Method Article

Одновременной количественной оценки выбранных kynurenines проанализированы жидкой хроматографии-масс-спектрометрии в средних собранных из культур раковых клеток

DOI:

10.3791/61031

⸱

May 9th, 2020

 ,  , 
1Laboratory of Separation and Spectroscopic Method Applications, Centre for Interdisciplinary Research, The John Paul II Catholic University of Lublin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описано здесь протокол для определения четырех различных триптофан метаболитов, генерируемых в кюнуренин пути (кинуренин, 3-гидроксикинуренин, ксантуреновая кислота, 3-гидроксиантраниловая кислота) в среде, собранной из раковых клеток культур, анализируемых жидкой хроматографии в сочетании с одной четырехугольной массы спектрометрии.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Квинуренин путь и триптофан катаболиты называется kynurenines получили повышенное внимание за их участие в иммунной регуляции и биологии рака. Анализ культуры клеток in vitro часто используется, чтобы узнать о вкладе различных триптофан катаболитов в механизм болезни и для тестирования терапевтических стратегий. Среда клеточной культуры, богатая секретными метаболитами и сигнальными молекулами, отражает состояние метаболизма триптофана и других клеточных явлений. Новые протоколы для надежной количественной оценки нескольких кюнуренов в сложной среде культуры клеток желательно, чтобы обеспечить надежный и быстрый анализ нескольких образцов. Это может быть достигнуто с помощью жидкой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией. Этот мощный метод используется во многих клинических и исследовательских лабораториях для количественной оценки метаболитов и может быть использован для измерения кюнуренов.

Здесь представлено использование жидкой хроматографии в сочетании с одной четырехугольной масс-спектрометрией (LC-S) для одновременного определения четырех кинуренинов, т.е. кюнуренина, 3-гидроксикинуренанина, 3-гидроксиантраницила и ксантуреновой кислоты в среде, собранной из раковых клеток в пробирке. Детектор S'S прост в использовании и дешевле по сравнению с другими масс-спектрометрами. В анализе СЗ-МС несколько ионов из выборки генерируются и отделяются в соответствии с их конкретным соотношением массы к зарядке(м/з),а затем обнаружением с использованием режима единого ионного мониторинга (SIM).

В настоящем документе обращается внимание на преимущества зарегистрированного метода и указываются некоторые слабые стороны. Основное внимание уделяется важнейшим элементам анализа LC-S, включая подготовку образца, а также хроматографию и анализ масс-спектрометрии. Обсуждаются также вопросы контроля качества, калибровки методов и вопросов матричного эффекта. Мы описали простое применение 3-нитротирозина как один аналоговый стандарт для всех целевых аналитов. Как подтверждают эксперименты с яичниками человека и раковыми клетками молочной железы, предлагаемый метод LC-S генерирует надежные результаты и может быть дополнительно применен к другим клеточным моделям in vitro.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кинуренин путь (KP) является основным маршрутом триптофан (Trp) катаболизм в клетках человека. Индолеамин-2,3-диоксигеназа (IDO-1) в экстрагепатических клетках является первым и ограничивающим ферментом ХП и преобразует ГРП в N-формаилкинуренин1. Дальнейшие шаги в рамках ХП генерируют другие вторичные метаболиты, а именно кюнуреины, которые обладают различными биологическими свойствами. Кыненин (Kyn) является первым стабильным Trp катаболит, показывающий токсичные свойства и регулирующие клеточные события после связывания с рецептором ариловых углеводородов (AhR)2. Впоследствии, Кын превращается в несколько молекул либо спонтанно, либо в ферментно-опосредованном процессах, генерируя такие метаболиты, как 3-гидроксикинуренин (3HKyn), атраниловая кислота (AA), 3-гидроксианнраниловая кислота (3-HAA), кинуреновая кислота (Kyna) и ксантуриновая кислота (XA). Другой ниже по течению метаболит, 2-амино-3-карбоксимуконовой кислоты-6-semialdehyde (ACMS), проходит не-энзиматической циклизации к хинолиновой кислоты (КА) или пиколиновой кислоты (PA)1. Наконец, КК далее преобразуется в никотинамид-аденин динуклеотид(NAD) 3, метаболит конечных точечных КП, который является важным кофактором фермента. Некоторые кинуренины имеют нейропротекторные свойства, такие как Kyna и PA, в то время как другие, т.е. 3HAA и 3HKyn, являютсятоксичными 4. Ксантуреновая кислота, которая образуется из 3HKyn, представляет антиоксидантные и вазорелаксирующие свойства5. XA накапливается в стареющих линзах и приводит к апоптозу эпителиальных клеток6. ХП, описанная в середине20-го века, получила больше внимания, когда было продемонстрировано ее участие в различных расстройствах. Повышенная активность этого метаболического маршрута и накопление некоторых кинуренинов модулируют иммунный ответ и связаны с различными патологическими состояниями, такими как депрессия, шизофрения, энцефалопатия, ВИЧ, слабоумие, боковой амиотрофический склероз, малярия, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона ирак 4,7. Некоторые изменения в метаболизме ГТО наблюдаются в микроокурениях опухолей и раковыхклетках 2,8. Кроме того, кинуренины считаются перспективными маркерами заболевания9. В исследованиях рака, в пробирке модели культуры клеток хорошо известны и широко используются для доклинковой оценки ответов на противораковыепрепараты 10. Метаболиты Trp выделяется клетками в культурную среду и могут быть измерены для оценки состояния кюнуренина. Поэтому необходимо разработать соответствующие методы одновременного обнаружения как можно большего количеством метаболитов КП в различных биологических образцах с простым, гибким и надежным протоколом.

В этой статье мы описываем протокол для одновременного определения четырех метаболитов кинуренина: Кын, 3HKyn, 3HAA и XA LC-S в пост-культурной среде, собранной из раковых клеток. В современном аналитическом подходе, жидкойхроматографии 13,14,15,16 является предпочтительным для одновременного обнаружения и количественной оценки отдельных триптофан катаболитов, в отличие от биохимических неспецифических анализов с использованием эрлихов реагент11,12. В настоящее время существует множество методов определения кинуренцев в образцах человека, в основном на основе жидкой хроматографии с ультрафиолетовыми илифлуоресцентных детекторами 13,17,18,19. Для этого типа анализа больше подходит жидкая хроматография в сочетании с детектором масс-спектрометрии (LC-MS) из-за их более высокой чувствительности (нижние пределы обнаружения), избирательности и повторяемости.

Грп метаболиты уже определены в сыворотке крови человека,плазмы и мочи 13,20,21,22,23, однако, методы для других биологических образцов, как клеточная культура среды также желательно. Ранее LC-MS использовался для соединений, полученных из ГРП, в среде, собранной после культивирования клеток глиомы человека, моноцитов, дендритных клеток или астроцитов, обработанных интерфероной гаммой (IFN-γ)24,25,26. В настоящее время существует необходимость в новых проверенных протоколах, которые могут позволить оценить несколько метаболитов в различных культурных средствах массовой информации, клетках и лечении, используемых в моделях рака.

Цель разработанного метода заключается в количественной оценке (в пределах одного аналитического запуска) четырех основных кинуренинов, которые могут указывать на аномалии в ХП. Представлены здесь критические шаги нашего недавно опубликованного протокола для количественного анализа LC-S выбранных значимых kynurenines с использованием одного внутреннего стандарта (3-нитротирозин, 3NT) в среде, собранной из в пробирке культурных раковых клетокчеловека 27. К нашим лучшим знаниям, это первый протокол LC-S для одновременной количественной оценки 3HKyn, 3HAA, Kyn и XA в культурной среде, полученной из выращенных в пробирке клеток. При некоторых изменениях, метод может быть дополнительно применен для изучения изменений метаболизма Гто в более широком диапазоне моделей клеточной культуры.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка стандартных 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, стандартных фондовых решений XA

  1. Взвешивание реагентов во флаконе с наибольшей точностью (0,3 мг каждый). Для лучшей точности, масштабировать реагенты, регулируя объем растворителя в соответствии с шагом 1.2.
  2. Растворить реагенты в 300 л растворителя для получения стокового раствора 1 г/л. Растворить 3NT в 1% (v/v) мякоть кислоты (FA) в воде; Кын, 3HAA, и XA в диметил сульфоксид (DMSO); 3HKyn в воде подкисленной до рН 2,5 с соляной кислотой (HCl).
    ВНИМАНИЕ: 3HAA раздражает глаза, нос, горло и легкие. Вредно при вдыхании, при контакте с кожей, а при проглатывании. Носите соответствующую защиту, т.е. перчатки и маску.
  3. Плотно закройте флакон и поместите его в ультразвуковую ванну на 1 мин, чтобы ускорить растворение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните фондовые растворы при -20 градусов по Цельсию и минимизируем замораживание/оттаивание (максимум 3 цикла) из-за нестабильности фондовых решений.

2. Подготовка древесного угля обработанной среды культуры

  1. В трубку взвесить 280 мг активированного угля и добавить 5 мл жидкой среды, подготовленной для культивирования клеток, представляющих интерес.
  2. Встряхните трубку со средним и древесным углем на видимую пилу рокера на 2 ч, при комнатной температуре (установленная скорость до 50 колебаний/мин). Далее центрифуга труб при 6000 х г в течение 15 мин.
  3. Снимите трубку с центрифуги и тщательно соберите супернатант, не нарушая осадок. Повторите центрифугирование, если это необходимо, чтобы удалить все остатки древесного угля.
  4. Фильтр супернатант с помощью фильтра шприца 0,45 мкм.
  5. Убедитесь, что уголь предварительно обработаемой среды культуры лишен следов kynurenines путем запуска экспериментального образца на LC-MS, как описано в шаге 6.3.2. В противном случае повторите шаги 2.1-2.4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если полная среда культуры изначально не содержит kynurenines, шаг очистки с использованием древесного угля может быть опущен. В этом случае подготовь стандарты калибровки и образцы контроля качества с использованием полной среды, обычно подготовленной для культивирования клеток.
  6. Храните подготовленную среду при 4 градусов по Цельсию до анализа.

3. Создание калибровочные решения и кривые калибровки

  1. Спайк уголь предварительно обработанной среды культуры с 0,75 л 0,1 г / л 3NT раствора и добавить четыре стандарта (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) по крайней мере в шести различных концентрациях для покрытия калибровочные диапазоны. Держите окончательный объем каждого образца на уровне 150 йл. Вихрь хорошо. Для подготовки образца используйте трубы центрифуги 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые точки калибровки для 3HKyn: 0.018, 0.045, 0.22, 1.12, 2.23, 4.46 ммоль/л; для Kyn: 0.0096, 0.048, 0.24, 1.20, 2.40, 3.84 ммоль/л; для 3 ГАА: 0,033, 0,16, 0,65, 3,27, 6,53, 13,06 ммоль/л; для XA: 0,019, 0,13, 0,49, 1,22, 3,65, 4,87 ммоль/л.
  2. Добавьте 150 мкл холодного метанола (сохраняется при -20 градусов по Цельсию), содержащего 1% (v/v) мимической кислоты в каждую трубку для депротеинизации образца. Плотно закройте трубы и вихрь хорошо.
  3. Инкубировать образцы при -20 градусов по Цельсию в течение 40 мин.
  4. Центрифуга образцов при 14000 х г в течение 15 мин при 4 градусов по Цельсию. Снимите трубки с центрифуги. Собирайте супернатанты в новые трубки. Не беспокоить осадок.
  5. Перенесите 270 МКЛ супернатанта в стеклянный флакон с помощью автоматической пипетки. Положите флаконы в испаритель и осторожно испариться до высыхания. Используйте соответствующую программу для фракций воды/метанола для испарения летучих компонентов. Не применяйте температуру выше 40 градусов по Цельсию и избегайте чрезмерной сушки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плоские нижние стеклянные флаконы, т.е. хроматографические флаконы облегчают более быстрое испарение и более высокие восстановления по сравнению с пластиковыми коническими трубками.
  6. Через 30 минут проверьте состояние испарения. При необходимости продолжайте испарение (например, добавьте еще 10 мин). Избегайте пересушить.
  7. Снимите флаконы с испарителя. Восстановить каждый образец в 60 МКЛ 0,1% (v/v) мимической кислоты в воде. Добавьте растворитель во флакон, содержащий остаточный материал. Плотно закройте флаконы и вихрь-хорошо.
  8. Перенесите образец в трубку 1,5 мл и вращайся при 14 000 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия, чтобы отделить осажденный белок.
  9. Не нарушая белковые гранулы, перенесите супернатанты в хроматографические флаконы с коническими стеклянными вставками с автоматической пипеткой. Плотно закройте флаконы.
  10. Проверьте наличие пузырьков воздуха в флаконе вставки и при необходимости удалите их (например, путем вихря).
  11. Перенесите хроматографические флаконы, содержащие образцы, в автоамплеер LC. Завехать положение образцов, помещенных в поднос автоамплеера.

4. Подготовка образцов контроля качества (КК)

  1. Спайк угольной предварительной культуры среды (подготовлен в 1,5 мл центробежной трубки) с 0,75 л 0,1 г / л 3NT раствор и стандарты четырех kynurenines (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) в одной концентрации, выбранной из линейного диапазона кривых калибровки. Держите окончательный объем образца на уровне 150 МКЛ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если это применимо, подготовьте несколько образцов КК в различных концентрациях, попадающих под линейный диапазон кривой калибровки.
  2. Следуйте протоколу, описанного в разделе 3 (шаги 3.2-3.11).

5. Настройка системы LC-MS

  1. Подготовка мобильных растворителей фазы: Solvent A: 20 ммоль/л аммония длямата в ультрапурной воде (рН 4.3 с поправкой на formic кислоту); Растворитель B: 100% ацетонитрил.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только борозиликатные стеклянные бутылки. Промыть бутылки с ультрачистой водой, прежде чем пополнить его. Не используйте бутылки, очищенные моющими средствами.
    ВНИМАНИЕ: Ацетонитриле вызывает тяжелые последствия для здоровья или смерти. Он легко воспламеняется теплом. Ацетонитриль жидкости и пара может раздражать глаза, нос, горло и легкие.
    1. Приготовьте 5 растворов бульона из аммония, растворив кристаллический реагент (15,77 г) в 50 мл ультрачистой воды в стеклянной бутылке. Перемешать, пока все остатки растворяются. Фильтр через мембрану 0,45 мкм для удаления любого остаточного мусора (например, с помощью фильтра нейлонового шприца). Храните раствор на складе при 4 градусах Цельсия.
    2. Подготовка Solvent A, добавив 4 мл 5 моль / л аммония formate в воде до 980 мл ультрапурной воды в бутылке янтарного стекла и хорошо перемешать. Погрузите перемешивание бар и положить бутылку с растворителем на магнитной мешалки. Погрузите электрод рН в раствор и контролйте рН под перемешиванием. Добавить раствор запасов formic кислоты (98%-100%) dropwise с помощью автоматической пипетки с 0,2 мл наконечник для получения рН 4,3, настроить громкость до 1 л с ультрапурной водой и хорошо перемешать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте растворители по крайней мере один раз в неделю, чтобы предотвратить рост микробов.
      ВНИМАНИЕ: Formic кислоты (FA) является токсичным при вдыхании, вызывает ожоги кожи и повреждения глаз. Работа под капотом дыма; носить защитные перчатки и пальто.
    3. Фильтруем все растворы через мембрану 0,22 мкм (например, фильтр нейлонового шприца), чтобы удалить остаточный мусор. Дополнительно используйте фильтры в входе растворителя, предназначенные для резервуаров растворителя LC для защиты системы от входящих частиц.
  2. Запустите программное обеспечение для управления LC-MS и сбора данных.
  3. Очистить систему LC с мобильной фазы, чтобы удалить пузырьки, и премьер всех каналов растворителя.
  4. Ансамбль гвардейской колонны для защиты аналитической колонки от засорения.
  5. Промыть защитную и аналитическую колонку (C18, 2,1 x 100 мм, 1,8 мкм) со 100% ацетонитрилом около 30 мин, а затем со 100% растворителем А до тех пор, пока не будет наблюдаться стабильное давление в столбце. Управление производительностью системы с помощью программного обеспечения управления.
  6. Установите соответствующие параметры LC в программном обеспечении для сбора данных.
    1. Настройка градиентной программы: 0-8 мин растворителя B 0%; 8-17 мин растворитель B 0-2%; 17-20 мин растворитель B 2%; 20-32 мин растворитель B 10-30%; 32-45 мин растворитель B 0%.
    2. Установите скорость потока мобильной фазы на уровне 0,15 мл/мин, общее время времени ведения анализа в течение 45 мин, температуру столбца на уровне 40 градусов по Цельсию и объем впрыска в 10 мкл.
  7. Установите параметры приобретения детектора масс-спектрометрии.
    1. Применяют параметры ионизации: одиночный ионный мониторинг (SIM), положительная ионизация, давление небулайзера 50 пси, температура сушки газа в 350 градусов по Цельсию, высыхание газового потока 12 л/мин и напряжение капилляров 5500 В.
    2. Выберите ионы мониторинга аналита: для 3HKyn m/z 225.0 (период сканирования: 2-6 мин, напряжение фрагмента: 100 В); для Kyn m/z 209.0 (период сканирования: 6-12 мин, фрагментарное напряжение: 80 В); для 3 ГАА м/з 154,0 (период сканирования: 12-18 мин, фрагментарное напряжение: 80 В); для 3NT м/z 227.0 (период сканирования: 18-23 мин, фрагментарное напряжение: 100 В); для XA m/z 206.0 (период сканирования: 23-45 мин, фрагментарное напряжение: 100 В).
  8. Создать рабочий список и запустить образцы на системе LC.
  9. Сначала, до анализа экспериментальных образцов, запустить пустой образец (Solvent A) по крайней мере в три раза, а затем один образец КК.
  10. Откройте программное обеспечение для анализа данных и загрузите результаты, полученные для образца КК.
  11. Проверьте положение аналитных пиков на хроматограмме. При сдвиге сигналов за пределы ожидаемого положения корректируются ворота времени для соответствующего сбора аналитных сигналов. Смотрите руководство по программному обеспечению для обучения интеграции сигналов.

6. Построение кривой калибровки

  1. В программном обеспечении для сбора данных добавьте стандарты калибровки в рабочий список и запустите стандарты в трилистах.
  2. Интеграция и измерение пиковой области, соответствующей 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT и XA во время удержания около 4,4 мин, 10 мин, 16 мин, 21 мин и 30 мин, соответственно.
  3. Создайте индивидуальные кривые калибровки для каждого метаболита с помощью программы электронной таблицы.
    1. Чтобы создать калибровочную диаграмму, навекрет значение соотношения области аналитного пика над пиковой областью 3NT по сравнению с концентрацией аналита.
    2. Проанализируйте пустой образец (уголь предварительно обработанный среды культуры шипами только с 3NT), чтобы убедиться, что нет никаких следов изученных анализаторов в среде. В противном случае вычесть полученное значение из каждой точки калибровки.
    3. Проверьте линейность каждой кривой калибровки.
      1. Индивидуально, для каждого аналита, создайте линейное уравнение наклона-перехвата (y ax q b), где y соответствует соотношению области пика аналита против 3NT пиковой области, a является склоном, x является концентрацией аналита (змол/л), и b относится к перехвату кривой. Построение графика 'y' по сравнению с 'x' будет генерировать кривую калибровки.
      2. Добавьте к графику линейную линию тренда, отобразить уравнение кривой калибровки и коэффициент регрессии на графике. Убедитесь, что коэффициент регрессии составляет 0,990 евро. В случае несоответствия стандартов калибровки подготовьтесь и/или проанализируйте их еще раз. Дополнительно измените диапазон концентрации кривой калибровки.
    4. Проанализируйте образцы КК, чтобы проверить производительность системы, прежде чем анализировать экспериментальные образцы. В случае несовместимости (± 20% отклонения от эталонного значения) подготовьйте новые кривые калибровки.

7. Культура клеток in vitro и сбор образцов для анализа

  1. Плита изученных раковых клеток (MDA-MB-231 или SK-OV-3) в DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), содержащая 4,5 г/л ᴅ-глюкозы, 10% (v/v) сыворотка крупного рогатого скота плода (FBS), 2 ммоль/л ʟ-глутамин и 1 U пенициллин/стрептомицин и культура при 37 градусах Цельсия во влажной атмосфере 5% CO2, чтобы расширить их для эксперимента. Прохождение клеток на 80% от слияния.
  2. Отделить клетки от культуры блюдо с помощью трипсина, семян для эксперимента на 12-хорошо пластин при плотности 0,3 × 106 клеток на колодец и место в инкубаторе на ночь.
  3. На следующий день, аспирировать культуру среды и добавить свежие DMEM с или без добавления изученных соединений, в зависимости от экспериментального дизайна.
  4. После 48 ч, собирать среду сверху клетки (около 500 МКЛ) в 1,5 мл трубки. Центрифуга при 14 000 х г в течение 5 минут, чтобы удалить любой клеточный мусор. Соберите супернатант и храните при -80 градусов по Цельсию до анализа.
  5. Сохраните клеточные гранулы от шага 7.4 для оценки белка. Заморозить образцы при -20 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты, полученные для среды из различных скважин должны быть нормализовываются для общего содержания белка для учета изменчивости числа клеток в отдельных скважинах. Концентрация белка может быть оценена как описано в шаге 9.

8. Подготовка образцов для анализа LC-MS

  1. Оттепель замороженный образец при комнатной температуре и хорошо перемешать. Передача 149,25 МКЛ среды культуры в центрифугированную трубку (1,5 мл).
  2. Добавьте 0,75 л 0,1 г/л раствора 3NT (внутренний стандарт). Закройте трубы и вихрь хорошо.
  3. Добавьте 150 МКЛ охлажденного при -20 градусах по Цельсию метанола, содержащего 1% (v/v) FA для депротеинизации образца. Закройте трубы и вихрь хорошо.
  4. Продолжить подготовку образца, как описано в разделе 3 (шаги 3.3-3.11).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые раковые клетки, такие как SK-OV-3, выделяет большое количество Кын в культурную среду. Для того чтобы поместить данные в линейный диапазон кривой калибровки, необходимо примерно 100-кратное разбавление образца. В этом случае разбавьте часть образца 0,1% (v/v) FA в воде и проанализируйте в дополнение к неразбавленной выборке. Справочные образцы стандартов для кривой калибровки должны быть подготовлены в 100 раз разбавленной полной среды культуры. Кроме того, добавьте больше точек в кривой калибровки (если будет достигнута надлежащая солучность и линейность), чтобы приспособить ее к уровню концентрации Kyn в экспериментальном образце.
  5. Проанализируйте образцы LC-MS, описанные в разделе 5. Создать рабочий список и запустить каждый образец в тройном.
  6. После завершения рабочего списка измерьте пиковую площадь аналита.
  7. Создание электронной таблицы с использованием доступного программного обеспечения и получения численных данных.
  8. В одной колонке электронной таблицы вычисляйте соотношение области пика аналита над пиковой областью 3NT.
  9. Используйте индивидуальное уравнение линейной калибровки, предназначенную для каждого анализатора (из шага 6.3.) для расчета концентраций анализаторов, присутствующих в экспериментальных образцах.

9. Оценка содержания белка и нормализации данных

  1. Повторное использование клеточных гранул из шага 7.5 со 100 йл фосфат-буферного солевого раствора (PBS) в трубке 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте раствор PBS путем растворения 8 г хлорида натрия, 0,2 г хлорида калия, 1,44 г фосфатного дибаза натрия, фосфата калия в 950 мл ультрапурной воды. Хорошо перемешать. Отрегулируйте рН до 7,4 с помощью соляной кислоты (капля). Отрегулируйте объем до 1 л с ультрачистой водой. Хорошо перемешать до однородности.
    ВНИМАНИЕ: Гидрохлорная кислота очень коррозионная и должна быть обработана с подходящими мерами предосторожности. Контакт с кожей человека может вызвать покраснение, боль, ожоги кожи. Работа под капотом дыма; носить защитные перчатки и пальто.
  2. Заморозить образцы при -20 градусов по Цельсию, а затем разморозить на льду. Повторите этот шаг 3x.
  3. Центрифуга образцов при 14 000 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия. Соберите супернатанты в новые трубки. Не беспокоить гранулы.
  4. Разбавить супернатанты 10x с PBS.
  5. Постройте кривую калибровки от 0 до 2 мкг белка в диапазоне хорошо.
    1. Подготовка крупного рогатого скота сыворотки альбумин (BSA) стандартное решение для калибровки. Растворите 1,23 мкг BSA в 1 мл ультрачистой воды и вихря хорошо.
    2. На пластине из 96 колодец загружаются различные количества стандартного раствора BSA (1,23 мкг/мл): 0 МКЛ, 2 хл, 4 л, 5 йл, 7 КЛ, 10 л, 15 л, 20 ОЛ.
    3. Заполните колодец с PBS до конечного объема 50 йл.
  6. Нагрузка 10 - 15 йл ячейки лизируют от шага 9,4 на той же пластине 96-хорошо. Заполните скважины с PBS, чтобы достичь конечного объема 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости отрегулируйте объем лицатной алициты ячейки в каждом хорошо, чтобы вписаться в линейный диапазон кривой калибровки. Держите окончательный объем до 50 МКЛ образца на колодец.
  7. Добавьте 200 мкл реагента Брэдфорда (разбавленного 5 раз с ультрапурной водой) к каждой колодец.
  8. Инкубировать 96-хорошо паштет, по крайней мере 5 минут при комнатной температуре. Вставьте пластину в считыватель микропластиров. Мера абсорбции на й 595 нм.
  9. Создайте кривую калибровки с помощью программы электронной таблицы. Участок BSA количество (мкг) по сравнению с абсорбансом. Добавьте линейную линию тренда, отобразить уравнение кривой калибровки и коэффициент регрессии на графике.
  10. Для расчета количества белка в образце используйте линейное уравнение (y ax q b, где у соответствует абсорбции в 595 нм, а это склон, х — содержание белка (мкг), а b относится к перехвату кривой).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрим фактор разбавления выборки в расчетах.
  11. Используйте предполагаемое содержание белка для нормализации количества кюнуренина в образце на 1 мг белка. Для этого разделите концентрацию кинуренинов, определяемую в шаге 8.9 с общим содержанием белка от шага 9.10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LC-MS представляет неоспоримые преимущества в количественной оценке биологически активных молекул, хотя некоторые компоненты сложных образцов вызывают так называемые матричные эффекты и компромиссную ионизацию аналитов. Это приводит к подавлению ионов или повышению ионов, сильно снижая точность и влияя на предел обнаружения/количественной оценки LC-MS, который считается «слабой» точкой метода. В нашем протоколе, ионы генерируются электроспрей ионизации (ESI) в положительном режиме, который также был использован в других ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем документе представлен подробный протокол LC-S для одновременной количественной оценки четырех основных метаболитов Trp (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA), которые измеряются в среде из в пробирке культурных раковых клеток человека. Особое внимание уделяется подготовке образца, процедуре хроматографической/массовой спектрометрии и интерпретации данных, что является наиболее важным моментом анализа.

В целом анализ LC-MS, благодаря высокой чувствительности, требует самых высоких стандарт...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Европейским союзом из Европейского фонда регионального развития в рамках оперативной программы развития Восточной Польши 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), факультетом биотехнологии и экологических наук Люблинского католического университета имени Иоанна Павла II (грант молодых ученых для Илоны Садок), Польского национального научного центра, OPUS13 (2017/25/B/N'4/01198 для Магдалены Станишевской, главный следователь).  Авторы благодарят профессора Агнешка Оцибиора из Лаборатории окислительного стресса, Центр междисциплинарных исследований, JPII CUL за совместное использование оборудования для культивирования клеток и количественной оценки белка.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-гидроксы-DL-кинуренинаSigma-AldrichH1771
3-гидроксиантраниловая кислотаSigma-Aldrich14877697%
3-нитро-L-тирозинSigma-AldrichN7389
АцетонитрилSupelco1.00029гиперград для LC-MS LiChrosolv
Активированный угольSupelco05105порошок
Аналитические весыOhaus
Аналитическая колонкаAgilent Technologies959764-902Zorbax Eclipse Plus C18 быстрого разрешения HT (2,1 x 100 мм, 1,8 &; m)
Аммонийный формиатSupelco7022элюентная добавка для LC-MS, LiChropur, ≥ 99,0%
Бычья сыворотка АльбуминСигма1001887398
Крышки для хроматографических флаконовAgilent Technologies5185-5820синие винтовые крышки,ПТФЭ/красный ил сепа Чашка
для клеточных культурГнездо704004полистирол, непирогенный, стерильный
Клеточная культуральная пластинаBiologix07-601212-лунка, непирогенная, нецитотоксичная, стерильная
Клеточный инкубаторThermo Fisher ScientificHERAcell 150i Cu
ЦентрифугаEppendorfмодель 5415R
ЦентрифугаEppendorfмодель 5428
Центрифужные пробиркиBionovoB-2278Eppendorf тип, 1,5 мл
Центрифуга пробиркиBionovoB-3693Falcon тип, 50 мл, PP
Хроматографические данные программное обеспечение для сбора и анализаAgilent TechnologiesLC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
Флаконы с хроматографическими вставкамиAgilent Technologies9301-1387100 &;
L Хроматографические флаконыAgilent Technologies5182-0714 2мл, прозрачное стекло
ДиметилсульфоксидSupelco1.02950Uvasol
Dubelcco' s Модифицированный Eagle' s Medium (DMEM)PAN BiotechP04-41450
Двухметровый pH/проводимостьMettler ToledoSevenMulti
ИспарительGenevacмодель EZ-2.3 Elite
Фетальная бычья сывороткаSigma-AldrichF9665
Муравьиная кислотаSupelco5.33002для LC-MS LiChropur
Стеклянная бутылка для храненияреагентовBionovoS-207050 мл, прозрачное стекло
Защитная колоннаAgilent Technologies959757-902Zorbax Eclipse Plus-C18 Узкая защитная колонна (2,1 x 12,5 мм, 5 & микро; m)
Соляная кислотаMerck1.00317.1000
L-кинуренинSigma-AldrichK8625≥ 98% (ВЭЖХ)
Магнитная мешалкаWigoES 21 H
МикровесыMettler Toledoмодель XP6
Milli-Q система MilliporeZRQSVPO30Direct-Q 3 UV с насосом
Квадрупольный масс-спектрометрAgilent TechnologiesG1948Bмодель 6120
Пенициллин-стрептомицинSigma-Adrich048M4874V
Планшетный считывательBio TekSynergy 2 под управлением Gen5
Хлорид калияMerck1.04936.1000
Дигидрофосфат калияMerck1.05108.0500
Концентрат реагента для анализа белкаBioRad500-0006
Качалка качалкиStuartSSL4
Серологическая пипеткаNest3260015 мл, полистирол, непирогенный, стерильный
Хлорид натрияSigma-Aldrich7647-14-5
Натрия фосфат двухосновнойMerck1.06346.1000
Входной фильтр растворителяAgilent Technologies5041-2168стеклянный фильтр, 20 мкм; m размер пор
Резервуар для растворителя (для LC-MS)Agilent Technologies9301-65241 л, прозрачное стекло
Резервуар для растворителя (для LC-MS)Agilent Technologies9301-65261 л, янтарное стекло
Программа для работы с электронными таблицамиMicrosoft OfficeMicrosoft Office Excel
Stir barBionovo6-2003тефлоновым покрытием
Шприцевые фильтры для культуры средняя фильтрацияBionovo7-8803регенерированная целлюлоза, Ø 30 мм, 0,45 &; m
Шприцевые фильтры для фильтрации подвижных фазовых компонентовBionovo6-0018нейлон, Ø 30 мм, 0,22 &; m
Планшеты для культивирования тканейVWR10062-90096-лунки, стерилл
Trypsin-EDTA SolutionSigma-AldrihT4049-100 мл
Сверхвысокопроизводительная система жидкостной хроматографииAgilent TechnologiesG1367D, G1379B, G1312B, G1316C1200 Infinity система, состоящая из автосамплера (G1367D), дегазатора (G1379B), бинарного насоса (G1312B), термостата колонки (G1316C)
Ультразвуковая ваннаPolsonic104533модели 6D
VortexBiosanмодель V-1 плюс
ксантуреновая кислотаSigma-AldrichD12080496%
с

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
  2. Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology. Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).
  3. Badawy, A. A. B. Kynurenine pathway and human systems. Experimental Gerontology. 129, (2020).
  4. Chen, Y., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states. International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).
  5. Sathyasaikumar, K. V., et al. Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects. Neuroscience. 367, 85-97 (2017).
  6. Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid. BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).
  7. Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. 3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system. Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).
  8. Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity. Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286(2018).
  9. Tan, V. X., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis. Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).
  10. Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).
  11. Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity. Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).
  12. Park, A., et al. Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways. Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).
  13. Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M. Chromatographic analysis of tryptophan metabolites. Journal of Separation Science. 40 (15), 3020-3045 (2017).
  14. Fuertig, R., et al. LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain. Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).
  15. Marcos, J., et al. Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).
  16. Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).
  17. Lesniak, W. G., et al. Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites. Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).
  18. Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection. International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).
  19. Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection. Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).
  20. Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum. Journal of Biological Methods. 4 (3), 75(2017).
  21. Arnhard, K., et al. A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma. Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).
  22. Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).
  23. Huang, Y., et al. A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients. Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).
  24. Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).
  25. Zhu, W., et al. Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).
  26. Hashioka, S., et al. Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes. Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).
  27. Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).
  28. Annesley, T. M. Ion suppression in mass spectrometry. Clinical Chemistry. 49 (7), 1041-1044 (2003).
  29. Houée-Lévin, C., et al. Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences. Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).
  30. Wei, H., et al. Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage. Reproductive Sciences. , e1933719119833788 (2019).
  31. Liu, P., et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes. BMC Cancer. 9, 416(2009).
  32. Mailankot, M., et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Kynurenine QuantificationLiquid ChromatographyMass SpectrometryCancer Cell CultureSample PreparationCalibration CurveSingle Ion MonitoringProtein NormalizationQuality ControlInternal Standard

Related Articles