Обнаружение белка S-Acylation с использованием acyl-Resin Assisted Capture

S-ациляция является обратимой пост-трансляционной модификации с участием добавления жировой цепи ацила к внутренним остаткам цистеина на целевой белок через лабильный тиоэфир облигации¹. Впервые сообщалось, как модификация белков с palmitate, насыщенных 16-углеродной жирной кислоты², и поэтому эта модификация часто называют S-palmitoylation. В дополнение к пальмитату, белки могут быть обратимы различными более длинными и короткими насыщенными (миристейстом и стеатом), мононенасыщенными (олеатом) и полиненасыщенными (арачидонаинат и эйкозапентановат) жирными кислотами^3,,4,5,,6,,7. В эукариотических клетках, S-ацилирование является катализатором семьи ферментов, известных как DHHC белка ацилтрансферазы и обратная реакция цистеина деакилиации является катализируется белка thioesterases, большинство из которых до сих пор остаются загадочными⁸.

Lability связи тиоэстера делает эту липидную модификацию обратимой, позволяя ей динамически регулировать кластеризацию белков, локализацию плазменной мембраны, внутриклеточный оборот, белково-белковые взаимодействия и стабильность белка^9,10. Следовательно, S-акилирование было связано с несколькими расстройствами, включая болезнь Гентингтона, болезнь Альцгеймера и несколько видов рака (простата, желудок, мочевой пузырь, легкие, колоректальные), что требует разработки надежных методов для обнаружения этого пост-переводного белка модификации¹¹.

Метаболическая маркировка с радиоактивным (No³H,¹⁴C) или¹²⁵Я) palmitate был одним из первых подходов, разработанных для проверки белка S-ацилинг^12,13,14. Тем не менее, радиомаркировка на основе методов настоящее здоровье проблем, не очень чувствительны, отнимает много времени, и только обнаружить липидацию очень обильные белки¹⁵. Быстрее и нерадиоактивной альтернативой радиомаркировке является метаболическая маркировка биоортогональными жирными кислотными зондами, которые регулярно используются для проверки динамики белка S-acylation^16. В этом методе, жирные кислоты с химическим репортером (алкин или азид группы) включена в S-ацилатированный белок белка ацилтрансферазы. Азидея-алкин huisgen циклоaddition реакции (нажмите химии) может быть использован для присоединения функционализованной группы, такие как фторофор или биотин, к интегрированной жирной кислоты, что позволяет для обнаружения S-ацилатированный белок^17,18,19.

Ацил-биотин обмен (ABE) является одним из широко используемых биохимических методов для захвата и идентификации S-ацилатных белков, что обходит некоторые недостатки метаболической маркировки, такие как непригодность для образцов тканей¹⁵. Этот метод может быть применен для анализа S-ациляции в различных биологических образцов, в том числе тканей и замороженных образцов клеток^20,21. Этот метод основан на селективном расщеплении тиоэстерной связи между ациловой группой и остатками цистеина нейтральным гидроксиламином. Освобожденные группы тиола затем захватываются с тиол-реактивной производной биотина. Генерируемые биоинтинилапотированные белки затем сродство очищается с помощью стрептавидина агарозы и анализируются с помощью иммуноблоттинга.

Альтернативный подход называется acyl-resin помощь захвата (Acyl-RAC) был позже введен, чтобы заменить биотинилационный шаг с прямым спряжением свободных цистеинов тиол-реактивного ресина^22,23. Этот метод имеет меньше шагов по сравнению с ABE и аналогичным образом может быть использован для обнаружения белка S-ациляции в широком диапазоне образцов¹.

Acyl-RAC состоит из 4 основных ступеней(рисунок 1),
1. Блокирование свободных групп тиола;
2. Селективное расщепление цистеино-ациловый тиоэстер связи с нейтральным гидроксиламином (HAM) для разоблачения цистеина тиол групп;
3. Захват липидных цистеинов с тиол-реактивным ресином;
4. Избирательное обогащение S-ацилатированных белков после elution с уменьшением буфера.

Захваченные белки могут быть проанализированы с помощью иммуноблоттинга или подвергнуты массовой спектрометрии (MS) на основе протеомики для оценки S-ацилата протеома в различных видов и тканей^22,24,25. Индивидуальные s-ацилирования сайты также могут быть определены путем трипсина переваривания захваченных белков и анализа в результате пептиды LC-MS/MS²². Здесь мы демонстрируем, как ацил-РАК может быть использован для одновременного обнаружения S-ацилирования нескольких белков как в клеточной линии, так и в образце ткани.

Мыши, используемые в этом протоколе, были усыплены в соответствии с руководящими принципами NIH. Комитет по защите животных в Научном центре здравоохранения Техасского университета в Хьюстоне одобрил все работы с животными.

1. Подготовка клеточных лисатов

1. Подготовка буфера лиза, описанного в таблице 1. До 10 мл PBS, добавить 0,1 г n-dodecyl й-D-maltoside моющего средства (DDM) и повернуть, чтобы растворить. Добавьте 100 л ингибитора фосфатазы коктейль 2, ML211 (10 мкм), PMSF (10 мМ) и коктейль-ингибитор протеазы (1x) и охладите буфер на льду перед использованием.
2. Передача необходимых носителей, содержащих клетки из инкубатора в 15 мл или 50 мл конических труб и спиновых клеток на 350 х г в течение 5 минут и аспират, чтобы избавиться от любого мусора клетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали 1 х 10⁷ клеток для каждой реакции acyl-RAC, которая будет выполнена.
3. Вымойте гранулы, отостановив его в 5 мл PBS и спиннинг на 350 х г в течение 5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаг 1.3 быстро, чтобы избежать лиза клетки из-за расширенной инкубации в PBS.
4. Добавьте 600 кЛ буфера лисиса, подготовленного в шаге 1.1 к грануле, и лисите его, встряхнув при 1500 об/мин в термальной шейкере в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия.
5. Очистить лисаты центрифугированием при 20 000 х г при 4 градусах по Цельсию в течение 30 мин до гранулы нерастворимых материалов. Соберите очищенный лизат в предварительно охлажденных 1,5 мл микрофуга труб и держать их на льду.
6. Выполните анализ Брэдфорда/BCA для оценки концентрации белка. Очень важно обеспечить одинаковое количество белка в различных образцах до проведения эксперимента. Мы рекомендуем использовать не менее 500 мкг белка в реакции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В описанных экспериментах мы использовали культивированные (джуркатские) клетки и первичные спленоциты из тканей мышей. Метод лиза, описанный выше, может быть принят и на другие типы клеток. Средняя концентрация белка, полученная для вышеупомянутых типов клеток, составляет примерно 500 мкг на 1 х 10⁷ клеток. Клетки Jurkat были сохранены в RPMI-1640 средних модифицированных содержать 2 мМ L-глютамин, 10 мМ HEPES, 1 мМ натрия пируват, 4500 мг/л глюкозы, и 1500 мг/л бикарбоната натрия дополнены 10% FBS при 37 С с 5% CO₂. Мы использовали 1 х 10⁷ Юркат клеток в реакции. Первичные спленоциты были выделены из ткани селезенки мыши, как описано²⁶. Кратко, селезенки ткани были macerated на льду, последовано за lysis эритроцитов в hypotonic растворе и разъединение от лимфоцитов центрифугированием. Мы использовали 1 х 10⁷ первичных клеток в реакции.

2. Acyl-RAC: Блокирование бесплатных групп тиола

ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие шаги могут быть выполнены при комнатной температуре (RT).

1. Передача лизата в свежий 1,5 мл микрофуговой трубки и выполнить хлороформ-метанол (СМ) осадков, как описано ниже.
   1. Добавьте метанол (MeOH) и хлороформ (CHCl₃) в лизат в окончательном соотношении лизата: MeOH: CHCl₃ 2:2:1 и энергично встряхните, чтобы создать однородную подвеску.
   2. Спин при 10 000 х г в течение 5 мин, чтобы сформировать гранулы ("блин") на межфазах между водной и органической фазами.
   3. Наклон трубки и аспирировать столько растворителя, как это возможно с помощью иглы или гель загрузки отзыв.
   4. Воздух высушить протеиновые гранулы в течение нескольких минут и осторожно промыть его, добавив 600 л МЕОи и аккуратно перемешивая, чтобы избежать разрушения гранул
   5. Аккуратно удалите оставшиеся MeOH и высушите белковые гранулы на скамейке примерно в течение 5 минут.
   6. (Необязательно) Выполните дополнительный шаг центрифугации, чтобы спина вниз любой сломанной гранулы после мытья MeOH, чтобы избежать потери образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент может быть остановлен после шага осадков СМ. Как только гранулы получены, он может храниться в 500 Л МЕОв в -20 градусов по Цельсию до недели.
      1. Растворите белковые гранулы в 200 qL буфера 2SHB путем вихря при 42 Градусах/1500 об/мин в термальной шейкере до растворения гранул.
   7. (Необязательно) Инкубировать в течение еще 5-10 минут в звуковой водяной бане, чтобы растворить гранулы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длина звуковой варьируется в зависимости от растворимости материала. Однако длительное соникирование может привести к деградации белка.
2. Приготовьте 0,2% метилметанесульфонат (MMTS) (v/v) в 2SHB, добавив 2 ЗлмЭ ММТС до 998 Л буфера 2SHB.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте свежеприготовленные 0,2% MMTS для каждого эксперимента.
3. Добавьте 200 л 0,2% MMTS в 2SHB к каждой трубке до конечной концентрации 0,1% MMTS. Инкубировать в течение 15 мин при 42 градусах Цельсия при встряхивании при 1500 об/мин в термальной шейкере.

3. Acyl-RAC: Гидроксиламин (HAM) расщепление и захват S-ацилатированных белков

1. Повторите 3-4x CM осадков, как описано выше, чтобы удалить MMTS. Удаление MMTS можно оценить по отсутствию четкого запаха MMTS. После каждого осадка растворите гранулы в 100 л буфера 2SHB путем вихря при температуре 42 градусов по Цельсию/1500 об/мин в термальной шейкере до растворения гранулы, а затем разбавьте 300 л буфера А.
2. После окончательного выпадения осадков, растворить образцы в 200 qL 2SHB буфера, как описано выше, и разбавить с 240 зл буфера А.
3. В случае сравнения изменений в S-ациляции в ответ на несколько условий лечения, измерять концентрацию белка снова и приступить с равным количеством белка для каждого условия.
4. Сохранить 40 qL от каждого образца в качестве входному элемента управления.
5. Разделите образцы на две равные части по 200 qL и отметьте трубки как «я ХАМ» и «- HAM». Добавьте 50 qL свежеприготовленных нейтральных 2 M HAM (pH 7.0-7.5) к конечной концентрации 400 мМ к одной из труб (я. HAM) и 50 зл нейтрального 2 M NaCl ко второй трубке (- HAM), которая будет использоваться в качестве отрицательного контроля. Приступайте к добавлению бисера тиопропил-сефароз (TS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент может быть остановлен после любого из шагов выпадения CM. Как только гранулы получены, он может храниться в 500 Л МЕОв в -20 градусов по Цельсию до недели. Нейтральный рН 2 М HAM обеспечивает его избирательность для ацил-цистеина тиоэстера связи и должны быть тщательно скорректированы. Следует внимательно позаботиться при обработке образцов в буфере 2SHB, чтобы избежать потери образца из-за чрезмерного пенообразующего. Все следующие шаги идентичны для - образцы HAM и HAM.
6. Добавьте 30 зЛ бисообразной суспензии tS к каждой трубке и поверните трубки на 1-2 ч на РТ.
7. Вымойте TS бисер 4x с 1% SDS в буфере А, чтобы удалить остаточный HAM.
   1. Аккуратно раскрутите все образцы бисера с помощью микрофуга в течение 1 мин и тщательно аспирируйте супернатант.
   2. Приостановить действие бисера в 500 л 1% SDS в буфере А.
   3. Повторите шаг 3.7.1-3.7.2 трижды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Активированный тиопропил-сефароз (TS) поставляется лиофилизированным в присутствии добавок, которые необходимо смыть при нейтральном рН перед свалкой. Дистиллированная вода рекомендуется для отеков и мытья. Взвесьте 0,1 г бисера и resuspend в 1 мл дистиллированной воды и дайте ему набухать при повороте в течение 30 мин-1 ч на RT. Мыть ебес 1x с буфером А и подготовить суспензию с буфером А, в соотношении 50% поселились среднего до 50% буфера. Опухшие ТС могут храниться при нейтральном рН при наличии 20% этанола при 4 градусах Цельсия до недели. Не используйте азид натрия в качестве бактериостатического агента, так как ионы азида реагируют с 2-пиридил дисульфидных групп. Для повышения эффективности приготовьте свежие бусы. При обработке бисера, кончик p200 пипетка отзыв может быть сокращен немного, с тем чтобы предотвратить любые повреждения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент может быть остановлен на любом этапе после выпадения см. Гранулы могут храниться в 500 мэох в -20 градусов по Цельсию до недели.

4. Улавливание и обнаружение S-ацилатированных белков

1. После последней стирки, осторожно спина вниз бисер, как описано выше, и аспирить столько супернатант насколько это возможно, не нарушая бисер.
2. Восстановление белков из бисера с 4x SDS образец буфера с DTT.
   1. Добавьте 50 qL 4x sDS образец буфера к бисеру и инкубировать при 80 градусах Цельсия, 1500 об/мин в течение 15 минут в термальной шейкере. Дайте трубкам остыть.
   2. Centrifuge бисер на 5000 х г в течение 3 мин, чтобы полностью гранулы бусы и передачи элетированных белков в свежие 1,5 мл трубки с помощью гель загрузки отзыв.
3. Выполнить SDS-PAGE и проанализировать S-ацилирование белка (ы) интерес западной blotting.

Следуя описанному выше протоколу, мы впервые использовали ацил-РАК для одновременного обнаружения S-ацилирования нескольких белков в клетках Jurkat, увековеченной линии Т-клеток, первоначально полученной из периферической крови пациента с лейкемией Т-клеток27. Регуляторные Белки Т-клеток, ранее идентифицированные как S-acylated99,28,,29, были выбраны, чтобы продемонстрировать полезность этого метода. Как показано на рисунке 2A, тирозина киназы Lck может быть обнаружена в лизатах, обработанных нейтральным 2 M гидроксиламин, чтобы расщеплять тиостер связь между остатками цистеина и жирных кислот moiety (я HAM переулок). Образец, обработанный 2 M NaCl (- HAM lane), представляет собой важный отрицательный контроль, указывающий на избирательность анализа для обнаружения тиостерных облигаций. Входной полосы далее подтверждает специфику сигнала и может служить в качестве положительного контроля, если белок интереса не S-acylated. Затем мембрану раздели и повторно исследовали антителами против белков Fyn и LAT, чтобы продемонстрировать, что анализ acyl-RAC может быть использован для анализа S-ациляции нескольких белков одновременно(рисунок 2A).

Чтобы продемонстрировать полезность этого метода для обнаружения белка S-ацилирования в образцах тканей, мы применили протокол acyl-RAC к селезенке мыши. Как показано на рисунке 2B, S-ациляция Lck, Fyn и LAT могут быть легко обнаружены в первичных спленоцитов мыши, указывающих, что эта модификация сохраняется между двумя видами.

Рисунок 1. Схематическое представление ацил-РАК. Метод состоит из 4 основных этапов: (1) блокирование свободных групп тиола с метилметаметайосульфонат (MMTS), (2) селективное расщепление цистеин-ацил тиоэстер атиоэстер связи с нейтральным гидроксиламин (HAM) подвергать cysteine thiol групп, (3) захват белков с недавно подвергаются цистеин тиол путем прямого спряжения с тиол-реактивной ресина и (4) восстановление захваченных белков с помощью снижения elution буфера, а затем иммуноблоттинг или анализ MS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2. Обнаружение S-ацилатированных белков. Ацил-RAC анализ был использован для обнаружения S-ациляции Т-клеток сигнализации белков в клетках Jurkat Т (A) и ткани селезенки морин(B). Иммуноблоттинг с Lck-, Fyn- и LAT-специфические антитела показывает S-акилирование этих протеинов в гидроксиламин обработанном образце (я HAM майн). Образец, обработанный хлоридом натрия (- HAM lane), служит отрицательным контролем. Необработанные лисаты отображаются в вхотливой полосе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Таблица 1: Буферная композиция часто используемых буферов, необходимых в протоколе. 2SHB буфер и буфер А могут быть подготовлены заранее, но их рН должны регулярно проверяться. Лисис буфер и HAM должны быть подготовлены в день эксперимента.

Конфликта интересов не было заявлено.