Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

На месте Гибридизация для Sipunculus nudus Coelomic жидкости

5.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61022

⸱

1 мая 2020 г.

 ,  , 
1Key Laboratory of Xiamen Marine and Gene Drugs, School of Biomedical Sciences, Huaqiao University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает эффективный подход к гибридизации на месте для определения уровней экспрессии мРНК и пространственных моделей генов-мишеней в коеломной жидкости Sipunculus nudus.

Аннотация

На месте гибридизация (ISH) является очень информативным методом представления клеточных моделей распределения конкретных генов (например, мРНК и ncRNA) в тканях. Сипункулидный червь Sipunculus nudus является важнейшим рыбным ресурсом, поскольку он имеет высокие питательные и лекарственные значения. В настоящее время исследования молекулярной биологии Sipunculus nudus все еще находятся в зачаточном состоянии. Целью данной статьи является разработка чувствительного метода локализации специфической мРНК в сипункулусе нудуса-келомической жидкости. Протокол включает в себя подробные шаги ISH, в том числе digoxigenin помечены антисмысл и смысл riboprobe подготовки, coelomic сбора жидкости и подготовки секции, конкретные гибридизации рибозонда, инкубации антител, окраски и пост-окраски лечения. Доказаны репрезентативные результаты успешного эксперимента с использованием этого метода. Протокол должен быть применим и к другим видам Сипункулы.

Введение

ISH, используя помеченные нуклеиновой кислоты зонд для обнаружения конкретной ДНК или РНК последовательность интересов, является полезным методом для описания пространственной экспрессии картины генов-мишеней в морфологически сохраненныхтканей 1,2,3. Как правило, целевая последовательность генерируется полимеразной цепной реакцией (ПЦР), а затем используется в качестве шаблона для синтеза антисмыслового/чувстве РНК-зонда, помеченного дигоксигенином моридином-5'-трифосфатом. Образцы фиксируются и пронизаны перед инкубации с помощью рибозаза. После смыва избыточного зонда, гибридизация визуализируется иммуногистохимией с помощью антидигоксигенина антитела, которое щелочной фосфатазы-конъюгированных3,4,5,6.

Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; заказ Sipunculida: Sipunculidae) является unsegmented, coelomate и двусторонним симметричным морским червем7,8. Sipunculus nudus является космополитическим видом, широко распространенным в тропических и умеренных прибрежных водах. Он также является важным морским промысловым ресурсом на юге Китая из-за его высокой питательной и целебной ценности9,,10. Тем не менее, Sipunculus nudus в молекулярной биологии все еще находится в зачаточном состоянии. Чтобы в полной мере понять биологическую роль генов, большой интерес представляет исследование моделей экспрессии генов в клеточном разрешении. В немодельном организме Sipunculus nudusметод ISH, который является идеальным методом обнаружения моделей экспрессии генов, до сих пор не установлен. Его кельомная жидкость содержит несколько типов клеток, в том числе гранулоциты, клетки урны, пузырькулярные клетки, зародышевые клетки, эритроциты и т.д.11. Двойной секс / mab-3 связанных транскрипции фактор-1(dmrt1), используется в качестве репрезентативного гена в этом методе, является весьма сохранены транскрипции регулятора определения пола и дифференциации в большинстве видов, начиная от беспозвоночных для млекопитающих12,13. В целом ряде видов (нат., черный порги и т.д.) 14, dmrt1 был выражен в клетках Sertoli, окружающих зародышевые клетки, функция которых похожа на трофобластные клетки Sipunculus nudus. Поэтому мы предположили, что dmrt1 из Sipunculus nudus выражается в трофобластных клетках сперматозiii,-и результат метода ISH четко подтвердил гипотезу.

Этот протокол впервые описывает ISH, с digoxigenin помечены антисмысл / смысл мРНК зондов, чтобы определить мРНК экспрессии моделей в его coelomic мазка жидкости. Обеспечиваются оптимальные условия реакции, которые позволяют очень чувствительновую визуализацию экспрессии мРНК в высоком разрешении. Разработанный метод ISH потенциально может быть применен в более sipunculida видов, кроме Sipunculus nudus.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Процедура животных была одобрена Комитетом по уходу за животными и благополучию Университета Хуацяо.

1. Препарат Рибозонда

  1. Дизайн праймера
    1. Откройте программу Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Копируйте последовательность dmrt1 (GenBank: MK182259) в окне последовательности.
    2. Установите длину грунтовки (23-25 bp), температуру плавления (55-60 градусов по Цельсию) и содержание G/C (40-60%). Нажмите Выберите праймеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальный размер, необходимый для ЗОНДа РНК составляет около 500 bp. Более длинные зонды обычно имеют более высокую специфичность.
    3. Добавьте последовательность промотора t7 РНК-полимераза (5, -TAATACGACTActActATAGGG-3),к одному из выбранных праймеров. Последовательности праймеров dmrt1 для ISH отображаются в таблице 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для зондов чувств, промоутер Полимераза T7 РНК расположен в 5'end форвардных грунтовок. Для антисмысловых зондов, t7 РНК-полимераза промоутер расположен на 5'-конец обратного грунтовки.
  2. Усиление ПЦР
    1. Поместите микрофуге трубки на лед, и подготовить следующую смесь реакции (для 50 мл реакции): 1x Taq ДНК полимеразы смесь, 1 мкг кДНК (которая готовится из 100 кЛ coelomic жидкости), 1 ММ вперед грунтовки, 1 ММ реверсивной грунтовки и нуклеаза воды.
    2. Смешайте реакцию ПЦР путем краткого типопетирования и центрифуги.
    3. Поместите реакционную трубку в тепловой цикл, и запустить ПЦР, используя следующие условия: начальная денатурация при 95 градусов по Цельсию в течение 2 мин, а затем 36 циклов денатурации при 95 градусах по Цельсию в течение 30 с, аннулирование при 55-60 c для 30 с, расширение на 72 градусов по Цельсию на 30 с и окончательное расширение на 72 градусов по Цельсию в течение 7 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Температура аннулирования должна быть оптимизирована в соответствии с грунтовки.
  3. Очистка и проверка пЦР
    1. Загрузите смесь ПЦР на 50 л пЦР непосредственно на 1% агарозный гель. Выполнить гель агарозы на 150-180 V в течение 10 минут в 0,5x TBE. Изолировать конкретные фрагменты ДНК из 1% агарозного геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК должна отображаться как одна полоса, а не как мазок.
    2. Очистите фрагменты ДНК с помощью комплекта для извлечения геля в соответствии с протоколом производителя. Количественно очищенные продукты с помощью спектрофотометрии на длине волны 260 нм.
    3. Проверьте подлинность продуктов ПЦР путем секвенирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (Точка паузы) Очищенные продукты ПЦР могут храниться при -20 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев.
  4. Синтез рибозонда
    1. Поместите RNase-бесплатные микрофугевые трубки на льду, и добавьте следующее к микрофуговой трубке (для реакции 10 л): 1x Digoxygenin RNA Labeling Mix, 1x транскрипционный буфер, 0,5 злингинговых ингибиторов RNase, 1 Зл полимеразы РНК T7, 1 мкг продукта ПЦР и безробиливая rNase. Смешайте реакцию путем пипетки и центрифуги кратко. Инкубировать в течение 2 ч при 37 градусах Цельсия.
    2. Добавьте 2 Зла без RNase DNase I. Смешайте реакцию трубацией и центрифугой кратко. Инкубировать в течение 15 мин при 37 градусах Цельсия.
    3. Добавьте 2 л 0,2 М ЭДТА (pH 8.0). Смешайте реакцию путем пипетки и центрифуги кратко.
    4. Добавьте к вышеуказанной реакции 2,5 л из 4 М ЛиКлал и 75 л прешилового этанола. Хорошо перемешать. Оставьте на 30 мин при -70 градусов по Цельсию.
    5. Центрифуга при 12 000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Декант этанол. Добавьте 1 мл прешилационного 70% этанола (v/v) и вымойте осадки, аккуратно перемешивая.
    6. Центрифуга при 12 000 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Decant 70% этанол и высушите осадки кратко около светильника спирта. Растворите осадки, добавив 30 кЛ безрычания воды и аккуратно перемешайте.
    7. Загрузите 2 Зл синтезированной РНК на 1% агарозный гель. Выполнить гель агарозы на 180 V в течение 5-10 мин в 0,5x TBE. Измерьте концентрацию маркированной РНК с помощью спектрофотометра на длине волны 260 нм.
      1. Используйте RNase-бесплатные микрофуги трубки и фильтр советы, чтобы избежать загрязнения RNase.
        ПРИМЕЧАНИЕ: (Пауза точки) Digoxygenin помечены зонды могут храниться при -70 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев.

2. Коллекция coelomic жидкости

  1. Зафиксните S. nudus на таблице вскрытия с булавками. Откройте корпус S. nudus с небольшими автоклавными ножницами. Изолировать коеломную жидкость пипеткой.
  2. Соберите и перенесите 1 мл коеломической жидкости с пипеткой на поли-D-лизина обработанных слайдов микроскопа. Нанесите coelomic жидкости равномерно с кончиком пипетки. Воздушно-сухие горки для 1 ч при 37 градусах Цельсия.

3. На месте гибридизации

  1. День 1
    1. Регидратировать слайды в слайд окрашивания банку, содержащую 100 мл 1x диэтил пиробунабоната обработаны фосфат буферного солей (DEPC-PBS). Регидратировать 3 раза с 1x DEPC-PBS, 5 мин на промывку с нежным возбуждением.
    2. Пермяки мазок коеломической жидкости путем пищеварения с 10 мкг/мл протеиназы K при комнатной температуре в течение 5 мин. Инкубировать слайды в 4% параформальдегида (PFA) в течение 20 мин, чтобы остановить пищеварение. Вымойте слайды в 1x DEPC-PBS с нежным возбуждением в течение 5 мин 3 раза.
    3. Добавьте 50 зл гибридизации смеси (HM), содержащий смысл / антисмысл рибозонд на слайдах и добавить крышку скольжения.
    4. Добавьте буфер мокрой коробки во влажную коробку. Положите слайды в мокрой коробке и печать хорошо с парафина пленки. Гибридизировать ночь (не менее 16 ч) при 60 градусах Цельсия.
  2. День 2
    1. Разогреть буфер для мытья при температуре 65 градусов по Цельсию. Погрузите слайд в слайдок окрашивания банку, содержащую мыть буфер и дайте ему стоять, пока coverslip соскальзывает автоматически. Это занимает около 5 минут.
    2. Вымойте 2 раза с мытьем буфера при 65 градусов по Цельсию, 30 минут на мытье с нежным возбуждением. Вымойте 2 раза с 0,2x солевым натриевым цитратом (SSC) при 65 градусах Цельсия, 30 мин на промывку с нежным возбуждением. Вымойте 2 раза с мужской кислотой буфера, содержащего Tween 20 (MABT) при комнатной температуре, 30 минут на мыть ежевый с нежным возбуждением.
    3. Инкубировать слайды при комнатной температуре 3-4 ч в блокирующем буфере. Инкубировать слайды в 1 мл анти-digoxigenin-AP Fab фрагменты раствора разбавленного на 1/5000 с блокирующим буфером на 4 градуса Цельсия в одночасье.
  3. День 3
    1. Удалите раствор антитела и кратко вымойте слайды в MABT. Вымойте 4 раза с MABT при комнатной температуре, 25 мин за стирку с нежным возбуждением.
    2. Инкубировать слайды щелочным буфером фосфатазы при комнатной температуре 3 раза, 5 мин на стирку. Удалите щелочный фосфатазный буфер и добавьте 1 мл 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат (BCIP)/нитро синий тетразолий (NBT) окрашивающий раствор. Держите слайды в темноте.
    3. Периодически наблюдайте за цветовой реакцией под оптическим микроскопом. Когда цвет полностью развит (время реакции в диапазоне 1-4 ч), промойте горки 2 раза с MABT при комнатной температуре, 5 мин на промывку с нежным возбуждением.
    4. Вымойте 2 раза стоп-раствором при комнатной температуре, 15 мин на промывку с нежным возбуждением. Инкубировать горки в метаноле, чтобы удалить избыток пятна, при комнатной температуре в течение 30 минут. В зависимости от цвета фона, метанол мыть можно сделать 2 или 3 раза и время деколонации может быть продлен.
    5. Вымойте 2 раза с MABT при комнатной температуре, 5 мин за стирку с нежным возбуждением. Перенесите слайды на свежую фильтровальную бумагу. Добавьте 50 л глицерола. Добавить крышки и наблюдать микроскопически.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состав решения показан в таблице 2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Краткое изложение шагов, связанных с ISH, иллюстрируется на рисунке 1. Антисмысловые и соответствующие рибозонды для dmrt1 были синтезированы из продуктов ПЦР, усиленных из кДНС, кокломических жидкостей. Подлинность продуктов ПЦР была проверена путем прямого секвенирования. Рибозонды были синтезированы с использованием T7 РНК-полимеразы в соответствии с протоколами производителя и предыдущий доклад4 с некоторыми незначительными изменениями. Репрезентативные с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Предыдущие исследования показали, что ISH подходит для обнаружения нескольких целевых РНК16,,17,,18. В этом протоколе мы описали метод ISH высокого разрешения для обнаружения мРНК в коеломической жидкости и акцента на оптимизированные условия гибридизации в Sipunculus nudus. Очевидные сигналы dmrt1 мы наблюдали продемонстрировали успешное применение этого протокола при обнаружении экспрессии генов

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Фондом молодых ученых Национального фонда естественных наук Китая (Грант No 31801034), Фондом естественных наук провинции Фуцзянь, Китай (2016J01161), Научно-исследовательскими фондами Университета Хуацяо (15BS306) и Инновационным фондом аспирантов в области научных исследований Университета Хуацяо.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AgaroseBiowest111860
Анти-дигоксигенин-AP Fab фрагментыRoche11093274910
BCIP/NBT щелочная фосфатаза красительнабор для разработки BeyotimeC3206
Бычья сыворотка АльбуминSigmaB2064
ЦентрифугаEppendorf5415R
Лимонная кислотаСинофарм Химический Реагент Ко.5949-29-1
Лимонная кислота тринатрияSinopharm Chemical Reagent Co.4/3/6132
CoverslipsBeyotimeFCGF60
Деионизированный формамидAmresco07.12.1975
Диэтил пирокарбонат, DEPCSigmaD5758Вредное вещество
Дигоксигенин (DIG) Смесь для мечения РНКRoche11277073910
DNase I, РНКаза без РНКазыInvitrogen18047019
ЭДТАСигма431788
Электрофорез Визуализация геляBio-RadUniversal Hood III
ЭтанолSinopharm Chemical Reagent Co.64-17-5
Наборы для экстракции геляOmegaD2500
Аппарат для гель-электрофорезаПекин Люи Приборный заводDYY-6C
ГлицеринSinopharm Chemical Reagent Co.56-81-5
ГлицинСигмаG5417
ГепаринСигма8/1/9041
KClSinopharm Chemical Reagent Co.7447-40-7
KH2PO4Sinopharm Chemical Reagent Co.7778-77-0
LiClSigma203637
малеиновая кислотаSinopharm Chemical Reagent Co.110-16-7
МетанолСинофарм Химический Реагент Ко.67-56-1Вредное вещество
MgCl2Sinopharm Chemical Reagent Co.7786-30-3
Na2HPO4Sinopharm Chemical Reagent Co.7558-79-4
NaClBiofountJT0001
NaOHSinopharm Chemical Reagent Co.1310-73-2Коррозионная
парафиновая пленкаBemis Company, Inc.PM-996
Параформальдегид, PFASigma158127вредное вещество
ПЦРLife TechnologyProflex
PinsDeli16
ПипеткаEppendorfplus G
Поли-D-лизин обработанные микроскопические стеклаLiushengVER_A01
протеиназа KSigma
Вода без РНКазыHyCloneSH30538. 02
Ингибитор РНКазыRoche3335399001
S. nudus
Сыворотка для овецBeyotimeC0265
Баночка для окрашиванияслайдов BeyotimeFG010
Ящик для хранения слайдовBeyotimeFBX011
Малые автоклавные ножницыShuanglusku_8330
СпектрофотометрыThermo FisherNanoDrop 2000/2000c
T7 РНК-полимеразыRoche10881767001
Taq ДНК-полимеразы (2X)Thermo ScientificK1081
Tris HClSigmaRES3098T
тРНКRoche
Tween-20SigmaP1379
Водяная баняZhengzhou Great Wall Scientific IndustrialHH-S2
SRE000510109517001

Ссылки

  1. Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
  2. Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).
  3. Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes. Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).
  4. Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
  5. Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos. Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).
  6. Abler, L. L., et al. A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract. Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).
  7. Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences. Biochemical Genetics. 47, 884(2009).
  8. Lemer, S., et al. Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics. Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).
  9. Jiang, S., et al. Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice. Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).
  10. Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract. Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).
  11. Ying, X. P., et al. The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta. Micron. 41, 71-78 (2010).
  12. Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation. Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).
  13. Kopp, A. Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism. Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).
  14. Wu, G. C., et al. Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy. Biology of Reproduction. 86, 41(2012).
  15. Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1. Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).
  16. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  17. Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799(2015).
  18. Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361(1993).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Подготовка рибозондовинкубация с антителамипроявление цветасекционирование тканейанализ экспрессии геновмечение дигоксигениномокрашивание щелочной фосфатазой
На месте Гибридизация для Sipunculus nudus Coelomic жидкости
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.