Этот протокол описывает эффективный подход к гибридизации на месте для определения уровней экспрессии мРНК и пространственных моделей генов-мишеней в коеломной жидкости Sipunculus nudus.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
На месте Гибридизация для Sipunculus nudus Coelomic жидкости
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
На месте гибридизация (ISH) является очень информативным методом представления клеточных моделей распределения конкретных генов (например, мРНК и ncRNA) в тканях. Сипункулидный червь Sipunculus nudus является важнейшим рыбным ресурсом, поскольку он имеет высокие питательные и лекарственные значения. В настоящее время исследования молекулярной биологии Sipunculus nudus все еще находятся в зачаточном состоянии. Целью данной статьи является разработка чувствительного метода локализации специфической мРНК в сипункулусе нудуса-келомической жидкости. Протокол включает в себя подробные шаги ISH, в том числе digoxigenin помечены антисмысл и смысл riboprobe подготовки, coelomic сбора жидкости и подготовки секции, конкретные гибридизации рибозонда, инкубации антител, окраски и пост-окраски лечения. Доказаны репрезентативные результаты успешного эксперимента с использованием этого метода. Протокол должен быть применим и к другим видам Сипункулы.
Введение
ISH, используя помеченные нуклеиновой кислоты зонд для обнаружения конкретной ДНК или РНК последовательность интересов, является полезным методом для описания пространственной экспрессии картины генов-мишеней в морфологически сохраненныхтканей 1,2,3. Как правило, целевая последовательность генерируется полимеразной цепной реакцией (ПЦР), а затем используется в качестве шаблона для синтеза антисмыслового/чувстве РНК-зонда, помеченного дигоксигенином моридином-5'-трифосфатом. Образцы фиксируются и пронизаны перед инкубации с помощью рибозаза. После смыва избыточного зонда, гибр....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Процедура животных была одобрена Комитетом по уходу за животными и благополучию Университета Хуацяо.
1. Препарат Рибозонда
- Дизайн праймера
- Откройте программу Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Копируйте последовательность dmrt1 (GenBank: MK182259) в окне последовательности.
- Установите длину грунтовки (23-25 bp), температуру плавления (55-60 градусов по Цельсию) и содержание G/C (40-60%). Нажмите Выберите праймеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальный размер, необходимый для ЗОНДа РНК составляет около 500 bp. Более длинные зонды обычно имеют более высокую специфичность.
....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Краткое изложение шагов, связанных с ISH, иллюстрируется на рисунке 1. Антисмысловые и соответствующие рибозонды для dmrt1 были синтезированы из продуктов ПЦР, усиленных из кДНС, кокломических жидкостей. Подлинность продуктов ПЦР была проверена путем прямого секвенирования. Рибозонды были синтезированы с использованием T7 РНК-полимеразы в соответствии с протоколами производителя и предыдущий доклад4 с некоторыми незначительными изменениями. Репрезентативные с.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Предыдущие исследования показали, что ISH подходит для обнаружения нескольких целевых РНК16,,17,,18. В этом протоколе мы описали метод ISH высокого разрешения для обнаружения мРНК в коеломической жидкости и акцента на оптимизированные условия гибридизации в Sipunculus nudus. Очевидные сигналы dmrt1 мы наблюдали продемонстрировали успешное применение этого протокола при обнаружении экспрессии генов
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана Фондом молодых ученых Национального фонда естественных наук Китая (Грант No 31801034), Фондом естественных наук провинции Фуцзянь, Китай (2016J01161), Научно-исследовательскими фондами Университета Хуацяо (15BS306) и Инновационным фондом аспирантов в области научных исследований Университета Хуацяо.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Анти-дигоксигенин-AP Fab фрагменты | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT щелочная фосфатаза краситель | набор для разработки Beyotime | C3206 | |
| Бычья сыворотка Альбумин | Sigma | B2064 | |
| Центрифуга | Eppendorf | 5415R | |
| Лимонная кислота | Синофарм Химический Реагент Ко. | 5949-29-1 | |
| Лимонная кислота тринатрия | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Деионизированный формамид | Amresco | 07.12.1975 | |
| Диэтил пирокарбонат, DEPC | Sigma | D5758 | Вредное вещество |
| Дигоксигенин (DIG) Смесь для мечения РНК | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, РНКаза без РНКазы | Invitrogen | 18047019 | |
| ЭДТА | Сигма | 431788 | |
| Электрофорез Визуализация геля | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Этанол | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Наборы для экстракции геля | Omega | D2500 | |
| Аппарат для гель-электрофореза | Пекин Люи Приборный завод | DYY-6C | |
| Глицерин | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Глицин | Сигма | G5417 | |
| Гепарин | Сигма | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| малеиновая кислота | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Метанол | Синофарм Химический Реагент Ко. | 67-56-1 | Вредное вещество |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Коррозионная |
| парафиновая пленка | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Параформальдегид, PFA | Sigma | 158127 | вредное вещество |
| ПЦР | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Пипетка | Eppendorf | plus G | |
| Поли-D-лизин обработанные микроскопические стекла | Liusheng | VER_A01 | |
| протеиназа K | Sigma | ||
| Вода без РНКазы | HyClone | SH30538. 02 | |
| Ингибитор РНКазы | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Сыворотка для овец | Beyotime | C0265 | |
| Баночка для окрашивания | слайдов Beyotime | FG010 | |
| Ящик для хранения слайдов | Beyotime | FBX011 | |
| Малые автоклавные ножницы | Shuanglu | sku_8330 | |
| Спектрофотометры | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 РНК-полимеразы | Roche | 10881767001 | |
| Taq ДНК-полимеразы (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| тРНК | Roche | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Водяная баня | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
Ссылки
- Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
