Открытие гена водителя в колоректальных HT29-производных рака стволовых как опухоли

Summary

Представленный здесь протокол, чтобы обнаружить переэкспрессированных генов водителя поддержания установленных раковых стволовых клеток, полученных из колоректальных клеток HT29. RNAseq с имеющейся биоинформатикой была выполнена для того чтобы исследовать и экранировать сети выражения гена для обуздывать потенциальный механизм, котор включили в выживание пристрелных тучные клетки.

Abstract

Раковые стволовые клетки играют жизненно важную роль против клинической терапии, способствуя рецидиву опухоли. Есть много онкогенов, участвующих в опухолевом мизахигене и инициировании свойств стволовой протежения рака. Поскольку экспрессия генов при формировании опухолевых опухолей, полученных из колоректального рака, неясна, требуется время, чтобы обнаружить механизмы, работающие на одном гене за раз. Это исследование демонстрирует метод, чтобы быстро обнаружить гены водителя, участвующих в выживании колоректального рака стволовых клеток в пробирке. Колоректальные раковые клетки HT29, которые выражают LGR5, когда культивируется как сфероиды и сопровождают увеличение CD133 маркеры стволовой стали были выбраны и использованы в этом исследовании. Представленный протокол используется для выполнения RNAseq с имеющейся биоинформатикой, чтобы быстро выявить переэкспрессированные гены драйвера при формировании колоректальных HT29-производных стволовых туморфер. Методология может быстро проверять и открывать потенциальные гены водителя в других моделях болезней.

Introduction

Колоректальный рак (CRC) является ведущей причиной смерти с высокой распространенностью и смертностью во всем мире^1,2. Благодаря генным мутациям и усилениям раковые клетки растут без пролиферативного контроля, что способствует выживанию клеток^3,антиапоптозу^4,а раковая стволовая прослудания^5,,6,7. В опухолевой ткани, неоднородность опухоли позволяет опухолевым клеткам адаптироваться и выжить во время терапевтического лечения^8. Раковые стволовые кле....

Protocol

1. Культура клеток и образование опухоли

1. Культура HT29 клеток в 10 см блюдо, содержащее Dulbecco модифицированных орлиных средств (DMEM) с 10% плода бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицин антибиотик (P/S).
2. Выращивайте клетки в инкубаторе при температуре 37 градусов по Цельсию с 5% CO₂ и 95% влажности в асептических условиях, пока они не достигнут 80% слияния.
3. Трипсинизировать клетки HT29 с 1 мЛ 0,25% трипсина в течение 5 мин при 37 градусов по Цельсию и, следовательно, нейтрализовать трипсин, добавив 2 мЛ DMEM с 10% FBS и 1% P/S.
4. Подсчитайте клетки HT29 с помощью гемоцитометра.
5. Добавить 2000 кле....

Results

Для создания модели для исследования механизма в раковых стволовых клетках, колоректальные клетки HT29 были использованы для культуры рака стволовых, как опухоли в пробирке в низкоприложении пластины, содержащей B27, EGF, bFGF, HGF, и IL6. Опухолевыесферы в диаметре 100 мкм образовались за 7 дней(рисунок 1A). Опухолевые области были трипсинизованы на одиночные клетки и проанализированы с помощью цитометрии потока для обнаружения экспрессии LGR5 и CD133. LGR5 увеличился в HT29-drived tumorsph.......

Discussion

В этом исследовании, культивируемые рака стволовых, как опухоли были использованы в качестве модели в анализе данных RNAseq с имеющимися биоинформатики. Для модели болезни были использованы опухолевые сферы HT29. Поскольку опухолевые области имеют лекарственную устойчивость к терапии опухолей, установленная модель может быть использована для исследования подробных механизмов резистентности, исследуя различия в экспрессии генов. Кроме того, геномная технология с использованием RNAseq с доступной биоинформатикой обеспечива.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
iRiS Digital Cell Imaging System	Logos Biosystems, Inc	I10999	для наблюдения за формированием опухолевых сфер
Проточная цитометрия	BD biosciences	FACSCalibur	для обнаружения LGR5 и CD133 в опухолевых сферах
Anti-LGR5-PE	Biolegend	373803	обнаружение LGR5 реагент
анти-CD133-PE	Biolegend	372803	детектирование CD133 реактив
EGF	GenScript	Z00333	для культивирования опухолевых сфер
bFGF	GenScript	Z03116	для культивирования опухолевых сфер
HGF	GenScript	Z03229	для культивирования опухолевых сфер
GenScript	Z03034	для культивирования опухолевых сфер
PureLink набор для экстракции РНК	Invitrogen	12183025	изолята анализ общей РНК для анализа
РНКseq РНКseq performance	Biotools, Тайвань		Анализ РНКseq проводится компанией Biotools, Ttaiwan
NetworkAnalyst	Institute of Parasitology, McGill University, Монреаль, Квебек, Канада		http://www.networkanalyst.ca/
Prism	GraphPad Software		программное обеспечение для статистического анализа