Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Открытие гена водителя в колоректальных HT29-производных рака стволовых как опухоли

6.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61077

⸱

22 июля 2020 г.

 ,  ,  , 
1Radiation Biology Research Center, Institute for Radiological Research, Chang Gung University, Chang Gung Memorial Hospital at Linkou, 2Department of Medical Imaging and Radiological Sciences, Chang Gung University, 3Department of Radiation Oncology, Chang Gung Memorial Hospital, 4Department of Laboratory Medicine, Mackay Memorial Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Представленный здесь протокол, чтобы обнаружить переэкспрессированных генов водителя поддержания установленных раковых стволовых клеток, полученных из колоректальных клеток HT29. RNAseq с имеющейся биоинформатикой была выполнена для того чтобы исследовать и экранировать сети выражения гена для обуздывать потенциальный механизм, котор включили в выживание пристрелных тучные клетки.

Аннотация

Раковые стволовые клетки играют жизненно важную роль против клинической терапии, способствуя рецидиву опухоли. Есть много онкогенов, участвующих в опухолевом мизахигене и инициировании свойств стволовой протежения рака. Поскольку экспрессия генов при формировании опухолевых опухолей, полученных из колоректального рака, неясна, требуется время, чтобы обнаружить механизмы, работающие на одном гене за раз. Это исследование демонстрирует метод, чтобы быстро обнаружить гены водителя, участвующих в выживании колоректального рака стволовых клеток в пробирке. Колоректальные раковые клетки HT29, которые выражают LGR5, когда культивируется как сфероиды и сопровождают увеличение CD133 маркеры стволовой стали были выбраны и использованы в этом исследовании. Представленный протокол используется для выполнения RNAseq с имеющейся биоинформатикой, чтобы быстро выявить переэкспрессированные гены драйвера при формировании колоректальных HT29-производных стволовых туморфер. Методология может быстро проверять и открывать потенциальные гены водителя в других моделях болезней.

Введение

Колоректальный рак (CRC) является ведущей причиной смерти с высокой распространенностью и смертностью во всем мире1,2. Благодаря генным мутациям и усилениям раковые клетки растут без пролиферативного контроля, что способствует выживанию клеток3,антиапоптозу4,а раковая стволовая прослудания5,,6,7. В опухолевой ткани, неоднородность опухоли позволяет опухолевым клеткам адаптироваться и выжить во время терапевтического лечения8. Раковые стволовые клетки (CSCs), с более высоким уровнем самообновления и плюрипотентности, чем дифференциальные типы рака, в основном ответственны за рецидив опухоли9,,10 и метастатический CRC11. CSCs представить больше лекарственной устойчивости12,13,14 и анти-апоптоза свойства15,16, таким образом, выживших опухолевых химиотерапий.

Здесь, для того, чтобы исследовать потенциальный механизм для стволовой протеченности в выбранных стволовых клетках CRC, RNAseq был выполнен для проверки дифференциально выраженных генов в опухолевых сфероидах. Раковые клетки могут образовывать сфероиды (также называемые опухолевымисферами) при выращивании в условиях низкой приверженности и стимулируемые факторами роста, добавленными в культивируемую среду, включая EGF, bFGF, HGF и IL6. Поэтому мы выбрали опухолевые клетки CRC HT29, которые сопротивляются химиотерапии с увеличением фосфорилированного STAT3 при лечении оксалиплатином и иринотеконом17. Кроме того, HT29 выразил более высокие маркеры стволовой связи при культуре в описанных условиях культуры. HT29-производные CSC модель выразила более высокое количество лейцин богатых повторносодержащих G-белков связанных рецепторов 5 (LGR5)18, конкретный маркер стволовых клеток CRC19,20. Кроме того, CD133, считается общим биомаркером для раковых стволовых клеток, также высоко выражен в HT29 клеточной линии21. Цель этого протокола состоит в том, чтобы обнаружить группы генов водителя в установленных стволовых опухолей, как рак на основе биоинформатики наборы данных, в отличие от исследования отдельных онкогенов22. Он исследует потенциальные молекулярные механизмы с помощью анализа RNAseq с последующим доступным биоинформатикой анализов.

Следующее поколение секвенирования является высокой пропускной способностью, легко доступны, и надежный метод секвенирования ДНК на основе вычислительной помощи, используется для всестороннего анализа генов водителя для руководящих опухоли терапии23. Технология также используется для обнаружения экспрессии генов при обратной транскрипции изолированного образца РНК24. Однако, при скрининге с RNAseq, наиболее важные гены для целевой с терапией не может иметь самый высокий дифференциал выражения между экспериментальными и контрольными образцами. Таким образом, некоторые биоинформатики были разработаны для классификации и идентификации генов на основе текущих наборов данных, таких как KEGG25, GO26,27, или PANTHER28, в том числе изобретательность Путь анализа (IPA)29 и NetworkAnalyst30. Этот протокол показывает интеграцию RNAseq и NetworkAnalyst быстро обнаружить группу генов в выбранных HT29 полученных сфероидов по сравнению с родительскими клетками HT29. Применение этого метода к другим моделям болезней также предлагается для выявления различий в важных генах.

По сравнению с исследованием индивидуального экспрессии генов, высокопроизводительная техника обеспечивает преимущества для легкого поиска потенциальных генов водителя для медицины точности опухоли. С помощью полезных наборов данных, таких как KEGG, GO или PANTHER, конкретные гены могут быть определены на основе моделей болезней, сигнальных путей или конкретных функций, что позволяет быстро сосредоточиться на конкретных, важных генах, экономя время и затраты на исследования. Аналогичное применение используется в предыдущих исследованиях14,,18,31. В частности, опухоль является более сложным, поскольку различные типы опухолей выражают отличительные гены и пути для выживания и распространения. Таким образом, этот протокол может подобрать гены, отличающие различные типы опухолей при различных обстоятельствах. Существует потенциал, чтобы найти эффективные стратегии борьбы с раком, понимая механизм конкретного экспрессии генов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Культура клеток и образование опухоли

  1. Культура HT29 клеток в 10 см блюдо, содержащее Dulbecco модифицированных орлиных средств (DMEM) с 10% плода бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицин антибиотик (P/S).
  2. Выращивайте клетки в инкубаторе при температуре 37 градусов по Цельсию с 5% CO2 и 95% влажности в асептических условиях, пока они не достигнут 80% слияния.
  3. Трипсинизировать клетки HT29 с 1 мЛ 0,25% трипсина в течение 5 мин при 37 градусов по Цельсию и, следовательно, нейтрализовать трипсин, добавив 2 мЛ DMEM с 10% FBS и 1% P/S.
  4. Подсчитайте клетки HT29 с помощью гемоцитометра.
  5. Добавить 2000 клеток / хорошо к низкой прилагается 6 пластин скважины с 2 mL сыворотки без DMEM с 1% P / S и дополнены 0,2% B27, 20 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), 20 нг/мл фактора роста фибробластов (bFGF), 20 нг/мл фактора роста гепатоцитов (HGF) и 20 нг/мл интерлейкина 6 (IL6).
  6. Выращивайте клетки при температуре 37 градусов с 5% CO2 и 95% влажности при асептических условиях.
  7. Добавьте 0,5 мл среды стволовых клеток рака каждые 2 дня, пока опухолевые смерхи не измерьте диаметром не менее 7 дней.
  8. Наблюдайте и измеряйте диаметр опухоли с помощью перевернутого микроскопа с цифровой системой визуализации клеток.
  9. Когда опухолевые области достигают йgt;100 мкм в диаметре, trypsinize tumorspheres с 0,25% трипсина в течение 5 мин при 37 градусов по Цельсию и нейтрализовать трипсина, добавив 2x объем среды роста. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
  10. Центрифуга при 1200 об/мин в течение 10 мин и удалить супернатант.
  11. Инкубировать 5 х 104 клетки с 2 мл анти-LGR5-PE и 2 МЛ анти-CD133-PE в 100 мл DMEM индивидуально в течение 30 мин при комнатной температуре, встряхивая при 200 об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: CD133 является общим биомаркером стволовых клеток рака, который высоко выражен в клетках HT29.
  12. Добавьте 900 мл PBS и проанализируйте выражение LGR5 и CD133 с помощью цитометрии потока. Изменение флуоресценции в канале FL2-H указывает на экспрессию генов.

2. ИЗОЛЯЦИя РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте коммерческий комплект (см. Таблицу материалов)с быстрой колонкой для изоляции РНК в соответствии с инструкциями производителя.

  1. Добавьте 50 МЛ PBS в собранные клетки (2 х 105 ячеек) и повторно переуславйте их с помощью пипетки.
  2. Добавьте 200 мл буфера лиза, содержащего 2 л бета-меркаптоэтанола (я).... Vortex быстро и дайте постоять 5 мин.
  3. Центрифуга раствор на 16000 х г в течение 10 мин. Соберите супернатант и смешайте с 200 л 70% этанола.
  4. Используйте прилагаемую колонку, чтобы удалить растворитель путем центробежия при 14000 х г в течение 1 мин.
  5. Вымойте с помощью раствора для мытья 1 и 2, чтобы полностью удалить не-РНК путем центробеживания на 14000 х г в течение 1 мин.
  6. Центрифуга снова на 14000 х г в течение 2 минут, чтобы удалить остаточный этанол.
  7. Добавьте 50 мл дистиллированной воды, центрифугу на 14 000 х г за 1 мин, и соберите раствор.
  8. Измерьте концентрацию РНК с помощью OD260 с помощью спектрофотометра.
    Концентрация РНК (мкг/мл) - (OD260) x (40 мкг РНК/мл) и OD260/OD280 Образцы РНК должны иметь номер целостности РНК (RIN)

3. анализ профилирования и биоинформатики RNAseq

ПРИМЕЧАНИЕ: анализ RNAseq был выполнен коммерчески (см. Таблицу материалов)для исследования дифференциальных генов в опухолевых сферах HT29 по сравнению с родительскими клетками HT29.

  1. Используйте коммерческие услуги для шагов RNAseq, включая строительство библиотек, контроль качества библиотек и секвенирование ДНК.
  2. Отчет о данных должен содержать важную информацию, включая считываемые подсчеты, изменение сворачивания журнала2 и значение p. Выберите дифференциальные гены в соответствии со следующими параметрами: гены с йgt; 1 log2 раз изменения с чтением рассчитывает на ХТ29 опухолевой группы, и гены хт-2 раз изменения с чтением кол-во в HT29 родительской группы. В этом случае было признано приемлемым значение p 0,05, и данные были использованы(Таблица 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, количество генов, чтобы обеспечить порог для продолжения изучения конкретного гена и проверки его экспрессии, использовалось количество генов.
  3. Используйте программное обеспечение для статистического анализа (см. Таблицу Материалов),чтобы показать тепловую карту и определить переэкспрессированные гены и внизу гены йтт; 1 в журнале2 раз изменения.
  4. Используйте программное обеспечение R, чтобы нарисовать Участок вулкана с x: изменение сворачивания log2; y: -log10 (p значение), чтобы показать дифференциальные гены.
    1. Установка R библиотеки
      install.packages (библиотека (калибровка))
    2. Читайте данные в RStudio со следующей программой:
      res s lt;-read.csv ("/Пользователи/xxx.csv", заголовок
      головка (res)
      с (res, участок (log2FoldChange, -log10 (pvalue), pch-19, main "HT29CSC против HT29", xlim'c (-6,6), col'"#C0C0C0"))
      с (подмножество (res, pvalue-lt;.05 и log2FoldChange-gt;1), баллы (log2FoldChange, -log10 (pvalue), pch'19, col'"red"))
      с (подмножество (res, pvalue-lt;.05 и log2FoldChange-lt;(-1)), баллы (log2FoldChange, -log10 (pvalue), pch-19, col'"blue"))
      с (подмножество (res, pvalue'gt;.05), точками (log2FoldChange, -log10 (pvalue), pch'19, col'"#444444"))
      аблайн (h'1.3, lty'2)
      аблайн (v'1, lty'2)
      аблайн (v'(-1), lty'2)
    3. Выполните пробег, чтобы получить участок вулкана.

4. Выбор генов водителя

  1. Выберите единый ген ввода в NetworkAnalyst.
  2. Копировать и вставлять выбранные переэкспрессированные гены из таблицы 1 с "человеком", указанным как организм и идентификационный тип Официальный символ гена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, используйте Ensembl Gene ID для копирования и вставки.
  3. Вставьте данные, нажав загрузить и приступить к их анализу с помощью белка белка белка взаимодействия (PPI) после генетического ИЦП.
  4. Используйте базу данных STRING interactome с вырезом доверия в 900 баллов, чтобы показать, что гены семян пересекаются с загруженными генами. Гены семян, связывающиеся с более индивидуальными генами, были выбраны в качестве генов драйвера, которые могут быть вовлечены в поддержание формирования опухолевых свес HT29.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Есть три набора данных взаимодействух для использования: IMEx, STRING и Rolland. STRING содержит более высокие доказательства достоверности. С более низкими загруженными номерами генов, IMEx может быть выбран для прогнозирования и подобрать гены драйвера в сетях взаимодействующих.
  5. Выберите Proceed в обзоре отображения.
  6. Выберите белый в фоновом режиме и атлас силы в ручке Layout.
  7. Выберите PANTHER BP для анализа группы генов upregulation.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это показывает, что HSPA5 несет ответственность за анти-апоптоз в HT29 полученных опухолевыхspheres в этом исследовании (Рисунок 3A). Чтобы сузить специфическую функциональную область, классификация KEGG, GO или PANTHER может быть использована в качестве альтернативы для выбора конкретных генов драйвера.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для создания модели для исследования механизма в раковых стволовых клетках, колоректальные клетки HT29 были использованы для культуры рака стволовых, как опухоли в пробирке в низкоприложении пластины, содержащей B27, EGF, bFGF, HGF, и IL6. Опухолевыесферы в диаметре 100 мкм образовались за 7 дней(рисунок 1A). Опухолевые области были трипсинизованы на одиночные клетки и проанализированы с помощью цитометрии потока для обнаружения экспрессии LGR5 и CD133. LGR5 увеличился в HT29-drived tumorsph...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании, культивируемые рака стволовых, как опухоли были использованы в качестве модели в анализе данных RNAseq с имеющимися биоинформатики. Для модели болезни были использованы опухолевые сферы HT29. Поскольку опухолевые области имеют лекарственную устойчивость к терапии опухолей, установленная модель может быть использована для исследования подробных механизмов резистентности, исследуя различия в экспрессии генов. Кроме того, геномная технология с использованием RNAseq с доступной биоинформатикой обеспечива...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют соответствующих финансовых раскрытий.

Благодарности

Авторы благодарят базовую лабораторию радиационной биологии Института радиологических исследований Чанг Гуна за техническую поддержку. Это исследование было поддержано грантами от Чанг Гун Мемориал больницы (CMRPD1J0321), Чэн Синь больницы (CHGH 106-06), и Маккей Мемориальный госпиталь (MMH-CT-10605 и MMH-106-61). Финансируемые органы не имели никакого влияния на разработку исследования и сбора данных, анализа и интерпретации данных или на написание рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
iRiS Digital Cell Imaging SystemLogos Biosystems, IncI10999для наблюдения за формированием опухолевых сфер
Проточная цитометрияBD biosciencesFACSCaliburдля обнаружения LGR5 и CD133 в опухолевых сферах
Anti-LGR5-PEBiolegend373803обнаружение LGR5 реагент
анти-CD133-PEBiolegend372803детектирование CD133 реактив
EGFGenScriptZ00333для культивирования опухолевых сфер
bFGFGenScriptZ03116для культивирования опухолевых сфер
HGFGenScriptZ03229для культивирования опухолевых сфер
GenScriptZ03034для культивирования опухолевых сфер
PureLink набор для экстракции РНКInvitrogen12183025изолята анализ общей РНК для анализа
РНКseq РНКseq performanceBiotools, ТайваньАнализ РНКseq проводится компанией Biotools, Ttaiwan
NetworkAnalystInstitute of Parasitology, McGill University, Монреаль, Квебек, Канадаhttp://www.networkanalyst.ca/
PrismGraphPad Softwareпрограммное обеспечение для статистического анализа

Ссылки

  1. Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).
  2. Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia. Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).
  3. Liu, Q., et al. Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved. Cell Death & Disease. 10 (7), 509(2019).
  4. Slattery, M. L., et al. Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients. Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).
  5. Arteaga, C. L., Engelman, J. A. ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).
  6. Yarden, Y., Pines, G. The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).
  7. Cheng, C. C., et al. YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells. PLoS One. 12 (8), 0182149(2017).
  8. Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective. Molecular Cancer. 16 (1), 41(2017).
  9. Zhao, Y., et al. CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).
  10. Choi, J. E., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance. Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).
  11. Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation. Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).
  12. Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).
  13. Dallas, N. A., et al. Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition. Cancer Research. 69 (5), 1951-1957 (2009).
  14. Chang, Y. F., et al. STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers. BMC Cancer. 19 (1), 959(2019).
  15. Catalano, V., et al. Colorectal cancer stem cells and cell death. Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).
  16. Piggott, L., et al. Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL. Breast Cancer Research. 13 (5), 88(2011).
  17. Chung, S. Y., et al. Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells. Cell Death Discovery. 4, 25(2018).
  18. Cheng, C. C., et al. STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60(2018).
  19. Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).
  20. Medema, J. P. Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell. New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).
  21. Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells. PLoS One. 9 (4), 94621(2014).
  22. Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data. Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).
  23. Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome Medicine. 7 (1), 80(2015).
  24. Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).
  25. Kanehisa, M., Sato, Y. KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences. Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).
  26. Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), (2000).
  27. The Gene Ontology Collective. The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong. Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).
  28. Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 377-386 (2013).
  29. Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).
  30. Zhou, G., et al. NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis. Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).
  31. Cheng, C. C., et al. Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers. Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).
  32. Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Стволовые клетки колоректального ракатуморосферы HT29анализ RNA-Seqпроточная цитометриямаркеры LGR5 и CD133поиск драйверных геновбиоинформатический скринингбелок-белковое взаимодействиевалидация методом количественной ПЦРформирование туморосфер
Открытие гена водителя в колоректальных HT29-производных рака стволовых как опухоли
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.