свежевырезанных^{тканей 7}.

В этом протоколе подробно описаны шаги по выполнению тГц-изображений и спектроскопии на свежевырезанных образцах тканей человека, полученных из биобанка. THz приложений, построенных на свежевырезанных тканей рака молочной железы человека редко используются в опубликованных исследований^7,18,22,23, особенно научно-исследовательских групп, не интегрированных с больницей. Использование свежевысеженных тканей также редко для других видов применения рака, с большинством не-грудной рака примеры сообщается для рака толстой кишки^24,25. Одной из причин этого является то, что блоки ткани FFPE гораздо легче получить доступ и обрабатывать, чем свежевысеженые ткани, если система THz используется для исследования является частью хирургического рабочего процесса. Аналогичным образом, большинство коммерческих лабораторных систем THz не готовы обрабатывать свежие ткани, а те, которые все еще находятся в стадии использования роста клеточной линии или только начали смотреть на вырезанные ткани из животных моделей. Для применения ТГц в интраоперационной настройки требует, чтобы визуализация и характеристика шаги были разработаны для свежей ткани заранее, так что анализ не мешает способности выполнять стандартные патологии. Для приложений, которые по своей сути не предназначены для интраоперационной, характеристика свежей ткани по-прежнему является сложным шагом, который должен быть адресован для работы в направлении in vivo приложений и дифференциации.

Цель этой работы заключается в том, чтобы обеспечить руководство для применения THz для свежевысеженых тканей с использованием коммерческой системы THz. Протокол был разработан на THz визуализации и спектроскопии системы²⁶ для опухолей рака молочной железы^13,17,19 и был распространен на хирургические ткани человека, полученные из биобанков^7,18. Хотя протокол был создан для рака молочной железы, те же концепции могут быть применены к аналогичным THz системвизуализации и других типов твердых опухолей рака, которые лечатся с хирургией, где успех зависит от оценки маржи²⁷. Из-за довольно небольшого количества опубликованных результатов ТГц на свежевысешенных тканях, это первая работа, к знаниям авторов, чтобы сосредоточиться на протоколе обработки свежей ткани для ТГц изображений и характеристики.

Protocol

Этот протокол соответствует всем требованиям, установленным Отделом охраны окружающей среды и безопасности Университета Арканзаса.

1. Настройка области обработки тканей

1. Возьмите из нержавеющей стали металлический лоток и покрыть его с биоопасным мешок, как показано на рисунке 1. Любая обработка биологических тканей будет осуществляться в пределах области лотка (т.е. области обработки тканей).
2. Подготовка лабораторных пинцетов, салфетки ткани, бумажные полотенца, фильтровальная бумага пакет, ткани красителя бутылки, отбеливатель бутылку, и этанол бутылку вокруг лотка для легкого доступа, когда это необходимо. Храните любые использованные ткани, салфетки и перчатки на поверхности биоопасных материалов, чтобы избавиться от в конце протокола.
3. Заполните 50 мл центрифуги трубки с до 45 мл 10% нейтральных буферизированных формалин и поместите его в центрифуге хранения лоток вблизи ткани обработки лоток.

Рисунок 1: Настройка области обработки тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

2. Обработка свежей опухоли рака молочной железы для ТГц Трансмиссии спектроскопии

ПРЕДЕКТО: Перед обработкой любых живых тканей, надеть нитриловые перчатки руки, очки для защиты глаз, маску для лица, и лабораторное пальто. Всегда используйте лабораторный пинцет для обработки тканей и не прикасайтесь к ним непосредственно руками. Вся работа со свежей тканью вне герметичной тары или стадии сканирования должна проводиться в области обработки тканей, установленной в шаге 1.1.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все ткани, обрабатываемые в этой работе, были отправлены в модифицированном орле Dulbecco (DMEM) и антибиотикорастворе из биобанка.

1. Удалить объемную опухоль из раствора DMEM и поместить его в чашку Петри на области обработки тканей (см. Рисунок 2A).
2. От валового осмотра, определить различные области опухоли, из которых нарезать мелкие кусочки для передачи характеристики. Вырежьте 0,5 мм толщиной сегмент опухоли из выявленных точек с помощью нержавеющей стали низкопрофильного лезвия, как показано на рисунке 2B. Поместите этот нарезанный раздел между двумя кварцевыми окнами с прокладкой толщиной 0,1 мм в держатель жидкого образца, как показано на рисунке 2C.

Рисунок 2: Секция опухоли для измерений спектроскопии передачи ТГц. (A) Фотография основной опухоли. (B) Фотография небольших участков (0,5 мм) опухоли, вырезанной из основной опухоли. (C) Нарезанная секция опухоли помещена в держатель жидкого образца между двумя окнами кварца с 0,1 мм политетрафторэтиленным прокладкой для измерения спектроскопии. Рисунок, переизданный с сайта T. Bowman et al.¹⁸ с разрешения SPIE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

3. Измерения спектроскопии трансмиссии Передачи ТГц

1. Установите модуль спектроскопии трансмиссии внутри основной камеры ТГц, выровняв ручки модуля по монтажу столбов в основной системе и сдвинув сцену вниз в систему. Затяните два монтажных винта в правом верхнем и нижнем левом углах модуля, как показано на рисунке 3A.
2. Очистка системы с сухим газом азота на 5 л / мин (LPM) в течение всей процедуры спектроскопии для удаления водяного пара из места образца.
3. Откройте программное обеспечение для измерения спектроскопии трансмиссии THz с рабочего стола, подключенного к системе THz. Он откроет главное окно.
4. Нажмите на вкладку Scan в верхней части окна. Появится окно настройки spectra Scan. Из выпадающего меню вкладки «Режим измерения» в правом верхнем правом окне выберите трансмиссию для настройки спектроскопии трансмиссии. Если пик не виден автоматически, проверьте опцию Enable под вкладкой Manual Peak Search и вручную шагите оптическую задержку, чтобы принести пик в поле зрения.
5. После 30 минут очистки, запишите сигнал воздушного справочника, следуя шагам ниже.
   1. Под вкладкой "Настройки сканирования" в окне настройки спектра ввесуте соответствующее имя для справочного файла, установите Num Scans до 1800 и установите задержку start (s) до 0. Оставьте другие параметры в качестве значений по умолчанию.
   2. Нажмите на Справку из мер в окне установки сканирования, чтобы провести измерение воздушной ссылки. Затем нажмите на Measure Sample, чтобы измерить сигнал передачи по воздуху в среднем по образцу 1800 сигналов за 1 мин.

Рисунок 3: Настройка спектроскопии спектроскопии ТГц. (A) THz основной камеры с трансмиссионным модулем, установленным на нем. (B) Фотография держателя жидкого образца. (C) Держатель образца помещен внутри камеры сердечника для измерений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

6. Измерьте два кварцевых окна в держателе жидкого образца, как показано на рисунке 3B.
   1. Поместите два кварцевых окна в держатель жидкого образца без прокладки между ними.
   2. Откройте основную камеру THz. Установите держатель жидкого образца на модуль спектроскопии передачи, как показано на рисунке 3C. Закройте камеру.
   3. Нажмите на вкладку Scan на главном окне. Повторите шаги 3.5.1-3.5.2 для образца кварца, но обновите Start Delay (s)до 900. Это позволяет время для очистки любого водяного пара перед измерением.
   4. Если кварц пожелает быть эталоном для дополнительных образцов, нажмите на вкладку Clear Reference под настройками сканирования. Это очищает воздушную ссылку. Затем нажмите на вкладку Measure Reference, чтобы записать измерения кварца в качестве новой ссылки.
7. Поместите нарезанный раздел опухоли между двумя кварцевыми окнами внутри держателя жидкого образца и поместите держатель внутри камеры для измерения одной точки передачи ткани. Для записи измерения повторите шаг 3.6.3.
8. Выньте держатель жидкого образца из камеры, когда измерения будут завершены, и доведите его до области, предназначенной для обработки тканей. Разобрать держатель жидкого образца, протрите опухоль из кварцевых окон салфетками и поместите использованные салфетки ткани в тот же лоток, чтобы утилизировать в пакете биоопасности вместе с другими биоопасными отходами.
9. Повторите шаги 2.2, 3.7 и 3.8 по мере необходимости для характеристики дополнительных ломтиков опухоли. Когда измерения будут завершены, перейдите к основному окну и нажмите на вкладку Файл, чтобы сохранить данные измерений. Закройте окно программного обеспечения.

4. Обработка свежих опухолей рака молочной железы для THz Отражение Режим визуализации

1. Удалите свежий образец опухоли из раствора DMEM и антибиотиков и поместите его на чашку Петри. Используя грубый осмотр, выберите сторону опухоли, которая будет изображена, которая является достаточно плоской и имеет мало крови и мало кровеносных сосудов. Избегайте визуализации тканей с кровью или кровеносными сосудами, если это возможно.
2. Поместите опухоль со стороны, чтобы быть изображены на классе 1 фильтровальной бумаги, чтобы высушить избыток DMEM и очистить ткани жидкости или выделений из опухоли, как показано на рисунке 4A. Переместите опухоль на фильтровальную бумагу в сухое место, когда бумага насыщает. Высушите опухоль в течение 5 мин.

Рисунок 4: Свежий образец опухоли подготовки к ТГц изображений. (A) Опухоль помещается на фильтровальной бумаге, чтобы высохнуть. (B) Опухоль помещается на полистирол пластины над окном изображения с тканью протрите колодки, чтобы поглощать избыток жидкости. (C) Опухоль рассматривается снизу для отслеживания ориентации и проверить на пузырьки воздуха. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

3. Открепите модуль спектроскопии передачи и установите зеркальный модуль отражения (RIM) на основной системе ТГц, как показано на рисунке 5A. При установке зеркал, смонтировать RIM сканирование этапе над зеркалом базы и винт его в основной системы (см. Рисунок 5B).
4. Очистите систему сухим азотным газом при 5 ЛПМ в течение 30 минут до процедуры визуализации для удаления водяного пара из отсека образца. После 30 минут, уменьшить количество сухого азота газа до 3 ЛПМ для остальной части времени система находится в использовании.
5. Поместите полистирол толщиной 1,2 мм на сканирующее окно диаметром 37 мм. Центр сканирования окна вместе с полистироловой пластиной на этапе образца.

Рисунок 5: Установка системы для визуализации отражения. (A) Отражение изображения модуль зеркального основания. (B) Этап сканирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

ПРИМЕЧАНИЕ: Другие толщины и материалы пластины подходят для шага 4.5, но должны иметь однородную толщину и быть достаточно низким поглощения, чтобы не препятствовать сигналу THz.

6. Откройте программное обеспечение для измерения отражения ТГц с рабочего стола, подключенного к системе THz. Всплывающее окно будет показывать несколько значков диалогов для определенных функций и два подоконных окна для полевых участков THz (произвольные единицы a.u.) против времени и частоты, соответственно.
7. Чтобы установить параметры настройки Rim, нажмите на значок Параметры изображения Dialog в верхней части окна. Окно параметров приобретения изображения появится. Выберите ОПРАВА от drop-down меню вкладки шаблона для настраивать воображения отражения. Хит OK и вернуться к главному окну программного обеспечения.
8. На главном окне нажмите на значок сканирования фиксированной точки. Это позволит активировать антенны THz, чтобы начать отправку сигнала ТГц и получать отраженный сигнал ТГц из одной точки на полистироловой пластине.
9. Нажмите на значок Dialog motor Stage в верхней части основного окна. Окно управления мотором откроется. Отрегулируйте оптическую ось задержки, нажав на стрелки переднего/обратного направления, чтобы центрировать отраженный импульс от полистирола в главном окне.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После регулировки оптической оси задержки на окне должны появиться два импульса, как показано на рисунке 6:один из нижнего интерфейса полистироловой пластины (первичное отражение), а один из верхнего интерфейса полистироловой пластины (вторичное отражение).
10. Окно из первичного отражения от полистирола пластины и сохранить вторичное отражение в окне, что будет способствовать отражения из ткани во время процедуры визуализации. Это делается в два этапа.
    1. Во-первых, нажмите на кнопку настройки ДАЗ в верхней части главного окна, чтобы открыть окно диалога настроек ДАЗ. Измените значение оптической задержки с 5 V (по умолчанию) на 4 V.
    2. Во-вторых, отрегулируйте вертикальное положение стадии сканирования с микрометровой шкалой на стадии сканирования до тех пор, пока минимальная частота вторичного импульса не будет самой сильной. Отрегулируйте оптическую задержку оси в окне управления мотором, чтобы поместить первичное отражение вне диапазона измеренного отраженного сигнала.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Для пластины полистирола толщиной 1,2 мм первичное отражение выкрывается, когда минимальный пик вторичного отражения составляет примерно -0,3 мм на оптической оси задержки временного домена.

Рисунок 6: ТГц отражения от нижних и верхних интерфейсов полистирол пластины. (A) THz сигнал аксоциируется и отражается от 1,2 мм толщиной полистирол пластины. (B) Измеренные первичные и вторичные THz время домена сигналов от полистирола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

11. Уровень стадии образца и запишите эталонный сигнал.
    1. Выберите две точки на каждой оси (A-оси и B-оси), которые обозначают места на полистирол пластины вблизи края окна образца. Например, для оси А от -15 мм до 15 мм две точки положения могут быть -10 мм и 10 мм; а для B-оси от -15 мм до 15 мм две точки положения могут быть -10 мм и 10 мм.
    2. Нажмите на кнопку Управления мотором Dialog, чтобы открыть окно управления двигателем. Переместите окно управления двигателем и основное окно программного обеспечения таким образом, чтобы сигнал домена времени был виден при регулировке положения двигателя. Установите и оси А, и B-оси до 0 мм.
    3. Уровень A-оси, используя следующие шаги. В качестве примера приводится дальность действия -10 мм-10 мм.
    4. В окне управления моторомизмените значение оси A с 0 до -10 и нажмите Enter. Этап перемещается в положение -10 мм на оси А и наблюдается сдвиг в положении сигнала на главном окне.
    5. Используйте регулируемую шкалу микрометра на этапе сканирования, показанную на рисунке 5B, чтобы переместить минимальный пик сигнала обратно в положение, установленное в шаге 4.10.2.
    6. Измените значение A-оси на 10 евро и нажмите введите. Теперь этап будет перемещаться из положения -10 мм в положение 10 мм на оси А, и снова наблюдается сдвиг в сигнале. Обратите внимание на направление и расстояние, которое сигнал сместился от прежнего положения, и снова измените значение A-оси до -10. Сигнал вернется в положение, установленное в шаге 4.11.5.
    7. Поверните винт выравнивания на оси А-оси стадии сканирования, как показано на рисунке 5B, и сместите сигнал, чтобы удвоить расстояние в том же направлении, в котором он двигался из исходного положения. Используйте микрометр на стадии сканирования, чтобы сместить сигнал обратно в исходное положение (-0,3 мм на 1,2 мм полистирола).
    8. Повторите шаги 4.11.6-4.11.7 до тех пор, пока сигнал на 10 и -10 не будет равным, а пик для обеих позиций будет сосредоточен на исходном положении (-0,3 мм на оптической оси).
12. Как только выравнивание оси A достигается, измените значение A-оси до 0 и повторите ту же процедуру для B-оси. Начните с изменения значения B-оси на окне управления двигателем с 0 до наиболее положительного значения (например, 10 мм). Кроме того, при выравнивании используйте винт выравнивания на B-оси стадии сканирования, которая показана на рисунке 5B.
13. Как только обе оси выровняются, верните обе ось и b-оси до 0 мм. Закройте окно управления мотором и убедитесь, что сигнал находится в исходном положении в случае, если он немного сдвинут.
14. Запишите этот сигнал в качестве ссылки.
    1. Перейдите к установленной окне свойств ДАЗ. Измените значение усреднения до 5 и сохраните все остальные параметры по умолчанию.
    2. Нажмите на новую ссылку. Счетчик усреднения в правом верхнем правом окне будет считаться от 0 до 20. Как только счетчик достигает 20, измените значение усреднения до 1 и нажмите OK. Отраженный сигнал от полистирола будет сохранен в качестве ссылки на любые сканирование, сделанное позже.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Если только процедура визуализации THz должна быть выполнена, то лучше всего выполнить шаги 4.3-4.14 перед взятием ткани опухоли из раствора DMEM.
15. Установите опухоль на полистирол пластины, покрывающей окно стадии сканирования.
    1. Удалите окно изображения со стадии сканирования и доведите его до области обработки тканей. Поместите опухоль на полистирол пластины, как показано на рисунке 4B.
    2. Убедитесь, что между пластиной и опухолью нет значительных пузырьков воздуха. Если пузырьки воздуха наблюдаются, нажмите на опухоль с помощью пинцета или поднимите опухоль и аккуратно свернуть его на полистирол, пока воздушные зазоры сведены к минимуму.
    3. Поместите абсорбтивные прокладки через регулярные промежутки времени вокруг испытательного образца, как показано на рисунке 4B. Поместите другую пластину полистирола над опухолью и нажмите осторожно, чтобы сделать поверхность опухоли как можно более плоской. Лента вниз это полистирол-опухолево-полистирол договоренности на пробе окна.
16. Переверните окно образца, как показано на рисунке 4C, и сфотографируйте опухоль, чтобы вести учет ее ориентации. Верните окно образца с опухолью на стадию сканирования.
17. Нажмите на кнопку Dialog параметра изображения, чтобы открыть окно параметров приобретения изображения. Установите значения Axis1min, Axis1max, Axis2minи Axis2max, чтобы полностью закрыть положение опухоли в окне изображения
    ПРИМЕЧАНИЕ: По умолчанию, Axis1 является оси А, а Axis2 - B-оси.
18. Установите Axis1step и Axis2step до 0,2 мм для сканирования изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установка Axis1step и Axis2step установит размер шага двигателей до 200 мкм шагом во время процесса сканирования. Общее время сканирования можно оценить в окне параметров приобретения изображения.
19. Нажмите на вкладку «Мера» на главном окне и выберите опцию Flyback 2D Scan. В окне, которое всплывает, укажите каталог и имя файла, под которым можно сохранить данные сканирования.

5. Постобработка свежих тканей в рамках подготовки к процедуре гистопатологии

1. По завершении процесса сканирования удалите окно образца, полистироловые пластины и образец из основной системы ТГц и переместите их в район, предназначенный для опасных отходов. Удалить опухоль из полистирол пластины и поместить его на плоский кусок картона размерсопоставимого с опухолью. Убедитесь, что ориентация опухоли такая же, как это было на полистирола, с изображением лица касаясь картона.
2. Dip ватный тампон в красный краситель ткани и пятно левой стороне опухоли до того, где край опухоли контактов картона. Аналогичным образом, пятно правой стороне опухоли с голубой краской ткани. Пятно открытой поверхности опухоли с линией желтого красителя ткани подключения красного пятна к синим пятном, чтобы обозначить задней части образца, как показано на рисунке 7A.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения чернил от окрашивания раствора формалина, нанесите только тонкий слой на ткани. Это может быть достигнуто путем dabbing ватный тампон на другой поверхности, прежде чем окрашивать ткани или с помощью чистого ватного тампона, чтобы стереть лишний краситель. Избегайте позволяя красителя контакт кожи или одежды. Этот процесс окрашивания опухоли проводится в качестве ссылки для предоставления информации о стороне изображения опухоли и ее ориентации на патологоанатома.

Рисунок 7: После обработки опухоли после ТГц изображения. (A) Опухоль помещена лицом вниз на картонном держателе и окрашена красителем маркировки ткани. (B) Фильтровая бумага, размещенная над опухолью и записанная на пленку для поддержания контакта. (C) Запятнанная опухоль зафиксированная на картоне погруженная в 10% нейтральный буферизированный раствор формалина и загерметизированная с parafilm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

3. Дайте чернилам высохнуть в течение 3-4 мин. Вырезать кусок фильтровальной бумаги с теми же приблизительными размерами, как картон. Поместите его на опухоль и оберните кусок ленты полностью вокруг фильтровальной бумаги и картона, как показано на рисунке 7B. Лента и фильтровальная бумага должны обезопасить опухоль от картона, не применяя какого-либо значительного давления.
4. Погрузите окрашенные ткани, прикрепленные к картону в 10% нейтральный буферизированный раствор формалина и запечатайте центрифугу трубки с помощью парафина пленки, как показано на рисунке 7C. Назначьте номер образца, дату, тип ткани и номер опухоли для образца на этикетке трубки. Отправить опухоль патологоанатому для дальнейшей обработки гистопатологии.

6. Удаление опасных отходов

1. Соберите все отходы из лотка обработки тканей вместе с биоопасным пакетом, используемым для покрытия лотка, и поместите его в новый мешок для биоопасности, как показано на рисунке 8. Принесите сумку в назначенную зону биоопасных отходов в здании и запиши встречу в отдел по охране окружающей среды и безопасности (EH и S) для сбора отходов. Очистите лоток для обработки тканей и прилегающую территорию на столе с 10% отбеливатель раствором и этанолом.

Рисунок 8: Фотография биоопасного мусорного мешка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

2. Возьмите держатель жидкого образца с прокладками и кварцевыми окнами, окно для отбора проб, на котором была установлена опухоль, полистирол пластины, и лабораторные пинцеты в области стирки. Промыть все материалы водой, а затем 10% отбеливатель раствор, вытирая бумажными полотенцами по мере необходимости для удаления ткани мусора. Снова промыть водой, скраб с раствором alconox, и тщательно промыть. Для стекла и пластичной посуды промыть 70% изопропилового спирта и отложить в сторону, чтобы высохнуть.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как опухоль находится в формалин и образец пространства является чистым, обработка данных может быть обработана в то же время, как изображение или позднее время.

7. Обработка данных для построения изображений THz

1. Экспорт сохраненных файлов данных .tvl из системы THz. Необработанные файлы данных, полученные из системы, написаны в Python и лучше всего читать в Python, прежде чем сохранять файлы данных MATLAB.
2. Чтобы создать изображение ТГц отсканированной свежей ткани, преобразуйте данные отражения исходного времени в область частоты с помощью преобразования Фурье на третьем измерении необработанной матрицы данных (т.е. измерения времени). Также возьмите фурье преобразование справочных данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный спектр частотных доменов должен предоставлять данные в диапазоне от 0,1 ТГц-4 ТГц.
3. Нормализовать выборочные данные с помощью справочных данных и выполнить спектр ы мощности на основе интеграции нормализованных данных по диапазону частот от f₁ и 0,5 ГГц до f₂ и 1,0 THz с использованием следующего уравнения¹⁹:
   
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь _{E образец} частоты домена отражения изображений данных образца ткани и E_ссылка является частотным доменом одной точки отражения данных эталонного сигнала.
4. Постройте двухмерное изображение, построив расчетные данные спектра мощности в каждой точке матрицы, определяемой а-оси и B-оси. Это известно как изображение спектра питания THz.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо этого метод получения томографического изображения THz подробно описан в шагах 7.5-7.7.
5. Для характеристики вычислите теоретическое частотно-зависимое отражение для ряда потенциальных свойств ткани, используя следующее уравнение¹⁸:
   
   ПРИМЕЧАНИЕ: Here _{-T, ij} является сложным коэффициентом отражения Френеля между областью i и областью j;d_j является толщиной области j; и _j является углом распространения в регионе j, связанных с углом заболеваемости по закону Снелла. является сложным коэффициентом распространения в области j, где q является угловой частотой, c является скорость света в вакууме, n_j является реальной частью рефракционного индекса, и _{абс, j} является коэффициентом поглощения¹⁸. Регион 1 - это воздух, регион 2 - полистироловая пластина, а регион 3 - ткань.
6. Рассчитайте отражение в уравнении (2) для диапазона определяемых пользователем рефракционных индексов и коэффициентов поглощения для Региона 3(n₃ и_abs,3)и сравните с измеренным сигналом в каждой точке для расчета комбинированной средней квадратной ошибки для величины и фазы. α
   ПРИМЕЧАНИЕ: Решением коэффициента рефракционного индекса и поглощения является пара значений, дающих самую низкую ошибку.
7. Постройте томографическое изображение ТГц из извлеченных рефракционных данных и коэффициентов поглощения(n₃ и_abs,3)на каждом пикселе. α Проанализируйте опухолевые области, сравнивая с патологией слайд-изображение, полученное от патологоанатома. Репрезентативные результаты показаны на рисунке 9, с примерами недостаточного соблюдения протокола на рисунке 10 и рисунке 11.

8. Извлечение электрических свойств тканей с использованием трансмиссионных данных спектроскопии

1. На главном окне программного обеспечения для измерения спектроскопии трансмиссии THz перейдите на вкладку Файл и нажмите на опцию Экспорт. Для выбора типа данных и образца для экспорта появится окно. Выберите типы данных фазы передачи и передачи для измерений кварца и образца ткани.
2. Рассчитайте теоретическую частотно-зависимую передачу для целого ряда потенциальных свойств тканей с помощью следующего уравнения^15:
   
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вот соотношение между коэффициентами передачи Френеля для образца и эталонных населок; _{No 1} и No ₃ являются сложными константами распространения воздуха и тканей, соответственно; и d толщина ткани. Постоянное распространение в целом определяется как . - это сложный рефракционный индекс, определяемый как , где n является реальной частью рефракционного индекса; c - это скорость света; Угловая частота; и _абс является коэффициентом поглощения¹⁵.
3. Рассчитайте комбинированную среднее квадратное погрешность между величиной и фазой передачи в уравнении (3) и данные измерений из системы для диапазона пользовательских значений n и_abs. α
   ПРИМЕЧАНИЕ: Решением коэффициента рефракционного индекса и поглощения является пара значений, дающих самую низкую ошибку.
4. Участок извлеченных рефракционных данных индекса и коэффициента поглощения в диапазоне частот от 0,15-3,5 ГГц. Figure 12

Results

Результаты tHz изображений^18, полученные в соответствии с вышеупомянутым протоколом образца опухоли молочной железы человека, #ND14139 получены из биобанка, представлены на рисунке 9. Согласно отчету о патологии, #ND14139 опухолью была I/II класса инфильтрации протоковой карциномы (IDC), полученные от 49-летней женщины через процедуру хирургии левой груди lumpectomy. Фотография опухоли показана на рисунке 9A, изображение патологии на

Discussion

Эффективная визуализация тГц свежих тканей в первую очередь зависит от двух важнейших аспектов: 1) надлежащего рассмотрения обработки тканей (разделы 2 и 4.15); и 2) установка сцены (прежде всего раздел 4.11). Недостаточное высыхание тканей может привести к увеличению отражения и неспособности визуализировать регионы из-за высоких отражений DMEM и других жидкостей. Между тем, плохой контакт ткани с окном изображения создает кольца или пятна низкого отражения в изображении отражения THz которые затемнят результаты. Дополн...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% изопропиловый спирт	VWR	89108-162	Содержит 70% изопропанола марки USP и 30% деионизированной воды марки USP Порошковое
моющее средство Alconox	VWR	21835-032	Концентрированное моющее средство для удаления органических загрязнений из стекла, металла, нержавеющей стали, фарфора, керамики, пластика, резины и стекловолокна
Пакеты для биологической опасности	Fisher Scientific	19-033-712	Одобренные Justrite FM контейнеры для замены контейнеров для биологически опасных отходов
Картонный держатель	Н/Д	Н/Д	Обрезной картон для сохранения лица для визуализации тканей при погружении в формалин
Центрифужные пробирки	VWR	10026-078	Центрифужные пробирки с плоским колпачком, с коническим дном, полипропиленовые, стерильные, ватные
палочки	Walmart	551398298	ватные палочки Q-Tip, используемые для окрашивания ткань
Этиловый спирт	VWR	71002-426	KOPTECH Чистый (неденатурированный) безводный (200 proof/100%) этиловый спирт
Защитные очки для глаз	VWR	89130-918	Профессиональные защитные очки Kimberly-clark
Маска для лица	VWR	95041-774	DUKAL Corporation хирургические маски
Фильтровальная бумага	Sigma Aldrich	Z240087	Whatman класс 1 целлюлозные фильтры
Раствор формалина	Sigma Aldrich	HT501128-4L	10% нейтральный буферизованный формалин
Свежеиссеченные опухоли человека (Инфильтрующая протоковая карцинома (IDC))Национальный	исследовательский обмен болезнями (NDRI биобанк	N/A	Протокол подписан с NDRI для типа требуемых опухолей
IRADECON Bleach раствор	VWR	89234-816	Предварительно разведенный раствор отбеливателя гипохлорита натрия
Салфетки KIMTECH SCIENCE	VWR	21905-026	Kimberly-clark professional Салфетки Kim
Лабораторное покрытие	VWR	10141-342	Этот каталожный номер относится к среднему размеру пальто
Лабораторный пинцет/щипцы	VWR	82027-388	Можно использовать любой лабораторный пинцет, если он не повреждает ткань
Держатель жидкого образца (два кварцевых окна с тефлоновым прокладкой 0,1 мм)	TeraView, Ltd	Н/Д	Кварцевые окна диаметром 1" и толщиной 0,1452
Нитриловые перчатки для рук	VWR	82026-426	Этот каталожный номер относится к перчаткам среднего размера
Баллон с азотом	Airgas	NI UHP300	NITROGEN UHP GR 5.0 РАЗМЕР 300
Бумажное полотенце	VWR	14222-321	11" x 8.78" Листы, 1 слой
Парапленка	VWR	52858-076	Гибкий термопластик. Свернутый, водонепроницаемый лист смотан бумагой для предотвращения самоприлипания.
Чашка Петри	VWR	470210-568	VWR Чашка Петри, сдвижная, монопластина (неразделенное дно)
Полистирольная пластина	Home Depot	1S11143A	~ квадратный кусок 10 см x 10 см, вырезанный из антибликового листа стирола размером 11 x 14 x 0,05 дюйма
Программное обеспечение ScanAcquire	TeraView, Ltd	Н/д	Системное программное обеспечение для измерения ТГц изображений
Низкопрофильное лезвие из нержавеющей стали (#4689)	VWR	25608-964	Tissue-Tek Accu-Edge Одноразовые лезвия для микротомов
Металлический лоток из нержавеющей стали Quick	Medical	10F	Polar Ware Лотки для медицинских инструментов из нержавеющей стали Красители
маркировки тканей Ted	Pella, Inc	Желтый краситель #27213-1 Красный краситель #27213-2 Синий краситель #27213-4	Используется для ориентации иссеченных образцов тканей отправлен в лабораторию гистопатологии
TPS Spectra 3000	TeraView, Ltd	N/A	Система визуализации и спектроскопии ТГц
TPS Spectra Software	TeraView, Ltd	Н/Д	Системное программное обеспечение для измерений ТГц-спектроскопии