Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Двойной в утробе электропорации для целевой временно и пространственно отделенных популяций клеток

7.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61046

⸱

14 июня 2020 г.

 ,  ,  , 
1Estructura de Recerca Interdisciplinar en Biotecnología y Biomedicina (ERI BIOTECMED), Departamento de Biología Celular, Biología Funcional y Antropología Física, Universidad de Valencia

В этой статье

Краткое содержание

Двойная электропорация матки позволяет ориентироваться на популяции клеток, которые пространственно и временно разделены. Этот метод полезен для визуализации взаимодействий между этими популяциями клеток с использованием флуоресцентных белков в нормальных условиях, но и после функциональных экспериментов, чтобы возмутить гены, представляющие интерес.

Аннотация

В утробе электропорации in vivo метод передачи ДНК широко используется для изучения молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе кортикогенеза млекопитающих. Эта процедура использует желудочки мозга, чтобы позволить введение ДНК интерес и использует пару электродов, чтобы направить вход генетического материала в клетки, выстилающие желудочек, нервные стволовые клетки. Этот метод позволяет исследователям маркировать желаемые клетки и/или манипулировать выражением генов, представляющих интерес в этих клетках. Он имеет несколько приложений, в том числе анализы, ориентированные на миграцию нейронов, отслеживание линий и аксональный поиск путей. Важной особенностью этого метода является его временный и региональный контроль, позволяющий обойти потенциальные проблемы, связанные с эмбриональной летальностью или отсутствием конкретных мышей-водителей CRE. Другим важным аспектом этого метода является то, что он помогает значительно уменьшить экономические и временные ограничения, которые связаны с генерацией новых линий мыши, которые становятся особенно важными в изучении взаимодействий между типами клеток, которые возникают в отдаленных областях мозга в разном возрасте развития. Здесь мы описываем стратегию двойного электропорации, которая позволяет ориентироваться на популяции клеток, которые пространственно и временно разделены. При таком подходе мы можем маркировать различные подтипы клеток в разных местах с выбранными флуоресцентными белками, чтобы визуализировать их, и/или мы можем манипулировать генами, представляющими интерес, выраженными этими различными клетками в надлежащее время. Эта стратегия повышает потенциал в электропорации матки и обеспечивает мощный инструмент для изучения поведения временно и пространственно разделенных популяций клеток, которые мигрируют для установления тесных контактов, а также дальнобойных взаимодействий через аксональные прогнозы, снижая временные и экономические издержки.

Введение

Кора головного мозга является очень сложной и замысловато организованной структурой. Для достижения такой степени организации, корковые проекционные нейроны проходят через сложные процессы развития, которые требуют их временного поколения, миграции к конечному пункту назначения в корковой пластине, и создания коротких и дальних соединений1,2. Долгое время классический способ изучения кортикогенеза основывался на использовании нокаут-или стук-в мурин модели генов, представляющих интерес. Тем не менее, эта стратегия, и в частности использование условного нокаут мышей, занимает много времени и дорого, а иногда и создает дополнительные проблемы, связанные с существованием генетической избыточности или отсутствие конкретных драйверов CRE, среди других вопросов. Один из подходов, которые возникли, чтобы попытаться решить эти проблемы, и что в настоящее время широко используется для изучения коркового развития в утробеэлектропорации 3,4. В утробе электропорации является метод, используемый для соматического трансгенеза, что позволяет in vivo ориентации нервных стволовых клеток и их потомства. Этот метод может быть использован для обозначения клеток по выражению флуоресцентных белков5,,6, для манипуляции генами in vivo (т.е. получить или потерю функциональных анализов)7,8,9, для изоляции электропорированных кортиков в пробирке и культивирования клеток8,10., Кроме того, в утробе электропорации допускается временное и региональное управление целевым районом. Этот метод имеет многочисленные применения и широко используется для изучения нейронной миграции, деления стволовых клеток, нейронной связи, и другие предметы8,9,11,12.

Нынешняя рукопись описывает использование в утробе электропорации вариант, называется двойной в утробе электропорации, для анализа взаимодействий клеток в коре головного мозга с различными височных и пространственных происхождения. Эти исследования чрезвычайно сложны для завершения при использовании моделей мурина, поскольку они требуют комбинированного использования нескольких трансгенных линий. Некоторые из применений протокола, описанного в настоящем документе, включают изучение тесных взаимодействий между соседними клетками, а также взаимодействия между удаленными клетками через долгосрочные проекции. Метод требует выполнения двух независимых в утробе электропорации операций, разделенных временно и пространственно, на одних и тех же эмбрионов для целевой различных групп клеток, представляющих интерес. Преимуществом такого подхода является возможность манипулирования функцией генов в одном или обоих типах нейронов с использованием диких животных типа. Кроме того, эти функциональные эксперименты могут быть объединены с выражением цитоплазматических или мембранных флуоресцентных белков для визуализации тонкой морфологии целевых клеток, включая дендритов и аксонов, и анализировать возможные различия в клеточных взаимодействиях по сравнению с контролем (т.е. клетки, помеченные только флуоресцентным белком).

Протокол, очерченный здесь, сосредоточен на изучении клеточных взаимодействий внутри неокортекса, но эта стратегия может также быть использована для изучения взаимодействий с внекортикальными областями, которые могут быть направлены с помощью электропорации внутриутробности, как подпаллий или таламус13,,14, или клеточно-клеточных взаимодействий в других структурах, таких как мозжечок15. Ориентация на различные области основана на ориентации электродов и на желудочке, где впрыскивается ДНК (боковая, третья или четвертая). При описанной здесь стратегии мы можем обозначить значительное количество ячеек, что полезно для оценки общих изменений в подключении/иннервации в функциональных экспериментах. Тем не менее, для изучения мелких изменений в подключении, можно использовать модифицированные версии в электропорации матки, чтобы получить разреженную маркировку и определить одиночные клетки16. Таким образом, двойное в утробе электропорации является универсальным методом, который позволяет ориентации временно и пространственно разделенных популяций клеток и изучение их взаимодействия в деталях, либо в условиях контроля или в сочетании с функциональными экспериментами, значительно снижая временные и экономические затраты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Описанная в настоящем чиновническом процедура была одобрена комитетом по этике, отвечающим за эксперименты, благополучие животных Университета Валенсии и Конселлерии де Агрикультура, Десарролло Сельские, Чрезвычайные Климатика и Transici'n Ecol'gica Из Comunidad Валенсиана, и придерживается руководящих принципов Международного совета по лабораторным наукам животных (ICLAS) рассмотрены в реальном Decreto 53/2013 испанского законодательства, а также в Директиве 2010/63/EU Европейского парламента и Совета.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол включает в себя две различные цели: 1) первое исследование, называемое "стратегия А", позволяет анализировать взаимодействия между клетками Cajal-Retzius (CR-клетки) и раннерожденных корковых проекционных нейронов в одном полушарии мозга; 2) второе исследование, "стратегия B", проводится для того, чтобы изучить иннервацию верхнего слоя мозолальных проекционных нейронов к контралатеральной стороне неокортекса.

1. Предупреждении

  1. Препарат ДНК
    1. Преобразуйте химически или электрокомпетентные клетки E. coli DH5 с плазмидами интереса, потените их на пластины LB agar с соответствующим антибиотиком, и инкубировать их на ночь при 37 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все плазмиды, используемые здесь, содержат общий промоутер для куриного й-актина (CAG), вождения выражение флуоресцентного-репортер белка (CAG-mCherry и CAG-EGFP для стратегии A и CAG-BFP и CAG-nEGFP-2A-mtdTomato для стратегии B). Все они содержат устойчивость к ампициллину (AMP).
    2. Выберите отдельные колонии из каждой плазмидной трансформации и инициируйте стартерную жидкую культуру в 2 мЛ бульона Лурия и ампициллина (ЛБЗ AMP) в бактериальных трубках культуры в течение 3–4 ч при 37 градусах с энергичным встряхиванием (200 об/мин). После, установить большую бактериальную культуру в 500 mL Erlenmeyer колбу добавив 200 мл LB-AMP и 1 mL стартовой культуры. Инкубировать ночью при 37 градусах в орбитальном шейкере при 200 об/мин.
    3. Используйте комплект макси-подготовки без эндотоксина(Таблица материалов)в соответствии с инструкциями производителя для получения чистой и концентрированной плазмидной ДНК из жидких культур. Повторное увеличение ДНК в буфере Трис-ЭДТА (TE) без эндотоксина для получения концентраций не менее 5 мкг/л.
    4. Для каждой операции подготовьте раствор с окончательным объемом 10 мл, содержащий 1 мл быстрого зеленого красителя, плазмидный ДНК, представляющий интерес для окончательной концентрации 1 мкг/л для каждой плазмиды, и эндотоксина без буфера TE. Например, смешайте 1 мл быстрого зеленого красителя, 2 л раствора ДНК с плазмидой 5 мкг/л и 7 мл буфера TE.
  2. Пипетт потянув
    1. Вытяните борозиликата стеклянные капилляры (1/0,58 мм внешнего/внутреннего диаметра) в вертикальный микропьеттерный шкив до тех пор, пока кончик не достигнет длины 1–1,5 см, и обрежьте его с помощью рассекающих щипцов под углом примерно 30 градусов под расчленяющей прицелом.
  3. Установка хирургической комнаты
    1. Положите все оборудование на операционный стол (на то есть пинцет, ножницы, щипцы, микропьетты, иглу и иглу). Включите грелку и накройте ее стерильной хирургической абсорбирующей прокладкой. Убедитесь, что резервуар в аппарате для ингаляционной анестезии заполнен изофлураном, кислородный баллон содержит достаточно кислорода, и система функционирует должным образом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургическое отделение и устойчивый материал должны быть как можно более стерильными (т.е. весь материал должен быть автоматически обнаружен до операции, а поверхности должны быть продезинфицированы 70% этанолом). Платиновые электроды должны быть тщательно дезинфицированы сначала с зародышем мылом, а во-вторых с 70% этанола до операции.
    2. Приготовьте 100 мл 0,9% (w/v) стерильный солевой раствор, содержащий пенициллин-стрептомицин 1:100 и заполните 10-сантиметровую чашку Петри. Поместите пластину на верхней части нагретой площадки, чтобы разогреть раствор.
    3. Заполните шприц 1 мл 150 мл обезболивающего раствора (например, бупренорфин 0,1 мг/кг).
    4. Загрузите вытягиваемую пипетки с 5 мл окончательного плазмидного ДНК раствора, подготовленного в шаге 1.1.4. Подключите капилляр к контролируемой ртом аспираторной трубке.

2. Первый в утробе электропорации хирургии

  1. Поместите E11.5 (стратегия A) или E13.5 (стратегия B) C57BL/6 беременной мыши внутри закрытой индукционной камеры с 2,5% (v/v) изофлураном на 0,8 л/мин и подождите, пока она будет анестезирована. Перенесите мышь на грелку и положите ее нос в маску для постоянной доставки изофлурана. Проверьте отсутствие педали рефлекс как показатель правильной анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Embryonic возраст определяется на основе дня, когда вагинальный штепсельной вилки наблюдается (E0.5).
  2. Вводят беременной женщине анальгетиковый раствор (0,1 мг/кг бупренорфина) подкожно. Чтобы предотвратить высыхание глаз во время процедуры, нанесите одну каплю глазной мази на каждый глаз с помощью ватного тампона.
  3. Бритье брюшной области мыши с электрической бритвой и мыть его 2x с 70% (v/ V) этанол салфетки, один раз с йодом салфетки, и в последний раз с этанолом протрите.
  4. Используйте ножницы, чтобы сделать 30 мм длинный разрез через кожу в правой стороне животного и тщательно отделить соседнюю кожу от мышцы с тупой шпателем. После этого сделайте второй разрез в брюшной стенке.
  5. Обложка живота с куском сложенной бумаги ткани ранее дезинфицируют с 70% этанола, содержащего 40 мм длиной щели в центре. Аккуратно вытащите матку из брюшной полости с помощью кольцевых щипцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Матка должна быть мокрой с теплым солевым раствором, подготовленным в шаге 1.3.2 в течение всей процедуры.
  6. Предварительно загрузите вытягиваемые пипетки раствором ДНК, подготовленным в шаге 1.1.4. Впрысните 0,5 мл раствора ДНК на эмбрион в боковой желудочек выбранного полушария с помощью контролируемой ротом аспираторной трубки до тех пор, пока быстрый зеленый краситель не будет заметен внутри желудочка.
  7. Поместите платиновые электроды типа щипцов на голове инъекционного эмбриона (как показано на рисунке 1A и рисунке 2A). Ориентируйте электроды на нужную область мозга. Направьте положительный полюс к медиальной стене, чтобы электропорировать корковый подол (стратегия А) или к боковой коре (стратегия B) для обозначения клеток, генерируемых в этой области.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во всех случаях, сердце и плацента следует избегать, чтобы обеспечить эмбриональное выживание.
  8. Примените специфическую последовательность электрических импульсов с помощью электропоратора квадратной волны по показаниям, указанным в таблице 1 (стратегия эмбрионов A E11.5: четыре импульса 25 В и 40 мс, разделенные интервалами 950 мс; стратегия B E13.5 эмбрионов: пять импульсов 35 V и 60 мс, с интервалами 950 мс).
  9. Аккуратно поместите матку обратно в брюшную полость щипцами, заполните ее теплым солевым раствором и закройте брюшную стенку игольным швом 6-0. Присоединяйтесь к двум сторонам первоначального разреза, сделанного в коже либо с помощью иглы 6-0 швов или швов клипов.
  10. Поддерживайте животное на грелке и следите за ним до его выздоровления после анестезии. Обеспечьте дополнительную дозу анальгезии (150 мл)   в растворе гидрогеля, помещенном в его домашнюю клетку.
  11. Через 24 часа после операции вводят дополнительную дозу анальгезии (150 мл). Продолжить ежедневный мониторинг путем визуального осмотра на возможные боли и бедствия. Наблюдайте за поведением животного, проверяйте его нормальные рефлексы задней конечности и осматривайте шов на наличие возможных признаков повреждения из-за лизания или царапин раны.

3. Второе место в электропорации матки

  1. Через два дня после первой операции, повторите шаги 2.1'2.3. Хотя восстановление беременных женщин после операции очень хорошо, убедитесь, что они показывают нормальное поведение и не представляют никаких признаков боли или бедствия перед выполнением второй операции (E13.5 эмбрионов для стратегии А и E15.5 для стратегии B).
  2. Сделайте 30 мм длинный разрез через кожу, как в шаге 2.4 и второй разрез на брюшной стенке, на этот раз в левой стороне животного. Тщательно подвергать матку на верхней части дезинфицированной ткани, как описано в шаге 2.5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не вмешиваться в разрез, ранее сделанный в другой стороне.
  3. Введите около 0,5 мл на эмбрион раствора ДНК в боковой желудочек мозга полушария, ранее электропорированный в случае стратегии А и в боковой желудочек мозга контралатерского полушария для стратегии B.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только эмбрионы, показывающие нормальное развитие и отсутствие признаков реабсорбции.
  4. Поместите электроды вокруг головы эмбриона, как описано в шаге 2.7, направляя положительный электрод в сторону боковой коры и применяя соответствующие импульсы по показаниям, указанным в таблице 1 (стратегия эмбрионов E13.5: пять импульсов 35 V и 60 мс, разделенных интервалами 950 мс; стратегия B E15.5 эмбрионов: пять импульсов по 50 В и 80 мс, разделенных интервалами 950 мс).
  5. Продолжить и закончить операцию, как описано в шагах 2.8'2.10.

4. Заготовки тканей и секцио сечение

  1. Стратегия А
    1. Через четыре дня после второй электропорации (Е17,5) выполните вывих шейки матки беременной самки и поместите ее в положение на спине.
    2. Используя ножницы, сделайте вентральный разрез для извлечения рога матки и с щипцами поместите их в чашку Петри, наполненную 1x фосфат-буферизированный солевой раствор (PBS), помещенный на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Низкая температура делает возможным обезболивания эмбрионов.
    3. Используя пинцет, извлекайте эмбрионы из амниотического мешка и переносите их с щипцами в новую заполненную PBS чашку Петри под расчленяющим прицелом. Аккуратно держите голову эмбрионов с помощью щипцов и проводите вскрытие мозга пинцетом, чтобы сначала удалить кожу над головой, а затем и черепом. Используйте шпатель, чтобы вытащить открытые мозги.
    4. Соберите мозги ложкой и депозйте их в 48-й колодец, наполненный фиксирующим раствором (4% параформальдегида в 1x PBS). Испытание немедленно для успешного исхода обоих электропораций путем изучения мозга с помощью перевернутого эпифлуоресценции микроскоп, например.
    5. Зафиксировать эмбриональный мозг на ночь при 4 градусах Цельсия в орбитальном шейкере. Вымойте с 1x PBS для устранения следов PFA. Затем перенесите их в PBS с противогрибковыми консервантами (1x PBS-0.05% (w/v) азид натрия).
      ВНИМАНИЕ: ПФА и азид натрия являются цитотоксическими соединениями, которые требуют особой предосторожности во время их использования.
    6. Встраивайте зацикленные мозги в 4% (w/v) низкой температуре плавления агарозы в 1x PBS и подождите 10 минут, пока она не затвердеет. Приклеить их к держателю ткани вибратома с помощью цианоакрилата клея с обонятельными луковицами, обращенными вверх, чтобы получить корональные секции.
    7. Инициировать вибратом и выбрать желаемые параметры: 100 мкм шириной, 0,60 мкм/с скоростью и 0,60 мм амплитуды.
    8. Безопасный мозг внутри контейнера вибратом, заполните его 1x РЕШЕНИЕм PBS, и начните собирать корональные серийные разделы с помощью кисти в 48 хорошо пластины заполнены 1x PBS-0.05% (w/v) натрия азиде иметь полное изображение мозга (например, около семи разделов на колодец и шесть скважин на эмбрион).
    9. Смонтировать желаемые секции в микроскоп стеклянные слайды с помощью тонкой кисти. Обложка их со стеклянными крышками. Для длительного хранения добавляем монтажную среду, которая предотвращает фотосъемку и фотооксоксидацию. Наблюдайте слайды под вертикальным эпифлуоресценцией микроскопом для оценки эффективности электропорации.
  2. Стратегия B
    1. Пусть щенки ранее электропорированных на E13.5 и E15.5 родиться и ждать, пока P15 для выполнения транскардиальной перфузии с использованием того же фиксаторного решения, используемого в шаге 4.1.4.
    2. Непосредственно перед перфузией, интраперитонально вводят дозу 75/1 мг/кг кетамина/медетомидина. Когда педальный рефлекс теряется, обеспечить мышь в положении на спине и сделать брюшной разрез после средней линии с помощью ножниц, чтобы разоблачить как грудная клетка и диафрагма.
    3. Вырежьте диафрагму и откройте грудную клетку, чтобы получить доступ к сердцу. Держите грудную клетку с помощью гемостата и сделайте разрез в правом предсердии с тонкими ножницами.
    4. Проникнуть в левый желудочек с помощью иглы, подключенной с гибкой трубкой к перистальтическому насосу перфузии. Начало транскардиальной перфузии, обеспечивая по крайней мере 25 мл 4% PFA при постоянном потоке 5,5 мл/мин (общее время 5 мин).
    5. Вскрыть мозг переросшие животные. Во-первых, удалить кожу над головой с ножницами и щипцами. Начните резки черепа с помощью ножниц и тщательно снять разделы костей черепа, пока они полностью удалены. Наконец, извлечь мозг с помощью шпателя.
    6. Перенесите мозги на 24-го колодца и зафиксируйте их с 4% PFA на ночь при 4 градусах на орбитальном шейкере. Остановить фиксацию, заменив PFA с 0,05% (w/v) азиде натрия в PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как указано в шаге 4.1.5, желательно провести промежуточную стирку с 1x PBS.
    7. Повторите шаги 4.1.6'4.1.9, изменяя параметры вибрама для послеродового мозга (40 мкм шириной, 1,20 мк/с скоростью и 0,5 мм амплитуды).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иммуногистохимия или иммунофлуоресценция может быть проведена для обнаружения конкретных маркеров клеток или повышения сигнала флуоресцентных белков, используемых в электропорации.

5. Конфокальная флуоресценция изображений и анализа

  1. Включите конфокальный микроскоп, поместите слайды микроскопа, содержащие установленные участки мозга, на держатель слайдов микроскопа и выберите каналы, по которым будут сделаны изображения флуоресценции (т.е. 420-460 нм для BFP, 490-540 нм для GFP и 570-620 нм для mCherry и tdTomato).
  2. Выполните сканирование образца для получения картографических изображений каждого раздела мозга на двух разных длинах волн для общего представления о выходе двойного электропорации. После завершения, выберите 10x объектив и многопрофильной--стек-timelapse режим наблюдения. Это позволит с программированию автоматического приобретения флуоресценции изображений на различных локализациях XY' в разделах мозга.
  3. В каждом из выбранных регионов (XY) установлены надлежащие параметры визуализации (т.е. интенсивность лазера, чувствительность фотомультиля и минимальное разрешение 1024 x 1024), а также глубина сканирования (я) в зависимости от плоскостей образца, где видна флуоресценция.
  4. Получить низкое увеличение (10x) изображения всех выбранных регионов и экспортировать их из формата OIF в формат TIFF с помощью программного обеспечения просмотра микроскопа.
  5. Измените на 60x объектив, повторите шаг 5.3 и захват изображения высокого увеличения для наблюдения за взаимодействиями клеток и клеток более подробным образом. Экспорт их, как указано в шаге 5.4.
  6. Откройте приобретенные изображения с помощью любого программного обеспечения для визуализации (например, Фиджи) для дальнейшего анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Взаимодействие между соседними клетками возникло в дистальных местах и в разное время: клетки Cajal-Retzius (CR-клетки) и ранние мигрирующие корковые проекционные нейроны (стратегия А)

Взаимодействие CR-клеток и ранних корковой проекции нейронов ранее было описано как необходимое для регулирования сомальной транслокации через молекулы смешения нектина и кадерина с помощью стратегии двойной электропорации8. CR-клетки происходят из нейроэпителия по краям ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Изучение клеточно-клеточных взаимодействий в виво в регионах с высокой клеточной плотностью, как кора головного мозга является сложной задачей. Традиционные подходы, включая использование антител для обозначения нейритов, не подходят из-за отсутствия специфических маркеров для различных популяций клеток. Использование трансгенных моделей мурина, где определенный тип клеток выражает флуоресцентный белок, полезно для визуализации нейронных процессов, но это зависит от наличия таких моделей. Эта задача еще более сложна при ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят Кристину Андрес Карбонелл и сотрудников центра по уходу за животными Университета Валенсии за техническую помощь. Мы также хотим поблагодарить Изабель Фариньяс и Сакраменто Р. Феррон за реагенты и обмен их оборудованием с нами. I.M.W финансируется за счет контракта Гарантии Джувениля от Консорциума де Эдуказон де Валенсия (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D финансируется Министерством де Сьенсия, Innovaci'n y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). К.Гиль-Санс имеет Рамон и Каджал Грант (RYC-2015-19058) от испанского Ministerio de Ciencia, Innovaci'n y Universidades (MICINN). Эта работа была профинансирована RYC-2015-19058 и SAF2017-82880-R (MICINN).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ампициллин натриевая сольSigma-AldrichA9518-25G Аспираторная
трубкаSigma-AldrichA5177-5EA
Baby-mixter гемостат (перфузия)Fine Science Tools (FST)13013-14
Боросиликатное стекло капиллярWPI1B100-6
Бупренорфин (BUPREX 0,3 мг/мл)Rb Pharmaceuticals Limited
Плазмида CAG-BFPлюбезно предоставлена U.Mü ller Lab
CAG-EGFP плазмидалюбезно предоставлена U.Mü ller Lab
CAG-mCherry плазмидалюбезно предоставлена U.Mü ller Lab
CAG-mtdПлазмида Томато-2A-nGFPлюбезно предоставлена U.Mü ller Lab Конфокальный
микроскопOlympusFV10i
Ватные палочкиBFHCVDF
Цианоакрилатный клейB. Braun Хирургический1050044
Препарирующий эндоскопZeissstemi 305
Щипцы Dumont #5 Тонкие щипцыFine Science Tools (FST)11254-20
ECM830 Square Волновой электропораторBTX45-0052
Электрическая бритваOster76998
Безэндотоксинный TE буферQIAGEN1018499
Этанол салфеткиBFHCVDF
Extra Fine Graefe ЩипцыFine Science Tools (FST)11150-10
Глазная мазьAlcon682542.6
Быстрый зеленый красительSigma-AldrichF7252-5G
Тонкие ножницыFine Science Tools (FST)14069-09
Флуоресцентные светодиодыCoolLEDpE-300-W
Genopure Plasmid Maxi KitRoche3143422001
Холстед-комары гемостатики (шов)Fine Science Tools (FST)91308-12
ГрелкаUFESAAL5514
Инвертированный эпифлуоресцентный микроскопNikonEclipse TE2000-S
Йодные салфеткиLorsoul
исофторановый испарительрасходомераA15B5001
изофлуранаKarizoo586259
кетамин (анастемин)Fatro Ibé rica SL583889-2
Прецизионные салфеткиKimberly-Clark7252
LB (Lennox) Агар GENLabkemAGLB-00P-500
LB (Lennox) бульон GENLabkemLBBR-00P-500
Низкая температура плавления агарозыFisher ScientificBP165-25
Медетомидин (Седатор)Dechra573749.2
Покровные стекла для микроскопаMenel-Glä ser15747592
Предметные стекла для микроскопаLabboxSLIB-F10-050
Монтажная средаЭлектронная микроскопияSciences 17984-25
Пластины Mutiwell (24)SPL Life Sciences32024
Пластины Mutiwell (48)SPL Life Sciences32048
NaCl (для физиологического раствора)Fisher Scientific10112640
Игла 25 г (BD Microlance 3)Becton, Dickinson and Company300600
Орбитальный инкубатор S150Stuart Scientific5133
P Selecta ИнкубаторJ. P. Selecta, s.a.
ПараформальдегидPanReac AppliedChemA3813
Пенициллин-стрептомицинSigma-AldrichP4333
Перистальтический перфузионный насосCole-ParmerEW-07522-30
Платиновый пинцетрод, 5 мм ДиаметрBtx45-0489
Рефлекторная система закрытия кожи - 7 мм Зажимы, коробка из 100AgnThos203-1000
Рефлекторная система закрытия кожи - зажим для нанесения, 7 ммAgnThos204-1000
Кольцевые щипцыFine Science Tools (FST)11103-09
Азид натрияPanReac AppliedChem122712-1608
Хирургическая абсорбирующая прокладка (стерил)HK SurgicalPD-M
Шовный материал (Surgicryl PGA 6-0)SMI Материалы для шовных материалов
Шприц 1 мл (BD plastipak)Becton, Dickinson and Company303172
Чашка для культуры тканей 100 x 20 ммFalcon353003
Вертикальный пуллер для микропипетокSutter Instrument CoP-30
Вертикальный микроскопNikonEclipse Ni
VibratomeLeicaVT1200S
9214250485472BYD11071512

Ссылки

  1. Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102(2017).
  2. Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
  7. Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
  8. Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
  9. Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
  10. Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
  11. Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
  12. Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
  13. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
  14. Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
  15. Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).
  16. Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139(2017).
  17. Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
  18. Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
  19. Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
  20. Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
  21. Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
  22. Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
  23. Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
  24. Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
  25. Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
  26. Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
  27. Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36(2017).
  28. DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29(2011).
  29. Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Двойная электропорациянейральные стволовые клеткиисследование кортикогенезамиграция нейроновпрослеживание линий клетокпоиск пути аксонамиинъекция в эмбриональный мозгэлектропорационные электродымечение флуоресцентными белками
Двойной в утробе электропорации для целевой временно и пространственно отделенных популяций клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.