На месте Гибридизация для Sipunculus nudus Coelomic жидкости

ISH, используя помеченные нуклеиновой кислоты зонд для обнаружения конкретной ДНК или РНК последовательность интересов, является полезным методом для описания пространственной экспрессии картины генов-мишеней в морфологически сохраненных^{тканей 1,2,3}. Как правило, целевая последовательность генерируется полимеразной цепной реакцией (ПЦР), а затем используется в качестве шаблона для синтеза антисмыслового/чувстве РНК-зонда, помеченного дигоксигенином моридином-5'-трифосфатом. Образцы фиксируются и пронизаны перед инкубации с помощью рибозаза. После смыва избыточного зонда, гибридизация визуализируется иммуногистохимией с помощью антидигоксигенина антитела, которое щелочной фосфатазы-конъюгированных^3,4,5,6.

Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; заказ Sipunculida: Sipunculidae) является unsegmented, coelomate и двусторонним симметричным морским червем^7,8. Sipunculus nudus является космополитическим видом, широко распространенным в тропических и умеренных прибрежных водах. Он также является важным морским промысловым ресурсом на юге Китая из-за его высокой питательной и целебной ценности^9,,10. Тем не менее, Sipunculus nudus в молекулярной биологии все еще находится в зачаточном состоянии. Чтобы в полной мере понять биологическую роль генов, большой интерес представляет исследование моделей экспрессии генов в клеточном разрешении. В немодельном организме Sipunculus nudusметод ISH, который является идеальным методом обнаружения моделей экспрессии генов, до сих пор не установлен. Его кельомная жидкость содержит несколько типов клеток, в том числе гранулоциты, клетки урны, пузырькулярные клетки, зародышевые клетки, эритроциты и т.д.^11. Двойной секс / mab-3 связанных транскрипции фактор-1(dmrt1), используется в качестве репрезентативного гена в этом методе, является весьма сохранены транскрипции регулятора определения пола и дифференциации в большинстве видов, начиная от беспозвоночных для млекопитающих^12,13. В целом ряде видов (нат., черный порги и т.д.) ¹⁴, dmrt1 был выражен в клетках Sertoli, окружающих зародышевые клетки, функция которых похожа на трофобластные клетки Sipunculus nudus. Поэтому мы предположили, что dmrt1 из Sipunculus nudus выражается в трофобластных клетках сперматозiii,-и результат метода ISH четко подтвердил гипотезу.

Этот протокол впервые описывает ISH, с digoxigenin помечены антисмысл / смысл мРНК зондов, чтобы определить мРНК экспрессии моделей в его coelomic мазка жидкости. Обеспечиваются оптимальные условия реакции, которые позволяют очень чувствительновую визуализацию экспрессии мРНК в высоком разрешении. Разработанный метод ISH потенциально может быть применен в более sipunculida видов, кроме Sipunculus nudus.

Процедура животных была одобрена Комитетом по уходу за животными и благополучию Университета Хуацяо.

1. Препарат Рибозонда

1. Дизайн праймера
   1. Откройте программу Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Копируйте последовательность dmrt1 (GenBank: MK182259) в окне последовательности.
   2. Установите длину грунтовки (23-25 bp), температуру плавления (55-60 градусов по Цельсию) и содержание G/C (40-60%). Нажмите Выберите праймеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальный размер, необходимый для ЗОНДа РНК составляет около 500 bp. Более длинные зонды обычно имеют более высокую специфичность.
   3. Добавьте последовательность промотора t7 РНК-полимераза (5^, -TAATACGACTActActATAGGG-3^),к одному из выбранных праймеров. Последовательности праймеров dmrt1 для ISH отображаются в таблице 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для зондов чувств, промоутер Полимераза T7 РНК расположен в 5'end форвардных грунтовок. Для антисмысловых зондов, t7 РНК-полимераза промоутер расположен на 5'-конец обратного грунтовки.
2. Усиление ПЦР
   1. Поместите микрофуге трубки на лед, и подготовить следующую смесь реакции (для 50 мл реакции): 1x Taq ДНК полимеразы смесь, 1 мкг кДНК (которая готовится из 100 кЛ coelomic жидкости), 1 ММ вперед грунтовки, 1 ММ реверсивной грунтовки и нуклеаза воды.
   2. Смешайте реакцию ПЦР путем краткого типопетирования и центрифуги.
   3. Поместите реакционную трубку в тепловой цикл, и запустить ПЦР, используя следующие условия: начальная денатурация при 95 градусов по Цельсию в течение 2 мин, а затем 36 циклов денатурации при 95 градусах по Цельсию в течение 30 с, аннулирование при 55-60 c для 30 с, расширение на 72 градусов по Цельсию на 30 с и окончательное расширение на 72 градусов по Цельсию в течение 7 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Температура аннулирования должна быть оптимизирована в соответствии с грунтовки.
3. Очистка и проверка пЦР
   1. Загрузите смесь ПЦР на 50 л пЦР непосредственно на 1% агарозный гель. Выполнить гель агарозы на 150-180 V в течение 10 минут в 0,5x TBE. Изолировать конкретные фрагменты ДНК из 1% агарозного геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК должна отображаться как одна полоса, а не как мазок.
   2. Очистите фрагменты ДНК с помощью комплекта для извлечения геля в соответствии с протоколом производителя. Количественно очищенные продукты с помощью спектрофотометрии на длине волны 260 нм.
   3. Проверьте подлинность продуктов ПЦР путем секвенирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (Точка паузы) Очищенные продукты ПЦР могут храниться при -20 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев.
4. Синтез рибозонда
   1. Поместите RNase-бесплатные микрофугевые трубки на льду, и добавьте следующее к микрофуговой трубке (для реакции 10 л): 1x Digoxygenin RNA Labeling Mix, 1x транскрипционный буфер, 0,5 злингинговых ингибиторов RNase, 1 Зл полимеразы РНК T7, 1 мкг продукта ПЦР и безробиливая rNase. Смешайте реакцию путем пипетки и центрифуги кратко. Инкубировать в течение 2 ч при 37 градусах Цельсия.
   2. Добавьте 2 Зла без RNase DNase I. Смешайте реакцию трубацией и центрифугой кратко. Инкубировать в течение 15 мин при 37 градусах Цельсия.
   3. Добавьте 2 л 0,2 М ЭДТА (pH 8.0). Смешайте реакцию путем пипетки и центрифуги кратко.
   4. Добавьте к вышеуказанной реакции 2,5 л из 4 М ЛиКлал и 75 л прешилового этанола. Хорошо перемешать. Оставьте на 30 мин при -70 градусов по Цельсию.
   5. Центрифуга при 12 000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Декант этанол. Добавьте 1 мл прешилационного 70% этанола (v/v) и вымойте осадки, аккуратно перемешивая.
   6. Центрифуга при 12 000 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Decant 70% этанол и высушите осадки кратко около светильника спирта. Растворите осадки, добавив 30 кЛ безрычания воды и аккуратно перемешайте.
   7. Загрузите 2 Зл синтезированной РНК на 1% агарозный гель. Выполнить гель агарозы на 180 V в течение 5-10 мин в 0,5x TBE. Измерьте концентрацию маркированной РНК с помощью спектрофотометра на длине волны 260 нм.
      1. Используйте RNase-бесплатные микрофуги трубки и фильтр советы, чтобы избежать загрязнения RNase.
         ПРИМЕЧАНИЕ: (Пауза точки) Digoxygenin помечены зонды могут храниться при -70 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев.

2. Коллекция coelomic жидкости

1. Зафиксните S. nudus на таблице вскрытия с булавками. Откройте корпус S. nudus с небольшими автоклавными ножницами. Изолировать коеломную жидкость пипеткой.
2. Соберите и перенесите 1 мл коеломической жидкости с пипеткой на поли-D-лизина обработанных слайдов микроскопа. Нанесите coelomic жидкости равномерно с кончиком пипетки. Воздушно-сухие горки для 1 ч при 37 градусах Цельсия.

3. На месте гибридизации

1. День 1
   1. Регидратировать слайды в слайд окрашивания банку, содержащую 100 мл 1x диэтил пиробунабоната обработаны фосфат буферного солей (DEPC-PBS). Регидратировать 3 раза с 1x DEPC-PBS, 5 мин на промывку с нежным возбуждением.
   2. Пермяки мазок коеломической жидкости путем пищеварения с 10 мкг/мл протеиназы K при комнатной температуре в течение 5 мин. Инкубировать слайды в 4% параформальдегида (PFA) в течение 20 мин, чтобы остановить пищеварение. Вымойте слайды в 1x DEPC-PBS с нежным возбуждением в течение 5 мин 3 раза.
   3. Добавьте 50 зл гибридизации смеси (HM), содержащий смысл / антисмысл рибозонд на слайдах и добавить крышку скольжения.
   4. Добавьте буфер мокрой коробки во влажную коробку. Положите слайды в мокрой коробке и печать хорошо с парафина пленки. Гибридизировать ночь (не менее 16 ч) при 60 градусах Цельсия.
2. День 2
   1. Разогреть буфер для мытья при температуре 65 градусов по Цельсию. Погрузите слайд в слайдок окрашивания банку, содержащую мыть буфер и дайте ему стоять, пока coverslip соскальзывает автоматически. Это занимает около 5 минут.
   2. Вымойте 2 раза с мытьем буфера при 65 градусов по Цельсию, 30 минут на мытье с нежным возбуждением. Вымойте 2 раза с 0,2x солевым натриевым цитратом (SSC) при 65 градусах Цельсия, 30 мин на промывку с нежным возбуждением. Вымойте 2 раза с мужской кислотой буфера, содержащего Tween 20 (MABT) при комнатной температуре, 30 минут на мыть ежевый с нежным возбуждением.
   3. Инкубировать слайды при комнатной температуре 3-4 ч в блокирующем буфере. Инкубировать слайды в 1 мл анти-digoxigenin-AP Fab фрагменты раствора разбавленного на 1/5000 с блокирующим буфером на 4 градуса Цельсия в одночасье.
3. День 3
   1. Удалите раствор антитела и кратко вымойте слайды в MABT. Вымойте 4 раза с MABT при комнатной температуре, 25 мин за стирку с нежным возбуждением.
   2. Инкубировать слайды щелочным буфером фосфатазы при комнатной температуре 3 раза, 5 мин на стирку. Удалите щелочный фосфатазный буфер и добавьте 1 мл 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат (BCIP)/нитро синий тетразолий (NBT) окрашивающий раствор. Держите слайды в темноте.
   3. Периодически наблюдайте за цветовой реакцией под оптическим микроскопом. Когда цвет полностью развит (время реакции в диапазоне 1-4 ч), промойте горки 2 раза с MABT при комнатной температуре, 5 мин на промывку с нежным возбуждением.
   4. Вымойте 2 раза стоп-раствором при комнатной температуре, 15 мин на промывку с нежным возбуждением. Инкубировать горки в метаноле, чтобы удалить избыток пятна, при комнатной температуре в течение 30 минут. В зависимости от цвета фона, метанол мыть можно сделать 2 или 3 раза и время деколонации может быть продлен.
   5. Вымойте 2 раза с MABT при комнатной температуре, 5 мин за стирку с нежным возбуждением. Перенесите слайды на свежую фильтровальную бумагу. Добавьте 50 л глицерола. Добавить крышки и наблюдать микроскопически.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состав решения показан в таблице 2.

Краткое изложение шагов, связанных с ISH, иллюстрируется на рисунке 1. Антисмысловые и соответствующие рибозонды для dmrt1 были синтезированы из продуктов ПЦР, усиленных из кДНС, кокломических жидкостей. Подлинность продуктов ПЦР была проверена путем прямого секвенирования. Рибозонды были синтезированы с использованием T7 РНК-полимеразы в соответствии с протоколами производителя и предыдущий доклад4 с некоторыми незначительными изменениями. Репрезентативные сигналы ISH показаны на рисунке 2. ISH Sipunculus nudus coelomic жидкости с антисмыслами рибозонд, что цели dmrt1 показывает фиолетовый окрашивания сосредоточены в трофобластных клеток сперматозюгмата (Рисунок 2A, B, красные стрелки). Чувство рибозонд был использован в качестве отрицательного контроля, и чувство рибозонд для dmrt1 не обнаружить какой-либо сигнал гибридизации (Рисунок 2C).

Рисунок 1. Диаграмма потока ISH. Синие коробки являются шагами для синтеза рибозаза. Светло-зеленые коробки шаги для in situ процедур. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2. Выражение dmrt1 в Sipunculus nudus coelomic жидкости обнаружены ISH. (A, B) Гибридизация с дрмт1 антисмыслами рибозонд. (C) Гибридизация с dmrt1 чувство рибоз. Красные стрелки представляют собой сигналы гибридизации в трофобластных клетках. sz, spermatozeugmata. Шкала бар: 50 мкм. Эта цифра была изменена с Li et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Таблица 1. Последовательности праймерd dmrt1.

Таблица 2. Состав решений, используемых в протоколе ISH.

Авторам нечего раскрывать.