Здесь представлен протокол анализа химиотерапии на месте, недавно разработанного микрофлюидного устройства, позволяющего проводить исследования микробного поведения непосредственно в окружающей среде.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В Situ Chemotaxis анализ для изучения микробного поведения в водных экосистемах
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Микробное поведение, такое как подвижность и хемотаксис (способность клетки изменять свое движение в ответ на химический градиент), широко распространены в бактериальных и археологических областях. Хемотаксис может привести к значительным преимуществам приобретения ресурсов в неоднородных средах. Он также играет решающую роль в симбиотических взаимодействиях, болезнях и глобальных процессах, таких как биогеохимическое велоспорт. Тем не менее, современные методы ограничивают исследования хемотаксиса в лаборатории и не легко применимы в этой области. Здесь представлен пошаговая протокола для развертывания на месте химиотаксиса (ISCA), устройства, которое позволяет проводить надежные допросы микробных хемотаксисов непосредственно в естественной среде. ISCA представляет собой микрофлюидное устройство, состоящее из массива из 20 колодец, в котором могут быть загружены химические вещества, представляющие интерес. После развертывания в aqueous средах, химические вещества рассеиваются из скважин, создавая концентрационные градиенты, что микробы смысле и реагировать на плавание в скважины через хемотаксис. Содержимое хорошо может быть отобрано и использовано для (1) количественной силы хемотаксических реакций на конкретные соединения через цитометрию потока, (2) изолят и культуру отзывчивых микроорганизмов, и (3) характеризуют идентичность и геномный потенциал ответивших популяций с помощью молекулярных методов. ISCA является гибкой платформой, которая может быть развернута в любой системе с водной фазой, включая морскую, пресноводную и почву.
Введение
Разнообразные микроорганизмы используют подвижность и хемотаксис для использования неоднородных питательных сред, найти хозяев или избежать вредныхусловий 1,,2,,3. Такое микробное поведение, в свою очередь, может влиять натемпы химической трансформации 4 и способствовать симбиотическим партнерствам между наземными, пресноводнымии морскими экосистемами 2,,5.
Хемотаксис был широко изучен в лабораторных условиях в течение последних 60 лет6. Первы....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Мы рекомендуем выполнять раздел 1 до полевых экспериментов для оптимизации результатов.
1. Лабораторная оптимизация
ПРИМЕЧАНИЕ: Объемов, описанных в процедуре оптимизации, достаточно для одной ISCA (состоящей из 20 скважин).
- Подготовка химического вещества, представляющих интерес
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная концентрация для каждого химиоаттраканта часто должна быть определена в лабораторных условиях до развертывания на местах. Химическое концентрационое поле будет уменьшаться в величине на расстоянии от источника (ISCA хорошо), что означает, что концентрация, переживаемая микроорганизмами в окружающей ср....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этом разделе представлены лабораторные результаты с использованием ISCA для проверки хемотаксической реакции морских микробов на диапазон концентрации глутамина, аминокислоты, известной для привлечения почвенныхбактерий 14. Концентрация глутамина, вызвавшая сильнейший химиотатический ответ в лабораторных испытаниях, была использована для проведения анализа хемотаксиса в морской среде.
Для проведения лабораторных испытаний сообщества морской воды, отобранные из прибреж.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В масштабе водных микроорганизмов окружающая среда далека от однородной и часто характеризуется физическими/химическими градиентами, которые структурироватьмикробные сообщества 1,15. Способность разношерстных микроорганизмов использовать поведение (т.е. хемотаксис) облегчает кормление в рамках этих неоднородных микроокнороний1. Изучение хемотаксиса непосредственно в окружающей среде имеет потенциал для выявления важных межвидовых взаимодей.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствие конфликта интересов.
Благодарности
Это исследование было частично профинансировано Гордон и Бетти Мур Фонд морской микробиологии инициативы, через грант GBMF3801 ДЛЯ JRS и Р.С., и следователь премии (GBMF3783) для Р.С., а также стипендию Австралийского исследовательского совета (DE160100636) J.B.R., награду от Фонда Саймонс до B.S.L. (594111) и грант Фонда Симонс (542395) Р.С. в рамках Принципов микробных экосистем (PriME) Сотрудничество.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Клей акриловый Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 | |
| Лист акриловый лист | McMaster-Carr | 8505K725 | Или другой фирмы |
| Скотч | Скотч | 3M 810 | Скотч Волшебная лента |
| Автоклав | Systec | D-200 | Или другой фирмы |
| Настольная центрифуга | Fisher Scientific | 75002451 | Или другой фирмы |
| Банджи-шнур | Паракорд Планета | 667569184000 | Или другой фирмы |
| Центрифужная трубка - 2 мл | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf Tube |
| Коническая центрифуга Коническая центрифуга Tube - 15 мл | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon Tube |
| Коническая центрифуга - 50 мл | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon Tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Или другая компания |
| Развертывание заглушки корпуса | Fisher Scientific | 21-236-4 | Смотрите альтернативы в рукописи |
| Одноразовые дворники | Kimtech - Fisher Scientific | 06-666 | Проточный цитометр Kimwipes |
| Beckman | C09756 | CYTOFlex | |
| Глутаральдегид 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Или другая компания |
| Зеленый флуоресцентный краситель | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I - 1:10,000 окончательное разбавление |
| Гидрофильный картридж фильтра GP - 0.2 &; m | Merck | C3235 | Sterivex фильтр |
| In Situ Chemotaxis Assay Assay (ISCA) | - | - | Свяжитесь с авторами-корреспондентами |
| Лазерный резак | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Или другая компания |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Или другая компания |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon шлицевые винты с плоской головкой | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 & 4 & раз; 8 мм |
| Набор пипеток | Fisher Scientific | 05-403-151 | Или других фирм |
| Наконечники для пипеток - 1 мл | Fisher Scientific | 21-236-2A | Или другие фирмы |
| Наконечники для пипеток - 20 & микро; L | Fisher Scientific | 21-236-4 | Или другой фирмы |
| Наконечники для пипеток - 200&мкм; L | Fisher Scientific | 21-236-1 | Или другая фирма |
| Морская соль | Sigma Aldrich | S9883 | Для искусственной морской воды |
| серологическая пипетка - 50 мл | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Или другая фирма |
| Шприц фильтр - 0.02&микро; m | Ватман | WHA68091002 | Анатоп фильтр |
| Шприцевой фильтр - 0,2 &; m | Fisher Scientific | 10695211 | Или другой фирмы |
| Игла для шприца 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0,4 &раз; 12 мм |
| Шприцы - 1 мл | Codau | 329650 | Инсулин Luer U-100 |
| Шприцы - 10 мл | BD | 303134 | Или другая фирма |
| Шприцы - 50 мл | BD | 15899152 | Или другая фирма |
| Тюбик штатив - 15 мл | Thomas Scientific | 1159V80 | Или другой фирмы |
| Штатив для труб - 50 мл | Thomas Scientific | 1159V80 | Или другого производителя |
| Непокрытый быстрорежущий сталь общего назначения Метчик | McMaster-Carr | 8305A77 | Или другой компании |
| Вакуумный фильтр - 0,2 & микро; m | Фильтр Merck | SCGPS05RE | Steritop |
Ссылки
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., A....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
