Быстрое, бесшовное поколение рекомбинантных поксвирусов с использованием диапазона хоста и визуального отбора

Sameera Vipat; Greg Brennan; Chorong Park; Sherry  L. Haller; Stefan Rothenburg

doi:10.3791/61049

Method Article

Быстрое, бесшовное поколение рекомбинантных поксвирусов с использованием диапазона хоста и визуального отбора

DOI:

10.3791/61049

⸱

May 24th, 2020

Sameera Vipat*¹ , Greg Brennan*¹ , Chorong Park¹ , Sherry L. Haller² , Stefan Rothenburg¹

¹Department of Medial Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of California Davis, ²Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch at Galveston

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это метод для создания "безшрамов" рекомбинантных вирусов vaccinia с использованием выбора хоста и визуальной идентификации рекомбинантных вирусов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус Вакцинии (VACV) сыграл важную роль в искоренении вируса вариолы (VARV), возбудителя оспы, от природы. С момента своего первого использования в качестве вакцины, VACV был разработан в качестве переносчика терапевтических вакцин и в качестве онколитического вируса. Эти приложения используют легко управляемый геном VACV и широкий диапазон хост в качестве выдающейся платформы для создания рекомбинантных вирусов с различными терапевтическими приложениями. Для создания рекомбинантного VACV было разработано несколько методов, включая методы выбора маркеров и переходный доминирующий выбор. Здесь мы представляем уточнение метода выбора диапазона хоста в сочетании с визуальной идентификацией рекомбинантных вирусов. Наш метод использует селективное давление, генерируемое принимающей противовирусной протеиной киназы R (PKR) в сочетании с флуоресцентным геном синтеза, выражающим mCherry-tagged E3L, один из двух антагонистов VACV PKR. Кассета, включая интересуемый ген и слияние mCherry-E3L, окружена последовательностями, полученными из генома VACV. Между геном интереса и mCherry-E3L находится меньшая область, идентичная первым нуклеотидам 3' руки, чтобы способствовать гомологионной рекомбинации и потере гена mCherry-E3L после отбора. Мы демонстрируем, что этот метод позволяет эффективное, бесшовное генерации rVACV в различных типах клеток, не требуя отбора лекарств или тщательного скрининга на вирусы-мутанты.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус Ваккиния (VACV) сыграл важную роль в первом успешном искоренении патогена человека, вируса вариолы (VARV), от природы. С момента уничтожения вируса вариолы, поксвирусы, включая VACV, продолжают быть полезными терапевтическими вирусами как для медицины человека, так и для животных. Например, вакцина против бешенства на основе VACV была очень эффективной в предотвращении передачи сильватического бешенства в Европе¹ и Соединенных Штатах^2. Совсем недавно, рекомбинантные поксвирусы, выражающие различные противоопухолевые молекулы (например, одноцепные антитела или человеческий эритропоэтин) видели обнадеживающий успех, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Создание вектор рекомбинации

Дизайн грунтовки для создания выбора кассеты. Дизайн каждого отдельного амплекона с перекрывающимися последовательностями с соседними амплеонами и вектором для облегчения изетермальной ферментативной сборки молекул ДНК, также называемой гибсон сборки, используя любой из нескольких онлайн грунтовые инструменты дизайна.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол также может быть завершен с использованием традиционных методов клонирования на основе ограничения. В этом случае проектные праймеры с соответствующими местами ограничения, а не с перекрывающимися последовательностями.
Используя грунтовки, разработанные в шаге 1.1, ПЦР усили....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы использовали процедуру диаграммы на рисунке 1 для создания VACV не хватает как PKR антагонистов E3L и K3L, заменив E3L с EGFP в вирус, уже удалены для K3L (vP872). На рисунке 2 показаны красные флуоресцентные бляшки в компетентных клетках PKR RK13, свидетельствующая о вирусной экспрессии mCherry-E3L, а также EGFP, выраженной в клетках RK13-E3L-K3L, подтверждающих потерю E3L и коллапс маркера отбора mCherry-E3L. Рисунок 3 подтверж.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем вариации переходного маркера стратегии выбора ³² для создания рекомбинантных вирусов vaccinia без сохранения чужеродных ДНК в окончательном рекомбинантный вирус. Наша стратегия использует селективное давление при посредничестве принимающей противовирусный белок PKR, а не другие формы селективного давления, такие как антибиотики. Использование противовирусных генов хозяина исключает возможность химически индуцированных фенотипических изменений в клетках или повышенного риска м.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот проект был профинансирован Национальными институтами здравоохранения (AI114851) в СР.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
2X-Q5 Master Mix	NEB	M0492L	Высокоточная полимераза, используемая в ПЦР
Ампициллин	ThermoFisher Scientific	11593027	Бактериальный селективный агент
Одноразовые скребки для клеток	ThermoFisher Scientific	08-100-242	Скребок для сбора инфицированных клеток
EVOS FL Auto 2 Система визуализации клеток	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	Флуоресцентный микроскоп
EVOS Light Cube, GFP	ThermoFisher	AMEP4651	GFP Cube
EVOS Light Cube, RFP	ThermoFisher	AMEP4652	RFP Cube
GenJet	SignaGen Laboratories	SL100489	Реагент для трансфекции
Luria Bertani (LB) Бульон	Gibco	10855021	Бактериальная среда для роста
Monarch DNA набор	для экстракции геляNEB	T1020L	Набор для очистки гелем для очистки ампликонов и линеаризованных векторов
Monarch Plasmid Miniprep kit	NEB	T1010L	Miniprep kit, используемый для очистки плазмид
NanoDrop One	ThermoFisher Scientific	ND-ONE-W	Спектрофотометр для измерения концентрации РНК и ДНК
NEBuilder Master Mix	NEB	E2621L	Изотермический ферментативный сборочный набор для генерации рекомбинационного вектора
Q500 Sonicator	Qsonica	Q500-110	Соник для лизатов вируса
RK13 Клетки	ATCC	CCL-37	Клетки почек
кролика VWR Multiwell Cell Culture планшеты	VWR	10062-892	Клеточные культуральные планшеты

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brochier, B., et al. Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine. Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).
Pastoret, P. P., Brochier, B. The development and ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Быстрое, бесшовное поколение рекомбинантных поксвирусов с использованием диапазона хоста и визуального отбора

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles