Одновременной количественной оценки выбранных kynurenines проанализированы жидкой хроматографии-масс-спектрометрии в средних собранных из культур раковых клеток

Summary

Описано здесь протокол для определения четырех различных триптофан метаболитов, генерируемых в кюнуренин пути (кинуренин, 3-гидроксикинуренин, ксантуреновая кислота, 3-гидроксиантраниловая кислота) в среде, собранной из раковых клеток культур, анализируемых жидкой хроматографии в сочетании с одной четырехугольной массы спектрометрии.

Abstract

Квинуренин путь и триптофан катаболиты называется kynurenines получили повышенное внимание за их участие в иммунной регуляции и биологии рака. Анализ культуры клеток in vitro часто используется, чтобы узнать о вкладе различных триптофан катаболитов в механизм болезни и для тестирования терапевтических стратегий. Среда клеточной культуры, богатая секретными метаболитами и сигнальными молекулами, отражает состояние метаболизма триптофана и других клеточных явлений. Новые протоколы для надежной количественной оценки нескольких кюнуренов в сложной среде культуры клеток желательно, чтобы обеспечить надежный и быстрый анализ нескольких образцов. Это может быть достигнуто с помощью жидкой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией. Этот мощный метод используется во многих клинических и исследовательских лабораториях для количественной оценки метаболитов и может быть использован для измерения кюнуренов.

Здесь представлено использование жидкой хроматографии в сочетании с одной четырехугольной масс-спектрометрией (LC-S) для одновременного определения четырех кинуренинов, т.е. кюнуренина, 3-гидроксикинуренанина, 3-гидроксиантраницила и ксантуреновой кислоты в среде, собранной из раковых клеток в пробирке. Детектор S'S прост в использовании и дешевле по сравнению с другими масс-спектрометрами. В анализе СЗ-МС несколько ионов из выборки генерируются и отделяются в соответствии с их конкретным соотношением массы к зарядке(м/з),а затем обнаружением с использованием режима единого ионного мониторинга (SIM).

В настоящем документе обращается внимание на преимущества зарегистрированного метода и указываются некоторые слабые стороны. Основное внимание уделяется важнейшим элементам анализа LC-S, включая подготовку образца, а также хроматографию и анализ масс-спектрометрии. Обсуждаются также вопросы контроля качества, калибровки методов и вопросов матричного эффекта. Мы описали простое применение 3-нитротирозина как один аналоговый стандарт для всех целевых аналитов. Как подтверждают эксперименты с яичниками человека и раковыми клетками молочной железы, предлагаемый метод LC-S генерирует надежные результаты и может быть дополнительно применен к другим клеточным моделям in vitro.

Introduction

Кинуренин путь (KP) является основным маршрутом триптофан (Trp) катаболизм в клетках человека. Индолеамин-2,3-диоксигеназа (IDO-1) в экстрагепатических клетках является первым и ограничивающим ферментом ХП и преобразует ГРП в N-формаилкинуренин¹. Дальнейшие шаги в рамках ХП генерируют другие вторичные метаболиты, а именно кюнуреины, которые обладают различными биологическими свойствами. Кыненин (Kyn) является первым стабильным Trp катаболит, показывающий токсичные свойства и регулирующие клеточные события после связывания с рецептором ариловых углеводородов (AhR)². Впоследствии, Кын превращается в несколько молекул либо ....

Protocol

1. Подготовка стандартных 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, стандартных фондовых решений XA

1. Взвешивание реагентов во флаконе с наибольшей точностью (0,3 мг каждый). Для лучшей точности, масштабировать реагенты, регулируя объем растворителя в соответствии с шагом 1.2.
2. Растворить реагенты в 300 л растворителя для получения стокового раствора 1 г/л. Растворить 3NT в 1% (v/v) мякоть кислоты (FA) в воде; Кын, 3HAA, и XA в диметил сульфоксид (DMSO); 3HKyn в воде подкисленной до рН 2,5 с соляной кислотой (HCl).
   ВНИМАНИЕ: 3HAA раздражает глаза, нос, горло и легкие. Вредно при вдыхании, при контакте с кожей, а при проглатывании. Носите соответствующую защиту, т.е. ....

Results

LC-MS представляет неоспоримые преимущества в количественной оценке биологически активных молекул, хотя некоторые компоненты сложных образцов вызывают так называемые матричные эффекты и компромиссную ионизацию аналитов. Это приводит к подавлению ионов или повышению ионов, сильно снижая точность и влияя на предел обнаружения/количественной оценки LC-MS, который считается «слабой» точкой метода. В нашем протоколе, ионы генерируются электроспрей ионизации (ESI) в положительном режиме, который также был использован в других .......

Discussion

В настоящем документе представлен подробный протокол LC-S для одновременной количественной оценки четырех основных метаболитов Trp (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA), которые измеряются в среде из в пробирке культурных раковых клеток человека. Особое внимание уделяется подготовке образца, процедуре хроматографической/массовой спектрометрии и интерпретации данных, что является наиболее важным моментом анализа.

В целом анализ LC-MS, благодаря высокой чувствительности, требует самых высоких стандарт.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-гидроксы-DL-кинуренина	Sigma-Aldrich	H1771
3-гидроксиантраниловая кислота	Sigma-Aldrich	148776	97%
3-нитро-L-тирозин	Sigma-Aldrich	N7389
Ацетонитрил	Supelco	1.00029	гиперград для LC-MS LiChrosolv
Активированный уголь	Supelco	05105	порошок
Аналитические весы	Ohaus
Аналитическая колонка	Agilent Technologies	959764-902	Zorbax Eclipse Plus C18 быстрого разрешения HT (2,1 x 100 мм, 1,8 &; m)
Аммонийный формиат	Supelco	7022	элюентная добавка для LC-MS, LiChropur, ≥ 99,0%
Бычья сыворотка Альбумин	Сигма	1001887398
Крышки для хроматографических флаконов	Agilent Technologies	5185-5820	синие винтовые крышки,ПТФЭ/красный ил сепа Чашка
для клеточных культур	Гнездо	704004	полистирол, непирогенный, стерильный
Клеточная культуральная пластина	Biologix	07-6012	12-лунка, непирогенная, нецитотоксичная, стерильная
Клеточный инкубатор	Thermo Fisher Scientific		HERAcell 150i Cu
Центрифуга	Eppendorf		модель 5415R
Центрифуга	Eppendorf		модель 5428
Центрифужные пробирки	Bionovo	B-2278	Eppendorf тип, 1,5 мл
Центрифуга пробирки	Bionovo	B-3693	Falcon тип, 50 мл, PP
Хроматографические данные программное обеспечение для сбора и анализа	Agilent Technologies		LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
Флаконы с хроматографическими вставками	Agilent Technologies	9301-1387	100 &;
L Хроматографические флаконы	Agilent Technologies	5182-0714 2	мл, прозрачное стекло
Диметилсульфоксид	Supelco	1.02950	Uvasol
Dubelcco' s Модифицированный Eagle' s Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-41450
Двухметровый pH/проводимость	Mettler Toledo		SevenMulti
Испаритель	Genevac		модель EZ-2.3 Elite
Фетальная бычья сыворотка	Sigma-Aldrich	F9665
Муравьиная кислота	Supelco	5.33002	для LC-MS LiChropur
Стеклянная бутылка для хранения	реагентовBionovo	S-2070	50 мл, прозрачное стекло
Защитная колонна	Agilent Technologies	959757-902	Zorbax Eclipse Plus-C18 Узкая защитная колонна (2,1 x 12,5 мм, 5 & микро; m)
Соляная кислота	Merck	1.00317.1000
L-кинуренин	Sigma-Aldrich	K8625	≥ 98% (ВЭЖХ)
Магнитная мешалка	Wigo		ES 21 H
Микровесы	Mettler Toledo		модель XP6
Milli-Q система Millipore		ZRQSVPO30	Direct-Q 3 UV с насосом
Квадрупольный масс-спектрометр	Agilent Technologies	G1948B	модель 6120
Пенициллин-стрептомицин	Sigma-Adrich	048M4874V
Планшетный считыватель	Bio Tek		Synergy 2 под управлением Gen5
Хлорид калия	Merck	1.04936.1000
Дигидрофосфат калия	Merck	1.05108.0500
Концентрат реагента для анализа белка	BioRad	500-0006
Качалка качалки	Stuart	SSL4
Серологическая пипетка	Nest	326001	5 мл, полистирол, непирогенный, стерильный
Хлорид натрия	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Натрия фосфат двухосновной	Merck	1.06346.1000
Входной фильтр растворителя	Agilent Technologies	5041-2168	стеклянный фильтр, 20 мкм; m размер пор
Резервуар для растворителя (для LC-MS)	Agilent Technologies	9301-6524	1 л, прозрачное стекло
Резервуар для растворителя (для LC-MS)	Agilent Technologies	9301-6526	1 л, янтарное стекло
Программа для работы с электронными таблицами	Microsoft Office		Microsoft Office Excel
Stir bar	Bionovo	6-2003	тефлоновым покрытием
Шприцевые фильтры для культуры средняя фильтрация	Bionovo	7-8803	регенерированная целлюлоза, Ø 30 мм, 0,45 &; m
Шприцевые фильтры для фильтрации подвижных фазовых компонентов	Bionovo	6-0018	нейлон, Ø 30 мм, 0,22 &; m
Планшеты для культивирования тканей	VWR	10062-900	96-лунки, стерилл
Trypsin-EDTA Solution	Sigma-Aldrih	T4049-100 мл
Сверхвысокопроизводительная система жидкостной хроматографии	Agilent Technologies	G1367D, G1379B, G1312B, G1316C	1200 Infinity система, состоящая из автосамплера (G1367D), дегазатора (G1379B), бинарного насоса (G1312B), термостата колонки (G1316C)
Ультразвуковая ванна	Polsonic	104533	модели 6D
Vortex	Biosan		модель V-1 плюс
ксантуреновая кислота	Sigma-Aldrich	D120804	96%