Методическая статья

Использование цитометрии потока для обнаружения и количественного изменения формации крови в развивающейся зебрефиш

DOI:

10.3791/61035

⸱

29 апреля 2021 г.

 , 
1Department of Biological Sciences, California State University, Chico

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот анализ является простым методом количественно гематопоэтических клеток в развивающихся эмбриональных зебры. Клетки крови от диссоциированных зебры подвергаются анализу цитометрии потока. Это позволяет выявлять дефекты крови у животных-мутантов и после генетической модификации.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разнообразие клеточных линий, составляющих зрелую кровь у позвоночных животных, возникает в результате дифференциации гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (ГСПК). Это критический процесс, который происходит на протяжении всей жизни организмов, и нарушение молекулярных путей, участвующих во время эмбриогенеза может иметь катастрофические долгосрочные последствия. По множеству причин,зебрафиш (Danio rerio) стала моделью организма для изучения гематопоеза. Эмбрионы зебры развиваются внешне, и к 7 дням постферизайние (dpf) произвело большинство подтипов окончательных клеток крови, которые будут сохраняться в течение их жизни. Анализы для оценки количества гематопоэтических клеток были разработаны, в основном с использованием конкретных гистологических пятен, на месте методы гибридизации, и микроскопия трансгенных животных, которые используют клетки крови конкретных промоутеров вождения выражение флуоресцентных белков. Тем не менее, большинство окрашивания анализы и на месте методы гибридизации точно не количественно количество клеток крови настоящее время; только большие различия в числах клеток легко визуализированы. Использование трансгенных животных и анализ лиц с флуоресцентной или конфокаленной микроскопией может быть выполнена, но количественная оценка этих анализов зависит либо от подсчета вручную, либо от использования дорогостоящего программного обеспечения для визуализации, оба из которых могут делать ошибки. Разработка дополнительных методов для оценки количества клеток крови будет экономичной, быстрее, и даже может быть автоматизирована, чтобы быстро оценить влияние CRISPR-опосредованные генетической модификации, морфолино-опосредованное сокращение стенограммы, и влияние лекарственных соединений, которые влияют на гематопоеза в больших масштабах. Этот новый анализ количественных клеток крови выполняется путем разобщенности целых эмбрионов зебры и анализа количества флуоресцентно помеченных клеток крови присутствует. Эти анализы должны позволить выяснение молекулярных путей, ответственных за генерацию клеток крови, расширение и регулирование во время эмбриогенеза, что позволит исследователям в дальнейшем обнаружить новые факторы, измененные во время заболеваний крови, а также пути, необходимые во время эволюции позвоночных гематопоэз.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Производство крови (гематопоезис) является важным процессом развития, который впервые начинается в раннем эмбрионе. Этот процесс начинается с генерации примитивных красных кровяных телец и макрофагов непосредственно из мезодерма, а затем смещается в сторону производства гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (ГФУ). Эти стволовые клетки, которые являются многопотентными, генерируют все разновидности зрелых клеток крови в организме. Способная к самооб обновлению, система постоянно пополняется через эти ГЦП. В то время как этот процесс начинается на ранних стадиях развития, гематопоеза продолжается для жизни животного, обеспечивая возможность транспортировки кислорода в отдаленные места тела, чтобы остановить кровотечение после травмы, и защитить организм от инфекции. Развитие этой сложной системы контролируется временно и пространственно во время развития, и любые возмущения в производстве клеток крови могут быть катастрофическими для организма, что приводит к анемии, тромбоцитопении, лейкопении и лейкемии.

Популярной моделью животных, используемой для гематопоэтических исследований, является зебрафиш(Danio rerio),потому что они имеют аналогичное развитие крови по сравнению с людьми. В самом деле, многие из генов и молекулярных путей, используемых во время гематопоэза сохраняется на протяжении всей эволюции позвоночных, что позволяет нам узнать о человеческих генах, изучая зебры. Важно отметить, что эмбрионы зебры развиваются вне тела и в течение 7 дней породили большинство зрелых типов клеток крови, что позволяет для прямой визуализации гематопоэтической системы в короткий промежуток времени. Зебрафиш также чрезвычайно fecund, что позволяет исследователям наблюдать большее количество образцов в короткие сроки, что также важно для генерации воспроизводимых данных. Короткое время генерации зебры и внешнее развитие обеспечивает более легкую манипуляцию и наблюдение во время исследований мутагенеза1,2,3,4,5 и скринингапрепарата 6,7,8,9,10. Это позволяет группе перспективных терапевтических соединений для человеческих заболеваний крови, чтобы быть быстро и эффективно протестированы.

Важно отметить, что зебры также генетически подложки, и геном секвенирован и аннотирован. Эта трактуируемость позволяет обратные методы генетики, такие как морфолино- (MO-) опосредованное нокдаун и CRISPR-опосредованной генетической абляции, которые будут выполняться. Зебрафиш также доказали свою полезность в качестве модели для выполнения вперед генетических экранов; многие основные гены и пути, участвующие в формировании крови позвоночных были обнаружены таким образом. Многочисленные методы наблюдения клеток крови были также разработаны в зебры. В то время как традиционные гистологические методы окрашивания существуют, можно также выполнить на месте гибридизации для крови конкретных стенограмм. Важно отметить, что многочисленные трансгенные линии рыбы также существуют в соответствии с которой флуоресцентные белки выражаются линии конкретных промоутеров, что позволяет маркировки конкретных клеток крови сфлуоресцентными белками 11. Это позволяет исследователям выполнять до минуты наблюдения генезиса клеток крови, расширение и регулирование в живом организме с течением времени.

В целом, сохранение гематопоэтической системы, наличие и легкое развитие трансгенных линий, легкая визуализация и короткое время генерации сделали зебру экономичной, быстрой и адаптируемой моделью гематопоэза. Чтобы улучшить набор инструментов, доступных для исследователей зебры, мы разработали этот анализ, чтобы надежно количественно количество клеток крови в эмбрионах. Метод включает переваривание трансгенных животных и выполнение цитометрии потока для флуоресцентных клеток крови. Таким образом, клетки крови животных-мутантов, эффект модификации MO и CRISPR, а также эффект малых молекул могут быть количественно проанализированы в быстрой и воспроизводимой манере. Эти анализы являются удобными и экономичными способами перечисления клеток крови, что позволяет с течением времени изутовить их генерацию, распространение и техническое обслуживание.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Институциональный комитет по уходу за животными и использованию (IACUC) консультативный совет в Университете штата Калифорния, Чико, одобрил все методы, описанные ниже.

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется лечить эмбрионы с 1-фенил 2-thiourea (PTU; Таблица 1) в течение 24 часов после послеферетия (hpf) для предотвращения пигментации, которая негативно влияет на дискриминацию флуоресценции по цитометрии потока. Все процедуры, перечисленные ниже, приемлемы для цитометрии потока и флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS). Однако, если одна цель состоит в культуре гематопоэтических клеток после FACS, а затем придерживаться стерильных практик при обработке образцов. Протокол для отбеливания и подготовки образцов эмбриона стерильным способом был описан ранее12.

1. Декорионация 48 л.с. эмбрионов зебры

  1. С эмбрионами (не менее 5, но не более 200 эмбрионов) в 10-сантиметровой пластиковой чашке Петри, наклоните блюдо так, чтобы эмбрионы опустились на нижний край.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Легко наклонить блюдо, сняв крышку и поместив крышку под один край чашки Петри.
  2. Удалите и отбросьте какможно больше среды E3(таблица 1 ) и добавьте 500 л протеазы дегорионации (10 мг/мл). Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут.
  3. После 5 минут, забрать чашку Петри (сохраняя все эмбрионы на нижнем краю пластины), и осторожно нажмите сторону чашки Петри, что позволяет эмбрионам аккуратно руб против нижней части пластины, чтобы полностью удалить хорионы.
  4. С выжать бутылку, добавить 20 мл E3 среды для разбавления протеазы. Разрешить эмбрионов, чтобы успокоиться и удалить E3 среды путем декантирования.
  5. Повторите шаг 1.4 3x, чтобы удалить все следы протеазы дегорионации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа каждого отдельного образца требуется не менее 5 эмбрионов. Эта процедура декорионации может вместить до 200 эмбрионов на чашку Петри. Образцы могут быть сгруппированы на данном этапе и разделены позже при желании. Кроме того, ручная декорионация может быть выполнена путем мягкого разрыва хорионов с силами часовщика. Это выгодно, когда есть небольшое количество эмбрионов. Обычно зебрафиш вылупляется из своих хорионов на 72 л.с. Тяжело пороков развития эмбрионов не может, однако, и потребует дехорионации (либо ручной или химической) после этого времени.

2. Подготовка образцов эмбрионов для диссоциации

  1. Используя пипетку P1000, поместите 5–10 эмбрионов в одну микроцентрифугную трубку 1,5 мл.
  2. Удалите E3 среды с пипеткой и отбросить.
    ВНИМАНИЕ: Pipette с осторожностью, как эмбрионы могут быть легко отброшены в течение следующих шагов.
  3. Добавьте 1 мл 10 мм дитиотрейтол (DTT) в E3 среды, чтобы удалить слизистое покрытие окружающих эмбриональныхзебры 11,12,13,14. Положите трубку микроцентрифуга горизонтально и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут.

3. Диссоциация эмбрионов

  1. Вымойте эмбрионы 3x с 1 мл фосфата Dulbecco буферного солевого раствора (DPBS) с Ca2 "и Mg2", чтобы удалить следы DTT. После последней стирки добавьте 500 л DPBS спротеазой диссоциации Ca 2 и Mg2 и 5 л 5 мг/мл (26 U/mL).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие изотонические буферные растворы могут быть использованы, но они должны содержать Ca2 "и Mg2" для диссоциации фермента функционировать должным образом.
  2. Инкубировать образцы при 37 градусов по Цельсию на горизонтальном орбитальном шейкере при 185 об/мин в течение 60 мин. Тритуратные эмбрионы с пипеткой P1000 до тех пор, пока образцы не будут полностью разобщены.
    ВНИМАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы не переутомить эмбрионы; некоторые твердые ткани должны присутствовать, и она не должна быть полностью однородной. Можно перенагромоть, что уничтожит целевые кровяные тельца, которые будут наблюдаться на цитометре потока(дополнительный рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура лучше всего подходит для эмбрионов 48-72 л.с. Более поздние этапы могут потребовать более длительной инкубации с протеазой диссоциации. Сроки для различных этапов должны быть определены эмпирически. Существуют более быстрые альтернативные методы для разобщения эмбриональной ткани, но эмпирически установлено, что этот метод, хотя он занимает 60 минут, является мягким и достаточно тщательным, чтобы обеспечить эффективную изоляцию живых гематопоэтических клеток.

4. Подготовка диссоциированных эмбрионов для цитометрии потока

  1. Pipette 5 диссоциированных эмбрионов на верхнем резервуаре 5 мл полистирола круглой нижней трубки с 35 мкм клеток ситечко крышка.
  2. Промыть клетки, добавив 4 мл фосфата буферного солевого раствора (PBS) без Ca2 "или Mg2" в ситечко крышка 5 мл полистирола трубки, содержащей фильтрованные клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие изотонические буферные решения также могут быть использованы, но они должны не иметь Ca2 "или Mg2", чтобы разбавить и сделать диссоциации фермента неэффективным.
  3. Центрифуга трубки при 4 градусов по Цельсию и 300 х г в течение 5 мин, чтобы гранулировать клетки. С пипеткой, удалить и отказаться от супернатанта. Повторное распределение клеток в 500 л PBS (без Ca2 "или Mg2").

5. Цитометрия потока

  1. Аккуратно вихрь клеточной подвески и добавить 1:1000 красный мертвых клеток пятно(Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Красный мертвых клеток пятно клеток проницаемый краситель, который позволяет исключение мертвых клеток и мусора из целевых клеток и является отличным выбором красителя для мертвых клеток дискриминации, потому что он взволнован 633 нм лазера, который отличается от 488 нм лазер используется для возбуждения общих флуорофоров, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и DsRed. Таким образом, нет спектрального перекрытия от мертвых клеток и трансгенных клеток крови. Propidium йодид (PI) на 1 мг / мл является недорогой альтернативой красный мертвых клеток пятно, но убедитесь, что зарезервировать некоторые образцы окрашены только с ИП, а также образцы только с фторфором интерес установить инструмент компенсации. В противном случае сигналы PI и фторфоров, таких как GFP, будут перекрываться, что приведет к ложноположим результатам. Если поток цитометра также имеет 405 нм лазера, другие красители, такие как синий папа ячейки пятно также отличный выбор.
    ВНИМАНИЕ: При анализе клеток крови, обратите внимание, что после 30 мин определенные типы клеток начнут фагоцитозы красные мертвые пятна клеток. Держите клетки защищены от света и на льду до анализа и выполнять цитометрию потока в течение 30 минут после добавления красителя.
  2. Анализ цитометрии потока
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый цитометр потока немного отличается, но следующие шаги помогут в подготовке образцов для анализа на большинстве машин. Для пользователей, новых для потока цитометрии, обратитесь за советом к тому, кто является экспертом по конкретной части оборудования. Следующие инструкции относятся к цитометру потока потока BD FACSAria Fusion.
    1. Включите цитометр и дайте лазерам прогреться в течение 20 минут. Пустой резервуар для отходов, заполнить оболочку бак с соответствующим решением (изменяется на основе потока цитометра) и начать жидкости системы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существует, как правило, определенная процедура запуска для каждого типа цитометра потока; внимательно следите за этой процедурой запуска.
    2. В программном обеспечении анализа нарисуйте пять участков(рисунок 1A).
      1. Испустить первую точку участка измерения вперед рассеяния (FSC) на оси x и бокового рассеяния (SSC) на оси y. Установите FSC как линейный и SSC как журнал.
        ПРИМЕЧАНИЕ: FSC является измерение размера клеток, и SSC является измерение детализации; это позволит различать клетки от мусора. Эмбриональные популяции клеток крови зебры не разделяются по размеру и детализации так же, как взрослые клетки крови зебры, описанныеранее 15. Вместо этого они будут появляться в той же популяции со всеми другими переваренными эмбриональными клетками.
      2. Установите второй участок для изучения высоты FSC (H) по сравнению с шириной FSC (W). Установите третий участок для измерения SSC (H) против SSC (W).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг используется для исключения дублетов (клеток, которые застряли вместе, когда они проходят через лазер).
      3. Установите четвертую точку участка для измерения красного пятна мертвых клеток на оси х (в зависимости от цитометра это, как правило, эквивалентно фильтру, используемому для алофикоцианина (APC) и SSC на оси y. Это позволит различать живые клетки из мертвых клеток.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Наборы фильтров каждого цитометра могут быть разными. Убедитесь в том, чтобы использовать правильный фильтр обнаружения для мертвых клеток дискриминации красителя.
      4. Пятый сюжет измеряет флюорофор выбора. Визуализуй это как гистограмму флюорофора(рисунок 1)или используйте точечный сюжет(дополнительный рисунок 2).
        ПРИМЕЧАНИЕ: При изучении более одного флюорофора в одном и том же животном рекомендуется использовать точечный участок для просмотра обоих параметров одновременно. Если есть шанс, что фторфоры имеют спектральное перекрытие друг сдругом (Дополнительный рисунок 2), точечный участок также рекомендуется. Используйте настройки Области (A) для расчета области под кривой, генерируемой лазерным импульсом цитометра по всем параметрам, потому что они более точны.
    3. Загрузите образец и уменьшите скорость потока, чтобы образец не закончился быстро. Отрегулируйте настройки FSC и SSC так, чтобы основная часть популяции ячеек была хорошо видны(рисунок 1A).
    4. Нарисуйте ворота вокруг популяции клеток и обозначить его клетками. Убедившись, что вторая точка участок закрыт на ячейки, исключить дублеты, сначала gating на FSC, а затем на SSC синглетов.
    5. На четвертом участке настроить красные настройки пятна мертвых клеток так, что есть явно отрицательное население. Нарисуйте ворота вокруг этих клеток и обозначите их живыми клетками. На пятом участке ворота на живые клетки и исследуют флюорофорные отрицательные и положительные клетки. Нарисуйте ворота вокруг положительных ячеек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта иерархическая стратегия gating рассматривает одиночные флюорофорныеклетки и клетки которые reside в стробе живых клеток, которые также reside в стробе клетки. Позаботьтесь, чтобы установить ворота должным образом. Эти ворота могут быть настроены в зависимости от эксперимента.
    6. Вы запустите каждый образец, собрав не менее 25 000 событий живых ячееок.
    7. Следуйте процедуре выключения, чтобы выключить fluidics. Пополнить оболочку бака и опорожнить резервуар для отходов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Часто бывает трудно визуализировать фторфор и клетки, когда экспрессия белка низкая, или популяция клеток встречается редко. Для обеспечения правильного набора параметров следует подготовить флюорофор- эмбрионы братьев и сестер должны быть подготовлены вместе с правильно рисовать ворота и регулировать лазерное напряжение(дополнительная цифра 2). Если популяция целевых ячееок встречается редко, соберите более 25 000 событий. С 5'10 переваренных животных, надо быть в состоянии собрать миллионы событий. Общее количество фторфоров и клетоктакже может быть получено с помощью этих данных. Просто подсчитайте общее количество клеток в образце с гемоцитометром и умножьте процентфторфора и клеток, чтобы получить абсолютное количество фторфораи клеток на рыбу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы перечислить красные кровяные тельца в эмбриональных зебры, lcr:GFP16 эмбрионов были введены на одноклеточной стадии с PBS, 7,0 нг/nL ism1 MO, или 7,0 нг/ nL ism1 MO с 7,0 нг ism1 mRNA12. При 48 л.с. они перевариваются и подвергаются анализу цитометрии потока. После анализа процентной доли GFP икрасных кровяных телец из каждого образца (каждый образец 5 случайно выбранных эмбрионов;

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Зебрафиш являются отличной моделью системы для изучения примитивных и окончательных позвоночных гематопоэзиса. За последние несколько десятилетий, несколько анализов были разработаны и уточнены, что позволяет зебры, чтобы стать быстрой и экономичной моделью для тестирования наркотиков, генерации и тестирования генетических мутантов, и в целом позволяет исследователям анализировать молекулярные пути, необходимые для гематопоеза. Этот протокол использует эмбриональных зебры, которая позволяет быстрый сбор данных, использов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.L.S. является научным консультантом и получил компенсацию от Finless Foods, Inc. и Xytogen Biotech, Inc. K.F.R. не заявляет о своих конкурирующих интересах.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансирование было предоставлено Национальными институтами здравоохранения (NIH: R15 DK114732-01 в D.L.S.), Национальным научным фондом (NSF: MRI 1626406 до D.L.S.), а также программой Почета в Калифорнийском государственном университете Чико (К.Ф.Р.). Авторы благодарят Бетси Тамиетти за лабораторное управление и Кэти Джонс за административную помощь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл трубка MCFFisherBrand05-408-129
10 мм Чашка Петри из полистирола easygrip CorningFalcon351008
5 мл Полистирол круглый дно с крышкой для фильтраCorning Falcon352235
BD FACSAria Fusion проточный цитометрBD Biosciences
Dithiolthreitol (DTT)Sigma-Aldrich
DPBS (10x) с Ca2+ и Mg2+Life Technologies14080-055
FBS 500 млGemini Bio-Products100-108
HyClone PBS (1x)GE Healthcare Life Sciencessh30256.01
LibreaseRoche Sigma-Aldrich5401119001диссоциативной протеазой
PronaseRoche Sigma-Aldrich11459643001дехорионационная протеаза
SYTOX Red Dead Cell StainInvitrogen С34859
646563

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  2. Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. , 303-309 (1996).
  3. Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
  4. Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes & Development. 13, 2713-2724 (1999).
  5. Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
  6. Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).
  7. Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
  8. Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
  9. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
  10. Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
  11. Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods in Cell Biology. 133, 11-53 (2016).
  12. Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (129), e56836(2017).
  13. Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. III Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , Academic Press. Cambridge, MA. (2009).
  14. Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. I. 100, Elsevier. Boston, MA. 233-260 (2010).
  15. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).
  16. Ganis, J. J., et al. Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR. Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).
  17. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  18. Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
  19. Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, e1-e11 (2013).
  20. Ding, M., et al. Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective. SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).
  21. Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies. Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).
  22. Joslin, J., et al. A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery. SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

zebrafish

Похожие статьи