Мы описываем intracisternal инъекции, которая использует иглу согнуты на кончике, которые могут быть стабилизированы к черепу, тем самым устраняя риск повреждения основной parenchyma. Этот подход может быть использован для генетического отображения судьбы и манипуляций лептоменангеновых клеток и для отслеживания движения спинномозговой жидкости.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Индукция Leptomeningeal клеток Модификация через интрасистскую инъекцию
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В описанном здесь протоколе описывается, как безопасно и вручную вводить растворы через цистерну Магна, устраняя при этом риск повреждения основной паренхимы. Ранее опубликованные протоколы рекомендуют использовать прямые иглы, которые должны быть снижены до максимум 1-2 мм от поверхности dural. Внезапное падение сопротивления после того, как dural мембрана была проколота делает его трудно поддерживать иглу в устойчивом положении. Наш метод, вместо этого, использует иглу согнуты на кончике, которые могут быть стабилизированы против затылочной кости черепа, тем самым предотвращая шприц от проникновения в ткани после перфорации dural мембраны. Процедура проста, воспроизводима и не вызывает длительного дискомфорта у оперированных животных. Мы описываем стратегию инъекций в контексте генетической судьбы, отображающей сосудистые лептоменингеальные клетки. Кроме того, тот же метод может быть использован для решения широкого круга научных вопросов, таких, как зондирование роли лептоменингов в нейроразвитии и распространении бактериального менингита, путем генетической абляции генов, которые, как предполагается, причастны к этим явлениям. Кроме того, процедура может быть объединена с автоматизированной инфузионной системой для постоянной доставки и использована для отслеживания движения спинномозговой жидкости через инъекцию флуоресцентно обозначенных молекул.
Введение
Leptomeningeal клетки фибробласт-как популяция клеток организованы в тонком слое наложения мозга и выражения генов, причастных к коллагена перекрестные (например, Dcn и Лам), и в создании мозга менингеального барьера (например, Cldn11)1,2. Лептоменингеальные клетки вовлечены в широкий спектр физиологических функций, от строгого контроля над спинномозговой жидкости дренажажиотажа 3 для руководства нейронных прародителей в развивающихся мозга4,5. Недавнее исследование также предложило, что лептоменинги у новорожденного могут гавани радиальных глиаподобных клеток, которые мигрируют в мозг паренхимы и развиваются в функциональные корковые нейроны6.
Лептоменингеальные клетки расположены в непосредственной близости от поверхностных астроцитов и делятся с ними, а также другими паранхимальной астроглией, выражением коннексина-30 (Cx30)7. Хирургическая процедура, описанная ниже, позволяет широко и специфическую маркировку этих менингеальных клеток с помощью одноразовой доставки эндоксифена в+ цистерну магны трансгенных мышей, условно выражающих tdTomato в клетках Cx30 (т.е., с помощью системы CreER-loxP для картирования судьбы). Эндоксифен является активным метаболитом тамоксифена и индуцирует рекомбинацию Клеток, выражающих CreER, так же, как и тамоксифен. Это, однако, рекомендуемое решение для местного применения, поскольку он растворяется в 5-10% DMSO, вместо высоких концентраций этанола. Кроме того, эндоксифен не пересекает мозг-менингеальный барьер, тем самым позволяя специфическую рекомбинацию лептоменингеальных клеток, без маркировки лежащих в основе Cx30- астроглиальной популяции (см. Представитель Результаты).
Техника, представленная здесь, направлена на ручной и безопасной инъекции соединения в спинномозговой жидкости, через прямой доступ к цистерны magna. В отличие от других, более инвазивных процедур, требующих краниотомии, этот подход позволяет наполнить соединения без нанесения ущерба черепу или мозгу паренхимы. Таким образом, это не связано с индукцией воспалительных реакций, вызванных активацией клеток паренхимальной глии. Как и другие стратегии инъекций, описанные до8,9,10, нынешний подход опирается на хирургическое воздействие atlanto-затылочной дурфальной мембраны, охватывающей цистерну магны, после тупого вскрытия наложения мышц шеи. Однако, в отличие от других процедур, мы рекомендуем использовать иглу, согнутую на кончике, которая может быть стабилизирована против затылочной кости во время введения. Это предотвратит риск проникновения иглы слишком глубоко и повреждения основного мозжечка и медуллы.
Эта хирургическая процедура совместима с исследованиями отслеживания линий, которые направлены на отображение изменений в идентичности клеток и маршрутах миграции через паранхимальные слои. Он также может быть адаптирован к генетическим исследованиям абляции, которые намерены зондировать роль лептоменингеальных клеток в здоровье и болезни, такие как их вклад в корковое развитие5 или распространение бактериального менингита3,11. Наконец, он может быть использован для отслеживания движения спинномозговой жидкости в сочетании с доставкой флуоресцентных трассаторов у диких животных.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Представленные в настоящее время хирургические процедуры были одобрены Стокгольмским Норре Джурсёксетиской Нюмнди и проведены в согласии со спецификациями, предоставленными научно-исследовательским институтом (Каролинский институт, Швеция).
ПРИМЕЧАНИЕ: Инрасистальная инъекция может быть гибко адаптирована для различных исследовательских целей. Мы представляем ниже процедуры, разработанной для эффективной маркировки leptomeningeal клеток для судьбы отображения на основе инъекции endoxifen в трансгенной линии мыши проведения R26R-tdTomato12 и CreER, последний под Cx30 промоутер13. Маркировка этой популяции клеток может быть достигнута путем инъекций вирусных конструкций с использованием той же процедуры, изложенной ниже. Наконец, этот подход может быть использован для отслеживания спинномозговой жидкости потока, путем вливания флуоресцентных трассаторов.
1. Подготовка системы инъекций
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуем проводить процедуру в подходящем хирургическом кабинете и в асептических условиях. Хирургические инструменты могут быть стерилизованы с помощью тепла (автоклав, стеклянный стерилизатор) или дезинфицировать с помощью высокоуровневого химического дезинфицирующего средства, если они чувствительны к жаре. Промыть приборы перед использованием при применении химической дезинфекции или дать им остыть при дезинфекции с теплом.
- Используя щипцы, согните иглу шприца для инъекций до 30 градусов при 3 мм от кончика.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте шприцы Hamilton с 30 G сбитом иглой. - Приготовьте 1 мг/мл раствора эндоксифена, разбавленного 10% DMSO и заполните шприц согнутой иглой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Администрирование 5 зЛ соединения для обеспечения широкого воздействия менингеальных клеток во взрослой c57Bl/6j мыши (около 25-30 г), хотя экспериментальные эксперименты, которые проверяют различные концентрации и объемы инъекций может быть необходимо при лечении животных разных возрастов и штаммов. - Отрегулируйте держатель головки мыши так, что часть рта на приблизительно 30 «от поверхности хирургического таблицы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой процедуры также может использоваться стереотаксическая рамка с трехточечной фиксацией (т.е. ушами и ртом). В этом случае, однако, животное будет исправлено только с частью рта, в то время как ухо баров может быть продлен под передние конечности животного и использоваться для поддержки тела животного во время процедуры.
2. Индукция анестезии
- Для инъекционных анестезий, использование концентраций и способов управления рекомендованы ветеринарной единицы в местном учреждении.
- Для ингаляционной анестезии, таких как изофлюран, подготовьте административный блок в соответствии со спецификациями производителя.
- При изофруране установленная концентрация соединения на уровне 4% для индукции анестезии.
- Доставка воздуха со скоростью 400 мл/мин.
- Разрешить анестезии блок для заполнения камеры с анестезией в течение нескольких минут и поместить мышь в камеру после этого.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для нынешних экспериментов мы использовали взрослых (2 месяца и примерно 30 г) мужских и женских трансгенных мышей, несущих Cx30-CreER и R26R-tdTomato, и выведенных на фоне C57Bl/6j. - Мониторинг животного во время индукции анестезии. Дыхание должна замедлиться, когда мышь находится под полной анестезией.
- Удалите животное из камеры и проверьте на подавление рефлекса лапы, деликатно щипая задние лапы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рефлекс все еще может присутствовать, но задерживается на пару секунд. Если это так, поместите животное обратно в камеру до полного подавления лапы рефлекс был достигнут. - Администрирование анальгетика (например, карпрофен, 5 мг/кг через подкожную инъекцию) для оказания помощи послеоперационному обезболиванию.
3. Позиционирование животного для процедуры
- Закрепите голову животного на держатель для головы. Для улучшения доступности цистерны magna, положение тела животного примерно на 30 "от поверхности стола и головы, названной вниз, чтобы установить угол 120" с остальной частью тела и расширить задней части шеи, чтобы облегчить доступ к цистерны магны (Рисунок 1A).
- Добавить бумажные полотенца под животное, чтобы поддержать его тело на протяжении всей процедуры.
- Безопасная доставка анестезии через рот кусок и уменьшить концентрацию изофлуран до 2,5% и доставки воздуха до 200 мл/ мин.
- Нанесите офтальмологическую мазь.
4. Экспозиция Цистерны Магна
- Бритье задней части шеи животного и дезинфицировать области с 70% этанола и бетадин.
- Используя хирургические ножницы, выполните разрез средней линии (около 7 мм в длину), начиная с уровня затылочной кости и расширяя ее задним щипцем.
- Аккуратно отделить поверхностные соединительной ткани и мышцше вытягивая боком от средней линии с тонкой наконечником пинцета. Это позволит разоблачить dural мембраны наложения цистерны magna, в форме перевернутого треугольника.
- Используйте стерильные копья поглощения или ватные тампоны, чтобы контролировать любое резистское кровотечение.
- Позиция небольшой хирургический сепаратор для поддержания мышц шеи вытащил в сторону и позволяют визуализации цистерны magna на протяжении всей процедуры.
5. Инрасистская инъекция
- Чтобы получить доступ к цистерны магны, определить каудаальный конец затылочной кости и вставить иглу, которая ранее была согнута сразу под.
ПРИМЕЧАНИЕ: Там будет внезапное падение сопротивления, как dural мембрана проколота. Тем не менее, кончик иглы будет проникать лишь немного под менингеальной поверхности, благодаря своей зацепленным формами. - После того, как dura была перфорирована, позвольте изогнутой кончик иглы проникнуть под поверхностью дюрара, осторожно потянув шприц вверх и параллельно телу животного, для того, чтобы "крючок" иглы к черепу (см. Рисунок 1B). Это обеспечит лучшую стабильность и предотвратит проникновение иглы глубже, тем самым избегая риска повреждения основного мозжечка или медуллы.
- Вводят соединение медленно, чтобы избежать вмешательства в естественный поток спинномозговой жидкости.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от цели эксперимента, скорость инфузии может варьироваться. Если требуется медленный и устойчивый инфузионный темп (например, при использовании процедуры для отслеживания движения спинномозговой жидкости), может быть целесообразным использовать автоматизированную систему микроинфузии в сочетании со шприцем. - После инъекции, пусть игла отдыхана в месте в течение 1 мин и тщательно удалить его. Используйте мелкие щипцы наконечник, чтобы помочь опрокидыванию иглы из его крючковатого положения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование тонкой иглы (например, 30 G) не приводит к существенному повреждению менингеальной мембраны и последующему оттоку спинномозговой жидкости. Если требуются большие размеры игл, мы рекомендуем остановить утечку жидкости, применяя давление в месте инъекции с помощью стерильного кончика хлопка.
6. Заключение процедуры и послеоперационного ухода
- Удалите сепаратор и позвольте мышцам вернуться к исходной позиции, накладывающей на дуральную мембрану.
- Закройте разрез кожи с помощью нескольких капель цианоакрилата клея.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, используйте абсорбируемые швы (например, 5-0 швы vicryl) и закройте разрез кожи с прерванными швами. - Нанесите местную анестезию (например, 100 л 5% лидокаина) на место разреза.
- Удалите животное из держателя и поместите в чистую клетку, расположенную на грелке. Следите за животным, пока оно не придет в сознание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура не должна вызывать длительную боль или страдания у животного. Тем не менее, мышь должна быть тщательно проверена в течение первых послеоперационных дней и меры по облегчению боли могут быть предприняты, когда это сочтет необходимым, и в соответствии с рекомендациями, предоставленными ветеринарным подразделением в вашем учреждении.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Инрасистальная инъекция эндоксифена у трансгенных мышей, выражающих CreER под промоутером Cx3013 и индуцированным флуоресцентным репортером, позволяет проводить специфическую рекомбинацию лептоменингеальных клеток без маркировки соседней поверхности Cx30 и паренхимальных астроцитов в коре головного мозга(рисунок 1). Для того, чтобы получить доступ к цистерны magna, обезболилиальное животное расположено с его телом и головой под углом п...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол, изложенный здесь представляет собой простую и воспроизводимую процедуру для обозначения лептоменингеальных клеток для картирования судьбы. Мы используем инрасистскую инъекцию эндоксифена, активного метаболита тамоксифена, чтобы вызвать выражение флуоресцентного репортера tdTomato в Cx30-CreER; R26R-tdTomato мышей12,13.
По сравнению с другими протоколами, используемыми для получения доступа к спинномозговой жидкости через цист...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих интересах.
Благодарности
Это исследование было поддержано грантами Шведского научного совета, Шведского онкологического общества, Шведского фонда стратегических исследований, Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse и Программы стратегических исследований в области стволовых клеток и регенеративной медицины Каролинского института (StratRegen).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Анестезиологический блок | Univentor 410 | 8323102 | В комплекте с испарителем, камерой и трубкой, которая соединяется с камерой и держателем головы мыши |
| Анестезия (изофлуран) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Бетадин | Сигма-Олдрич | PVP1 | |
| Карпрофен | Орион Фарма AB | 014920 | Коммерческое название Римадил |
| Цианоакрилатный клей | Carl Roth | 0258.1 | Используйте шелковые шовные материалы 5-0, в альтернативе |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Этанол 70% | Histolab | 01370 | |
| Шприц Hamilton (30 г скошенная игла) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
| Держатель головы мыши | Narishige International | SGM-4 | С мундштуком для ингаляционных ангестетиков. В качестве альтернативы можно использовать стереотаксическую рамку |
| Ножницы | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Shaver | Aesculap | GT420 | |
| Стерильные абсорбционные копья | Fine Science Tools | 18105-01 | Стерильные ватные палочки также являются хорошим вариантом |
| Хирургический сепаратор | World Precision Instrument | 501897 | |
| пинцет | Dumont | 11251-35 | |
| Вискослезы | Bausch& Lomb Nordic AB | 541760 |
Ссылки
- Vanlandewijck, M., et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).
- Whish, S., et al. The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to the brain via intercellular junctions. Frontiers in Neuroscience. 9, 16(2015).
- Weller, R. O., Sharp, M. M., Christodoulides, M., Carare, R. O., Mollgard, K. The meninges as barriers and facilitators for the movement of fluid, cells and pathogens related to the rodent and human CNS. Acta Neuropathologica. 135 (3), 363-385 (2018).
- Choe, Y., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. A cascade of morphogenic signaling initiated by the meninges controls corpus callosum formation. Neuron. 73 (4), 698-712 (2012).
- Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139 (3), 597-609 (2009).
- Bifari, F., et al. Neurogenic Radial Glia-like Cells in Meninges Migrate and Differentiate into Functionally Integrated Neurons in the Neonatal Cortex. Cell Stem Cell. 20 (3), 360-373 (2017).
- De Bock, M., et al. A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins? FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).
- Ramos, M., et al. Cisterna Magna Injection in Rats to Study Glymphatic Function. Methods in Molecular Biology. 1938, 97-104 (2019).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Coureuil, M., Lecuyer, H., Bourdoulous, S., Nassif, X. A journey into the brain: insight into how bacterial pathogens cross blood-brain barriers. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 149-159 (2017).
- Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
- Slezak, M., et al. Transgenic mice for conditional gene manipulation in astroglial cells. Glia. 55 (15), 1565-1576 (2007).
- Hardy, S. J., Christodoulides, M., Weller, R. O., Heckels, J. E. Interactions of Neisseria meningitidis with cells of the human meninges. Molecular Microbiology. 36 (4), 817-829 (2000).
- Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77 (9), 3578-3587 (2009).
- Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726(2014).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
