Стандартизированные методы для измерения индукции теплового удара ответ в Caenorhabditis elegans

Реакция теплового шока (HSR) является универсальной клеточной реакцией на стресс, вызванную неправильное сворачивание цитозольного белка, вызванного повышением температуры и другими протеотоксическими стрессами. Активация HSR в Caenorhabditis elegans приводит к транскрипционной upregulation генов теплового шока, таких как hsp-70 и hsp-16.2. Многие белки теплового шока (HSPs) функционируют как молекулярные сопровождающие, которые восстанавливают белок складной гомеостаз, или протеостаз, непосредственно взаимодействуя с неправильно сложенными или поврежденными белками. Главным регулятором HSR является транскрипционный фактор Heat Shock Factor 1 (HSF-1), активация которого элегантно контролируется с помощью нескольких механизмов¹.

Роль HSF-1 не ограничивается стрессом. HSF-1 необходим для нормального роста и развития, так как удаление hsf-1 приводит к личинок арест². HSF-1 также имеет важное значение во время старения и связанных с возрастом нейродегенеративных заболеваний, характеризующихся накоплением белковых агрегатов и неспособностью поддерживать протеостаз. Нокдаун hsf-1 вызывает накопление белковых агрегатов и укороченную продолжительность жизни, в то время как переэкспрессия hsf-1 уменьшает агрегацию белка и продлевает срок службы^3,,4. Таким образом, регулирование HSF-1 на молекулярном уровне имеет широкие последствия для физиологии организма и болезней.

C. elegans является мощным модельным организмом для исследования HSR, потому что HSR может быть измерена на молекулярном, клеточном и организмном уровнях^4,,5,,6. Подчеркивая силу этой модели, ключевые достижения в разграничении пути HSR, такие как ткани конкретных различий в регулировании HSR, были обнаружены в C. elegans^7,8. Кроме того, C. elegans широко используется для исследования старения и является новой системой моделирования заболеваний, связанных с нарушением протеостаза.

Хотя эксперименты теплового шока с C. elegans могут быть быстрыми и воспроизводимыми, есть несколько вопросов, которые необходимо рассмотреть перед началом. Например, какая температура должна использоваться для индукции HSR и как долго черви должны подвергаться воздействию? Лучше ли использовать сухой инкубатор или водяную ванну? Какой этап развития следует использовать? К сожалению, методологии, используемые для исследования HSR, сильно различаются от лабораторного к лабораторному, вызывая путаницу при выборе наилучших методологий и затрудняя сравнение результатов на местах.

Мы представляем надежные и стандартизированные протоколы для использования RT-qPCR, флуоресцентных репортеров, и thermorecovery для измерения HSR. Хотя эти три подхода дополняют друг друга, каждый из них имеет уникальные преимущества и недостатки. Например, RT-qPCR является наиболее прямым и количественным измерением HSR, и этот анализ может быть легко расширен, чтобы включить много различных генов, индуцируемых тепловым шоком. Тем не менее, РТ-qPCR является самым дорогим, может быть технически трудно, и требует использования специализированного оборудования. В отличие от этого, флуоресцентные репортеры имеют преимущество измерения тканей конкретных различий в индукции HSR. Тем не менее, они трудно количественно точно, может только измерить индукции выше определенного порога, и требуют использования флуоресценции микроскопа. Кроме того, описанные здесь штаммы репортера стягиваются с задержкой в развитии по сравнению со стандартным штаммом N2. Хотя новые штаммы репортера, содержащие однокопийные трансгены доступны, они не были протестированы здесь⁹. Третий анализ, thermorecovery, имеет преимущество обеспечивать физиологически уместный считывание на уровне организма. Тем не менее, этот анализ, возможно, наименее чувствительный и наиболее косвенный. Наконец, мы обсуждаем некоторые общие различия, найденные в этих анализах, и предлагаем набор передовых методов для облегчения исследований в этой области.

1. Обслуживание и синхронизация C. elegans

1. Поддержание червей при 20 градусах по Цельсию на Nematode Рост средних (NGM) пластин посеяны с OP50 Escherichia бактерий палочки путем передачи нескольких взрослых свежих пластин примерно 2x в неделю¹⁰. Следует проявлять осторожность, чтобы предотвратить червей от бежать из пищи, потому что это может повлиять на их физиологии¹¹.
   1. Приготовление пластин NGM.
      1. Смешайте 3 г NaCl, 2,5 г Бакто-пептона, 20 г агара и деионизированный (DI) H₂O до 1 л в колбе.
      2. Автоклав смеси для стерилизации.
      3. Дайте смеси остыть до 50 градусов по Цельсию.
      4. Добавьте 25 мл 1 МК₂PO₄ (рН No 6), 1 мл 1 M CaCl_2,1 мл 1 M MGSO₄, и 1 мл холестерина (5 мг/мл в 100% этанола).
      5. Используя стерильную технику, залейте смесь в 6 см пластин, чтобы дать приблизительно 100 пластин. Заливка пластин легче, если смесь сначала передается на 300 мЛ стерильный стакан.
      6. Разрешить 1 день, чтобы затвердеть при комнатной температуре (RT) перед посевом с бактериями или хранения при температуре 4 градусов по Цельсию.
   2. Посев бактерий OP50 на пластинах NGM.
      1. Выращивайте насыщенную ночь OP50 бактериальной культуры в LB при 30 градусов по Цельсию или 37 градусов по Цельсию.
      2. Поместите приблизительно 300 мл культуры на центр 6-сантиметровой пластины NGM.
      3. Дайте тарелки высохнуть на RT в течение 1-3 дней по мере необходимости для бактериального газона придерживаться пластины. Затем пластины могут быть использованы или сохранены при 4 градусах Цельсия.
2. Выращивайте червей синхронно либо путем изоляции свежесложенных яиц (описанных здесь), либо альтернативно собирая яйца после растворения червей с отбеливателем.
   1. Перенесите примерно 10 гравивидных взрослых червей на свежую тарелку с помощью платинового проволочного кирки. Синхронизация яйце-лежала лучше всего подходит, если взрослые находятся в первый день взрослой жизни.
   2. Примерно через 1 ч, удалить червей из пластины. Это должно привести к 40-60 яиц на тарелку, в зависимости от условий и деформации.

2. Флуоресцентная визуализация репортеров HSR

1. Синхронизируйте червей (раздел 1.2) и поддерживайте при 20 градусах Цельсия до желаемой стадии развития. Для AM446(hsp-70p::gfp) и CL2070(hsp-16.2p::gfp) флуоресцентные штаммы репортера, молодые взрослые черви, которые еще не достигли репродуктивной зрелости генерируются 64 ч после синхронизации яйцекладки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки развития зависит от каждого штамма и температуры, при которой черви подняты. Оба штамма РЕПОРТЕРА HSR демонстрируют небольшую задержку развития по отношению к N2. Важно отметить, что величина индукции HSR снижается примерно в 2-4x после наступления репродуктивной зрелости (см. Обсуждение).
2. Тепло шок червей, обернув пластины с парафиновой пленкой и погрузившись в циркулирующую водяную ванну при температуре 33 градусов по Цельсию на 1 ч. Тонкая полоска парафиновой пленки должна быть обернута 2x вокруг пластины, чтобы запечатать края. Не покрывайте дно пластины или это может помешать передаче тепла. Погрузите пластины вверх дном с помощью стойки пробирки и свинца вес. Не забудьте включить отрицательный образец контроля (без теплового удара), если это необходимо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если парафиновая пленка не является безопасной, то вода войдет в пластину и пластина не должна использоваться для сбора данных.
3. Восстановить червей, удалив пластины из водяной ванны и сушки с бумажным полотенцем. Снимите парафиновую пленку и инкубировать червей при 20 градусах Цельсия на 6-24 ч. Этот период восстановления позволяет достаточно времени для синтеза GFP и складывания перед визуализацией.
4. Подготовьте слайды для изображения. Слайды должны быть подготовлены свежими для каждого использования.
   1. Сделать 3% агарозы раствор в воде и тепло с помощью микроволновой печи, пока агароз не растворяется.
   2. Поместите слайд микроскопа для изображения между двумя другими слайдами микроскопа, которые имеют полосу лабораторной ленты на них, чтобы создать пространство для агарозной площадки.
   3. Используя пипетки на 1000 мл, поместите каплю (150 мл) нагретой 3% агарозы в центре слайда микроскопа.
   4. Немедленно накройте слайд микроскопа пустым микроскопом перпендикулярно первому слайду так, чтобы верхний слайд опирался на лабораторную ленту на соседних слайдах. Это распространяется капли агарозы для создания площадки равномерной ширины.
   5. Аккуратно удалите верхний слайд.
5. Иммобилизируйте червей с помощью пипетки 200 мл, чтобы добавить небольшую каплю (5 мл) 1 мМ левамизола в буфере M9 к центру площадки агарозы. Затем передать 10 червей в падение левамизола с помощью платиновой проволоки забрать. Обложка с крышкой. Запечатывание крышки не является необходимым для вертикального микроскопа. Дополнительно, черви могут быть выровнены, когда они становятся парализованными, распространяя levamisole покинуть, на внешней стороне агарозы площадку, и выравнивание червей с платиновой проволоки забрать. Кроме того, левамизол можно впитать с помощью лабораторной салфетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение как можно скорее, потому что длительная инкубация в левамизоле может изменить флуоресценцию.
6. Изображение червей с помощью флуоресценции микроскопа. Детали захвата изображения варьируются под микроскопом и программным обеспечением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для прямого сравнения интенсивности изображения используйте идентичные настройки микроскопа в одном сеансе изображения. Избегайте перенасыщения изображения.

3. Измерение экспрессии гена HSR с помощью RT-qPCR

1. Синхронизация червей (раздел 1.2) и поддерживать при 20 градусов по Цельсию до желаемой стадии развития. Для червей N2, молодые взрослые черви, которые еще не достигли репродуктивной зрелости генерируются 60 ч после синхронизации яйцекладки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки развития зависит от каждого штамма и температуры, при которой черви подняты. Важно отметить, что величина индукции HSR снижается примерно в 2-4x после наступления репродуктивной зрелости (см. Обсуждение).
2. Тепловой шок червей, как описано в шаге 2.2.
3. Выньте тарелки из водяной ванны, снимите парафиновую пленку и немедленно соберите червей. Червей можно собирать, аккуратно промывая пластины 1 мЛ M9, собирая жидкость в трубке микроцентрифуги, а затем удаляя M9 после центрифугации при 400 х г в течение 1 мин.
4. Lyse червей и очистить РНК с помощью органической добычи.
   1. Добавьте 250 МЛ изоляционного реагента РНК (см. таблицу материалов).
   2. Вихревые трубки вручную на 30 с.
   3. Вихревые трубки в течение 20 мин при 4 градусов по Цельсию с помощью микроцентрифуг трубки вложения (см. Таблица Материалов).
   4. Добавьте 50 мл хлороформа.
   5. Вихрь для 30 с.
   6. Инкубировать образцы на RT в течение 3 мин.
   7. Центрифуга на уровне 14 000 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия.
   8. Перенесите aqueous слой (т.е. верхний слой, 125 мл) в новую трубку микроцентрифуги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте органического слоя и материала в интерфейсе.
   9. Добавьте 50 мл хлороформа.
   10. Вихрь для 30 с.
   11. Инкубировать образцы на RT в течение 3 мин.
   12. Центрифуга на уровне 14 000 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
   13. Перенесите aqueous слой (100 мл) в новую трубку микроцентрифуги.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте органического слоя и материала в интерфейсе.
   14. Осадок РНК с равным объемом (т.е. 100 мл) изопропанола.
   15. Инкубировать при -20 градусов по Цельсию, по крайней мере 30 мин, но предпочтительно на ночь.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент может быть приостановлен здесь и РНК может храниться при -20 градусов по Цельсию.
   16. Пеллете РНК по центробежию при 14 000 х г за 30 мин при 4 градусах Цельсия.
   17. Удалите как можно больше супернатанта, не нарушая гранулы.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы будут небольшими и не могут быть видны. Гранулы не могут плотно прилипать к стороне трубки, поэтому необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать его вытеснения.
   18. Вымойте гранулы с 250 мл 70% ледяного этанола, изготовленного с RNase-free H₂O.
   19. Центрифуга на уровне 14 000 х г за 5 мин при 4 градусах Цельсия.
   20. Удалите как можно больше супернатанта, не нарушая гранулы.
   21. Выполните быстрый спин на RT, чтобы удалить все оставшиеся 70% этанола.
   22. Высушите гранулы, оставляя трубки открытыми на RT до тех пор, как это необходимо; как правило, по крайней мере 20 мин. Трубы могут быть покрыты без ворса ткани или алюминиевой фольги для предотвращения загрязнения.
   23. Повторное увеличение гранул в 20 мл RNase-бесплатно H₂O.
   24. Определите концентрацию РНК с помощью небольшого объемного спектрофотометра (2 мл).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент может быть приостановлен здесь и РНК может быть временно храниться при -20 градусов по Цельсию.
5. Удалить остаточные ДНК путем инкубации с DNase I. Рекомендуется использовать коммерчески доступный комплект (см. Таблицу материалов)и следовать инструкциям производителя.
   1. С помощью этого комплекта, подготовить 20 мл реакции с 500 нг РНК и 1 МЛ DNase I в 37 кк водяной бане в течение 30 мин.
   2. Добавьте 2,5 л инактивации реагента DNase (входит в комплект) в каждый образец и инкубировать на RT в течение 5 минут с редкими стряхивая / вихревого.
   3. Спин вниз на 14000 х г в течение 2 мин.
   4. Не нарушая белые гранулы, перенесите 15 мл супернатанта на свежую микротрубку для синтеза кДНА.
6. Проведите синтез кДНА. Рекомендуется использовать коммерчески доступный комплект (см. Таблицу материалов)и следовать инструкциям производителя.
   1. С комплектом, подготовить 20 МЛ реакции с 15 МЛ DNase I-обработанных РНК от предыдущего шага и 1 МЛ обратной транскриптазы.
   2. Используйте следующую программу для синтеза кДНА: 25 градусов по Цельсию в течение 5 мин, 46 градусов по Цельсию в течение 20 мин, 95 градусов по Цельсию в течение 1 мин, удержание 4 градусов по Цельсию.
   3. Разбавить cDNA, добавив 80 МЛ RNase-бесплатно H₂O непосредственно к образцу.
   4. Кратко вихрь, затем спина вниз и хранить при -20 градусов по Цельсию до тех пор, пока это необходимо.
7. Выполните qPCR. Рекомендуется использовать коммерчески доступный комплект (см. Таблицу материалов)и следовать инструкциям производителя.
   1. С комплектом, подготовить 25 МЛ реакции, содержащей 2 МЛ кДНК и 200 nM (каждый) вперед и обратного грунтовки в одном колодце 96-хорошо пластины.
   2. В таблице материалов перечислены праймерные последовательности для измерения генов тепловогошока, hsp-70 и hsp-16.2и 18S rRNA (для контроля нормализации). Несколько элементов управления нормализации могут быть использованы по желанию.
   3. Разбавить образцы кДНА 50x перед измерением 18S, чтобы убедиться, что анализ находится в линейном диапазоне. Соответствующие условия qPCR варьируются в зависимости от используемого комплекта и грунтовки (см. Результаты представительства).
   4. Используйте систему обнаружения ПЦР в режиме реального времени (см. Таблицу материалов)для qPCR с 40 циклами 95 градусов по Цельсию для денатурации 5 с, 58 градусов по Цельсию для 30 с аннулированием, и 72 градусов по Цельсию для расширения 30 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная температура аннулирования может варьироваться в зависимости от грунтовки и условий.
   5. Количественная оценка с использованием метода «Ct» или стандартной кривой^12.

4. Thermorecovery анализ для измерения HSR на уровне организма

1. Синхронизируйте червей (раздел 1.2) и поддерживайте при 20 градусах Цельсия до желаемой стадии развития. Для червей N2, молодые взрослые черви, которые еще не достигли репродуктивной зрелости генерируются 60 ч после синхронизации яйцекладки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки развития зависит от каждого штамма и температуры, при которой черви подняты. Важно отметить, что величина индукции HSR снижается примерно в 2-4x после наступления репродуктивной зрелости (см. Обсуждение).
2. Тепловой шок червей, как описано в шаге 2.2 на 6 ч.
3. Снимите пластины с водяной ванны, снимите парафиновую пленку и дайте червям восстановиться при инкубации при 20 градусах по Цельсию на 48 ч.
4. Подсчитайте количество червей, которые могут сразу же уползти после механической стимуляции без отрывистого движения или паралича.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация 6 ч является оптимальным для изучения условий, которые уменьшают thermorecovery, но больше времени экспозиции может потребоваться для поиска условий, которые усиливают thermorecovery.

Используя протоколы, описанные в этой рукописи, индукция HSR была измерена с помощью флуоресцентных репортеров, RT-qPCR и thermorecovery assays. В каждом случае процедура в разделе 1.2 использовалась для создания синхронизированных молодых взрослых червей, которые не достигли репродуктивной зрелости.

Чтобы визуализировать индукцию HSR на клеточном уровне, AM446(hsp-70p::gfp) и CL2070(hsp-16.2p::gfp) флуоресцентные штаммы репортера были проанализированы в соответствии с разделом 2 протокола. В отрицательных образцов контроля без теплового шока, hsp-16.2 репортер только показал нормальный автофлуоресценции, но hsp-70 репортер был составной флуоресценции в анальной мышцы депрессора, как сообщалось ранее4 (Рисунок 1). После 1 ч теплового удара при температуре 33 градуса Цельсия, в обоих репортерах наблюдалась устойчивая флуоресценция; однако, шаблон выражения был различным в зависимости от того, какой репортер был использован (Рисунок 1B). Репортер hsp-70 был самым ярким в кишечнике и сперматозоиде, в то время как репортер hsp-16.2 был самым ярким в глотке. Кроме того, hsp-16.2 репортер имел высокую степень червя к червю изменчивости в количестве индукции, как описано ранее, но hsp-70 репортер не13.

Широко используемый вариант раздела 2 заключается в выполнении теплового удара в сухом инкубаторе вместо циркулирующей водяной ванны. Поэтому была также проверена разница между этими двумя методологиями. Было установлено, что оба протокола привели к надежной индукции двух флуоресцентных репортеров, используя наши условия, хотя циркулирующие ванны воды рекомендуется в качестве наилучшей практики (см. Обсуждение) (Рисунок 1B).

Чтобы проверить зависимость репортеров от транскрипционного фактора HSF-1, кормление РНК было использовано для нокдауна hsf-1 до того, как была измерена индукция репортера. Было установлено, что флуоресценция обоих штаммов была серьезно снижена на HSF-1 нокдаун, указывая, что эти репортеры HSF-1-зависимы, как описано в литературе4 (Рисунок 2). Тем не менее, было также отмечено, что фарингиальной флуоресценции сохраняется в обоих репортеров на hsf-1 нокдаун, который согласуется с предыдущими сообщениями, что фаринговая мышца устойчива к RNAi путем кормления14.

Для количественной индукции всего червя HSR на молекулярном уровне, два эндогенных HSP были измерены с помощью раздела 3 протокола RT-qPCR. Образцы были измерены в трипликате, стандартная кривая была сгенерирована для каждого из грунтовок, и кривая расплава была проанализирована для каждого образца для контроля качества. Было установлено, что тепловой шок на 33 градуса по Цельсию на 1 ч привел к увеличению относительного экспрессии на 2000 раз для двух генов теплового шока, hsp-70 и hsp-16.2 (рисунок 3). Эти результаты показывают, что оба эндогенных гена подходят для измерения индукции HSR и что тепловой шок 33 градусов по Цельсию на 1 ч достаточен для получения существенной реакции. Тем не менее, осторожность должна быть использована в интерпретации абсолютной степени индукции теплового шока, потому что уровни мРНК при отсутствии теплового шока очень низки.

Для анализа физиологической реакции на тепловой шок был протестирован с помощью раздела 4 протокола, который был протестирован организмом. Было установлено, что воздействие червей на 6 ч теплового шока при температуре 33 градусов по Цельсию привело к 20% снижение червей с нормальным движением после 48 ч восстановления (Рисунок 4A). Зависимость этого анализа на HSF-1 транскрипционный фактор был протестирован с помощью кормления РНК нокдаун hsf-1 до разоблачения червей к стрессу. Было установлено, что нокдаун hsf-1 вызвало резкое снижение нормального движения, с 95% червей, показывающих отрывистые движения или паралич после того, как prodded с платиной проволоки забрать.

Мы сравнили этот анализ thermorecovery к широко используемому альтернативному ассему организму обычно refer to как термотолеранс. В анализе термоолеровства, черви подвергаются воздействию непрерывной температуры 35 градусов по Цельсию с помощью сухого инкубатора, и процент живых червей измеряется в различных точках времени. Используя этот анализ, было установлено, что контроль червей непрерывно подвергаются 35 кк, умер после примерно 8 ч воздействия (Рисунок 4B). Однако, когда зависимость этого анализа на HSF-1 была протестирована с использованием нокдауна РНК, было установлено, что ингибирование hsf-1 не вызывает снижения термолерени. Аналогичные результаты ранее были показаны с помощью мутаций HSF-1 (см. Обсуждение). Таким образом, использование анализа термотолерента для измерения HSR не рекомендуется, и thermorecovery является предпочтительным методом для изучения HSR на уровне организма.

Рисунок 1: индукция HSR измеряется с флуоресцентными репортерами. (A) Базальный и (B) тепло-индуцируемое выражение hsp-70p::gfp и hsp-16.2p::gfp репортер штаммов после 1 ч теплового шока при 33 кк в водяной бане или инкубаторе. Черви были подняты на OP50 бактерий на 64 ч, тепло шокированы, а затем восстановлены при 20 градусов по Цельсию в течение 8 ч до визуализации. Для справки, не тепловой шок червей в ()были renormalized в (B) в соответствии с диапазоном и насыщения тепла шокированных червей. Показаны репрезентативные изображения двух экспериментальных репликаций. Масштабная панель No 250 м. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: индукция HSR, измеренная флуоресцентными репортерами, зависит от HSF-1. Штаммы, содержащие hsp-70p::gfp и hsp-16.2p::gfp репортеры были подняты на контроль (L4440 пустой вектор) или hsf-1 RNAi пластин для 64 ч, подвергаются 1 ч теплового шока на 33 кк в водяной бане, а затем восстановлены на 20 C для 8 ч для 8 ч до изображения. Показаны репрезентативные изображения двух экспериментальных репликаций. Масштабная панель No 250 м. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: индукция HSR измеряется с помощью RT-qPCR. N2 черви были подняты на бактерии HT115 для 60 ч, а затем тепло шокированы в течение 1 ч в 33 кк водяной бане. Относительные уровни мРНК hsp-70 (C12C8.1) и hsp-16.2 показаны нормализованы без контроля теплового удара. Значения, на которых построены, являются средними из четырех биологических репликаций, а бары ошибок представляют sem. Статистическая значимость была рассчитана с помощью неоплаченного теста студента. Зп Хтт; 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Thermorecovery, но не термотолеранс, зависит от HSF-1. N2 черви были подняты на контроль (L4440) или hsf-1 RNAi пластины для 60 ч, а затем перенесены либо: (A) 33 КК водяной бане на 6 ч и восстановлены на 20 градусов по Цельсию в течение 48 ч до забил для нормального движения (thercovermorey), или (B) 35 C сухой инкубатор и удалены каждый 2 ч до мертвых (термотероэнс). Каждый анализ был сделан с n 30 человек на 2 независимых дней. Показано среднее значение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Авторам нечего раскрывать.