Методическая статья

Анализ на основе флюса для идентификации модуляторов аутофагии при остеоартрозе

DOI:

10.3791/61078

⸱

8 июля 2020 г.

 ,  ,  ,  , 
1Grupo de Biología del Cartílago, Servicio de Reumatología, Instituto de Investigación Biomédica de A Coruña (INIBIC), Complejo Hospitalario Universitario de A Coruña, 2Biofarma Research Group, Center for Research in Molecular Medicine and Chronic Diseases (CIMUS), Universidad de Santiago de Compostela

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье подробно описывается мониторинг потока аутофагии для идентификации новых молекул с помощью клеточного визуализирующего скрининга.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аутофагия является центральным механизмом регуляции гомеостаза. Изменения аутофагии способствуют развитию заболеваний, связанных со старением. Фенотипические методы идентификации регуляторов аутофагии могут быть использованы для идентификации новых терапевтических средств. В данной статье описывается процесс скрининга на основе клеточной визуализации, разработанный для мониторинга аутофагического потока с использованием LC3 в качестве репортера аутофагического потока (mCherry-EGFP-LC3B) в хондроцитах человека. Сбор данных осуществляется с помощью автоматизированного микроскопа High Content Imaging Screening System. Был разработан и проверен протокол автоматизированного анализа изображений на основе алгоритма для идентификации молекул, активирующих аутофагический поток. Сообщается о критических шагах, пояснительных записках и улучшениях по сравнению с текущими протоколами мониторинга аутофагии. Физиологически значимые фенотипические подходы к скринингу целевых признаков старения могут способствовать более эффективным стратегиям разработки лекарств для возрастных заболеваний опорно-двигательного аппарата.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многие хронические заболевания связаны с признаками старения, в том числе дефектная аутофагия1. Остеоартрит (ОА) является наиболее распространенным заболеванием суставов и оказывает значительное влияние на ограничение повседневной деятельности у стареющего населения, но ни профилактические меры, ни модифицирующие болезнь методы лечения пока не доступны2.

Старение суставов и ОА связаны с признаками, определяющими прогрессирование дегенерации хряща, включая дефектную аутофагию и старение 3,4. Нацеливание на аутофагию в костно-мышечных тканях может помочь найти терапевтические инновации для ревматологических заболеваний 5,6. Фармакологическая модуляция аутофагии является многообещающим, актуальным механизмом для вмешательства в доклинические модели заболевания7. При ОА активация аутофагии использовалась для предотвращения дисфункции суставов8. Методы мониторинга аутофагии, основанные на надежных, воспроизводимых протоколах, позволяющих проводить количественный анализ, могут быть использованы для выявления новых агентов и облегчения фармакологического нацеливания на признаки старения, связанные с заболеванием.

Поток аутофагии отражает активность деградации и является важным измерением для идентификации новых молекул, активирующих аутофагию9. В данном исследовании описывается метод, разработанный для определения аутофагического потока путем измерения активности аутофагической деградации с использованием репортерной клеточной линии аутофагии в хондроцитах человека (TC28a2). Транзиторная экспрессия mCherry-EGFP-LC3- позволяет осуществлять одновременный мониторинг процессов формирования и деградации автолизосом путем количественной оценки различий в чувствительности pH между сигналами GFP и mCherry LC3 в лизосомах живых клеток10.

Адаптация данного метода проточной цитометрии к системе мониторинга стабильной экспрессии в живых хондроцитах может позволить идентифицировать молекулы, активирующие аутофагический поток, в контексте биологии хряща.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Генерация репортерной клеточной линии аутофагии иммортализованных хондроцитов человека

Примечание: Генерация репортерной клеточной линии аутофагии путем стабильной трансфекции pBABE-mCherry-GFP-LC3 путем установления количественного считывания проточной цитометрии была описана ранее11. При ретровирусной трансфекции использовали две клеточные линии: HEK 293-T17 в процессе котрансфекции и T/C28a2 на стадии инфекции.

  1. Процесс котрансфекции
    1. Подготовьте питательную среду для клеток HEK 293-T17: 500 мл минимальной эссенциальной среды Eagle's (EMEM), 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина (P/S). Храните питательную среду при температуре 4 °C и нагревайте до 37 °C перед каждым использованием.
    2. Высадите 1 x 106 HEK 293-T17 клеток в лунку в 100 мм клеточные культуральные планшеты, инкубируйте при 37 °C и 5%CO2 и убедитесь, что они находятся при ~75% слиянии перед началом процесса котрансфекции.
    3. Удалите питательную среду, промойте сбалансированным раствором соли Хэнка (HBSS) и добавьте 8 мл EMEM с 2% FBS и 1% P/S.
    4. В коническую пробирку добавьте 10 мкг, 3 мкг и 7 мкг pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B, VSV. G, и pCL-Eco плазмиды соответственно. Затем добавьте 200 мкл 1x восстановленной сыворотки (Таблица материалов). Добавьте реагент для трансфекции (Таблица материалов) в виде нелипосомальной смеси липидов в соотношении 1:3 (1 г ДНК : 3 г реагента для трансфекции; конечный объем = 60 мкл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всего 20 г смеси готовят для каждой 10-сантиметровой клеточной пластины, подлежащей трансфекции.
    5. Выдержать смесь в течение 20 минут при комнатной температуре. Осторожно переложите трансфекционную смесь по каплям в упаковочные ячейки HEK 293-T17. Инкубируйте клетки при 37 °C и 5%CO2 не менее 48 ч перед проверкой экспрессии зеленого и красного белка с помощью флуоресцентной микроскопии.
      Примечание: При этих условиях более 75% клеток должны быть положительными на флуоресценцию. Убедитесь, что эффективность трансфекции высока (например, более 75% клеток положительные). Используйте высококачественную плазмидную ДНК (например, преимущественно суперспиральную и свободную от геномной ДНК, РНК и белка; высококонцентрированную; не содержащую эндотоксинов и солей), а также высококачественные клеточные культуры (например, гомогенные, с низким пассажем, монослойные, трансфицированные в фазе экспоненциального роста, без микоплазм).
  2. В тот же день котрансфекции подготавливают хондроциты T/C28a2.
    1. Приготовьте питательную среду для клеток T/C28a2: 500 мл модифицированной среды Eagle (DMEM) от Dulbecco, 10% сыворотку эмбриональных телят (FCS) и 1% P/S. Храните питательную среду при температуре 4 °C и нагревайте до 37 °C перед каждым использованием.
    2. Посеять 2 x 10 хондроцитовпо 5 T/C28a2 в два 6-луночных мультипланшета и инкубировать в течение 48 ч при 37 °C и 5%CO2.
  3. Процесс ретровирусной инфекции
    1. Аспиратная питательная среда из ретровирусных упаковочных клеток HEK 293-T17, полученных на этапе 1.1.5. Промойте 1x 4 мл HBSS и аспирируйте HBSS.
    2. Добавьте 2 мл трипсина и подождите 2 минуты при 37 °C. Нейтрализуйте трипсин путем добавления 6 мл питательной среды HEK 293-T17 и переведите клетки и среду в конические пробирки объемом 15 мл.
    3. Центрифугируйте ячейки при давлении 400 x g в течение 5 мин. Переведите надосадочную жидкость в стерильный фильтр через мембрану 0,45 мкм.
    4. Аспирируйте питательную среду для хондроцитов T/C28a2 из 6-луночных мультипланшетов. Инфицируйте клетки T/C28a2 путем добавления 2 мл вирусной суспензии (шаг 1.3.3) на лунку в 6 луночных мультипланшетов. Используйте одну лунку для контроля (т.е. для нетрансфицированных клеток), добавив 2 мл питательной среды T/C28a2 вместо вирусной суспензии.
    5. Инкубировать в течение 48 ч при 37 °C и 5%CO2.
  4. Чтобы выполнить процесс селекции, используйте отбор антибиотиков на трансфицированных клетках для элиминации нетрансфицированных клеток и получения однородной клеточной популяции.
    Ретровирусный вектор pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B обеспечивает устойчивость млекопитающих к пуромицину к антибиотикам, что позволяет выбрать стабильную клеточную культуру после вирусной трансфекции. Кривые уничтожения для оптимальной концентрации пуромицина в хондроцитах T/C28a2 должны быть заранее составлены для создания соответствующих условий для отбора клеточных клонов, несущих трансген с высоким уровнем экспрессии.
    1. Готовят среду для роста стабильной клеточной линии T/C28a2-pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B: 500 мл DMEM, 10% FCS, 1% P/S и 2,5 μл/мл пуромицина. Хранить в среде при температуре 4 °C и нагревать до 37 °C перед каждым использованием.
    2. Смените носитель. Для каждой 6 лунок мультипланшета, аспирируйте питательную среду, промойте 1x 2 мл HBSS и отаскайте ее. Добавьте 2 мл среды и инкубируйте при 37 °C и 5%CO2. Это начало процесса выбора.
    3. Заменяйте среду каждые 2 дня и наблюдайте за мертвыми клетками и популяциями клеток, устойчивых к пуромицину. Сравните результаты с нетрансфицированными контрольными клетками, которые не устойчивы к пуромицину и погибают.
  5. Чтобы начать клональный отбор, убедитесь, что моноклональные популяции выросли. Для каждой 6 лунок мультитарелки:
    1. Добавьте 200 мкл среды на лунку в 96-луночный мультипланшет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая отдельная ячейка, выбранная из 6-луночного мультипланшета, будет покрыта в отдельных лунках 96-луночного мультипланшета.
    2. Используйте микроскоп для идентификации каждой моноклональной популяции в 6-луночных мультипланшетах. Можно наблюдать колонии, образованные из одиночных клеток.
    3. Отсадите питательную среду из 6 лунок с мультипланшетами, промойте 1x 2 мл HBSS и отасканируйте HBSS.
    4. Добавьте 10 мкл трипсина в каждую моноклональную популяцию, чтобы перевести одиночные клетки в каждую лунку из 96 луночных мультипланшетов. Инкубировать в течение 48 ч при 37 °C и 5%CO2.
  6. Через 48 ч замените среду 100 мкл свежей среды на лунку. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока не образуются колонии за счет разрастания одиночных клеток.
  7. После того как одна клетка хорошо расширится, поместите каждую моноклональную популяцию в отдельные лунки из 24-луночных, 6-луночных и 100-миллиметровых клеточных культуральных планшетов.
  8. Создание стабильной моноклональной клеточной линии с использованием метода сортировки одиночных клеток.
    1. Аспиратная питательная среда из 100 мм клеточных культуральных планшетов. Промойте 1 раз 8 мл HBSS и аспирируйте его.
    2. Добавьте по 2 мл трипсина на каждую тарелку и инкубируйте в течение 2 минут при 37 °C. Нейтрализуйте трипсин, добавив 8 мл питательной среды.
    3. Центрифугируйте ячейки при давлении 252 x g в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте 4 мл HBSS в каждую клеточную гранулу, осторожно ресуспендируйте ее и перенесите в цитометрические пробирки.
    4. Введите каждый образец клетки в проточный цитометр (Table of Materials) с технологией сортировки клеток и разделите клетки с высокой зеленой и красной флуоресценцией.
    5. Переведите выбранные ячейки в конические пробирки объемом 15 мл и центрифужные ячейки при давлении 252 x g в течение 5 минут. Добавьте клеточную гранулу в колбу Т-25 с 9 мл стабильной питательной среды клеточной линии. Инкубировать при 37 °C и 5%CO2.
      Примечание: После сортировки клеток следует получить три моноклональные популяции (Таблица 1).
  9. Через 24 часа удалите среду и добавьте 8 мл свежей среды. Повторяйте эту процедуру каждые 2 дня до тех пор, пока клетки не достигнут слияния.
    Примечание: Для изучения аутофагического потока можно использовать два контроля: рапамицин в качестве эталона сигнала с высоким аутофагическим потоком и хлорохин в качестве эталона сигнала с низким аутофагическим потоком. Готовьте 10 мМ стоковый раствор рапамицина в диметилсульфоксиде (ДМСО) и 30 мМ стоковый раствор хлорохина вН2Ои храните при -20 °С. Для выбора наилучшей моноклональной популяции путем тестирования экспрессии mCherry и GFP можно использовать два метода: проточную цитометрию (шаг 1.10) или анализ флуоресцентных изображений с высоким содержанием (шаг 1.11).
  10. Проточная цитометрия
    1. Затравите 2,5 х 10по 5 клеток в лунку каждой моноклональной популяции в 12-луночных планшетах не менее чем за 24 ч до обработки в 1 мл стабильной питательной среды для клеточной линии и инкубируйте при 37°С и 5%СО2.
    2. В день обработки удалите среду, добавьте 1 мл стабильной питательной среды клеточной линии с добавлением 2% FCS на лунку. Добавьте 10 мкМ рапамицина и 30 мкМ хлорохина в стабильную среду для роста клеточной линии с 2% FCS и инкубируйте в течение 16 ч при 37 °C и 5%CO2.
    3. Удалите среду, промойте 1 мл HBSS на лунку и отсадите ее.
    4. Добавьте по 500 мкл трипсина в каждую лунку, инкубируйте 1 мин при 37 °C и нейтрализуйте реакцию, добавив 500 мкл питательной среды. Соскребите клетки и перенесите их в конические трубки.
    5. Центрифугируйте клетки при давлении 252 x g в течение 5 минут и отсасывайте надосадочную жидкость. Промойте гранулы клеток 500 μл фосфатно-солевого буфера (PBS). Центрифугируйте при 252 x g в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
    6. Добавьте 500 μL PBS, переведите клетки в цитометрические пробирки и введите каждый образец в цитометрическое оборудование. Для каждого условия соберите 10 000 событий.
    7. Чтобы выбрать моноклональную популяцию с помощью проточной цитометрии, используйте лазер с длиной волны 488 нм для возбуждения EGFP и лазер с длиной волны 633 нм для mCherry. Затем установите соотношение флуоресценции mCherry и EGFP для отбора популяции клеток с высоким и низким потоком аутофагии.
  11. Анализ флуоресцентных изображений с высоким содержанием
    1. Затравите 4 x 10по 3 клетки каждой моноклональной популяции на лунку в 384 луночных планшетах (черная стенка/прозрачное дно) в питательной среде с добавлением 10% FCS, 1% P/S и 2,5 μL/мл пуромицина. Инкубировать при 37 °C и 5%CO2 в течение 24 ч до лечения.
    2. Удалите среду и добавьте 10 μМ рапамицина и 30 μМ хлорохина в 50 μЛ стабильной питательной среды клеточной линии с добавлением 2% FCS на лунку. Инкубировать в течение 16 ч при 37 °C и 5%CO2.
    3. Удалите среду, промойте 50 мкл HBSS на лунку и отсадите ее. Зафиксируйте клетки с 4% параформальдегидом (PFA) на 10 минут при 37 °C. Удалите PFA и промойте 50 мкл HBSS на лунку.
    4. Для идентификации ядра клеток окрашивают препаратом Hoechst 33342 (2,5 мкг/мл) в течение 10 мин при 37 °C. Аспират Hoechst 33342 красителем, промойте 50 μL HBSS на лунку и добавьте 50 μL PBS на лунку.
    5. Выполнение сбора данных и анализа аутофагического потока, полученного с помощью платформы HTS, как описано в разделе 3.
      Критерии отбора моноклональной популяции основаны на том, увеличивается или уменьшается поток аутофагии при приеме рапамицина или хлорохина, соответственно (Таблица 1). Клоны с высокими уровнями экспрессии mCherry и GFP более пригодны для точного анализа флуоресцентных изображений с высоким содержанием количественного определения потока аутофагии.

2. Анализ аутофагического потока на основе изображений в живых хондроцитах

ПРИМЕЧАНИЕ: После выбора клона начните анализ для количественной оценки аутофагического потока.

  1. С помощью портативной электронной 384-канальной пипетки затравить 4 x 103 клетки выбранного клона (шаг 1.11) в лунку 384 луночных планшета (черная стенка/прозрачное дно) в 50 мкл стабильной среды для роста клеточной линии с добавлением 10% FCS, 1% P/S и 2,5 μL/мл пуромицина на лунку. Инкубировать при 37 °C и 5%CO2 в течение 24 ч до лечения.
  2. В день проведения эксперимента подготовьте интервальную пластину для добавления соединения.
    1. Добавьте объем каждого соединения/контрольной группы и стабильную среду для роста клеточной линии в интервальный планшет с помощью технологии акустической обработки жидкости и электронной 384-канальной пипетки соответственно, чтобы получить интервальную концентрацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольная группа в этом анализе включала стабильную питательную среду для клеточной линии с добавлением 2% FCS, 30 мкМ хлорохина и 10 мкМ рапамицина. Интервальные концентрации будут зависеть от желаемой конечной концентрации. Например, в этом анализе хлорохин и рапамицин добавляли в 50 мкл стабильной питательной среды клеточной линии на лунку для получения интервальной концентрации 300 мкМ и 100 мкМ соответственно.
    2. Используя робота-промывщика микропланшетов, автоматически отсаживайте среду из клеточной пластины и добавляйте 45 мкл стабильной среды для роста клеточной линии с добавлением 2% FCS на лунку.
    3. Затем перенесите 5 мкл на лунку с интервального планшета на пробирную пластину для получения окончательной концентрации с помощью другой автоматизированной рабочей станции обработки жидкостей.
  3. Инкубировать при 37 °C и 5%CO2 в течение 16 часов. С помощью робота-мойщика микропластин аспирируйте среду.
  4. Зафиксируйте ячейки с 50 мкл 4% PFA в лунку в течение 10 мин при 37 °C. Промойте 50 мкл HBSS на лунку.
  5. Окрашивать ядра препаратом Hoechst 33342 (2,5 мкг/мл) в течение 10 мин при температуре 37 °C. Отсадите Hoechst 33342 и промойте 50 μL HBSS на лунку.
  6. Добавьте 50 μL PBS на лунку. Теперь пластина готова к чтению, сбору данных и последующему анализу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описан для высокопроизводительного скрининга (HTS). Однако, если используется небольшое количество составов, их можно добавлять вручную, без автоматических инструментов. Минимальные манипуляции с клетками и надосадочной жидкостью с использованием калиброванных приборов для работы с жидкостями и/или электронных пипеток способствуют успешной подготовке монослоев клеточных культур к количественному определению потока аутофагии с помощью анализа флуоресцентного изображения с высоким содержанием жидкости.

3. Сбор и анализ данных об аутофагическом потоке

  1. Для сбора данных используется система скрининга высокого содержания (HCS) и автоматизированный микроскоп, который позволяет автоматизировать получение и анализ изображений с помощью алгоритма обработки изображений.
  2. Для разработки протокола сбора данных необходимо выбрать несколько каналов и времени экспозиции (табл. 2) для идентификации ядер и формирования аутофагосом и аутолизосом во время событий аутофагического потока.
  3. Для каждой скважины соберите изображения с четырех полей, охватывающих поверхность скважины, и в четырех штабелях, начиная с 8 мкм, разделенных рабочим расстоянием 0,2 мкм. Делайте снимки с помощью 60-кратного объектива для детальной визуализации клеток.
  4. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения для анализа изображений, предоставляемого микроскопом HCS. Чтобы разработать алгоритм надежного протокола анализа для мониторинга потока аутофагии, выберите наиболее подходящий метод для автоматической сегментации изображений клеток и для специфического обнаружения спеклов, соответствующих активации LC3. Выполните окончательный анализ, добавив методы, этапы сегментации ячеек и инструкции по количественной оценке, как описано ниже:
    1. Щелкните по стандартному блоку «Найти ядра» и выберите канал для ядерного красителя Hoechst 33342. Выберите Method и выберите выходную популяцию Nuclei.
    2. Нажмите на строительный блок «Найти цитоплазму» и выберите цитоплазматический канал красителя Флуоресцеин. Выберите метод | Индивидуальный порог.
    3. Щелкните стандартный блок «Найти цитоплазму» (2) и выберите RFP цитоплазматического канала красителя. Выберите метод | Индивидуальный порог.
    4. Нажмите на блок «Построение популяции » и выберите ядра исследуемой популяции. Выберите метод Общие фильтры (Remove border objects) и выберите выходную популяцию Nuclei Inside Borders.
    5. Щелкните по структурному блоку «Найти пятна» и выберите конкретный маркерный канал Fluorescein. Выберите исследуемую популяцию Ядра внутри границ и выберите исследуемую область Цитоплазма. Выберите Метод и выберите выходное заполнение Пятна внутри границ.
    6. Щелкните стандартный блок «Поиск пятен» (2) и выберите RFP для конкретного маркерного канала. Выберите исследуемую популяцию Ядра внутри границ и выберите исследуемую область Цитоплазма (2). Выберите Метод и выберите выходное население Пятна (2) Внутри границ.
    7. Щелкните структурный блок Вычислить свойства интенсивности и выберите конкретный маркерный канал Fluorescein. Выберите исследуемую популяцию Ядра внутри границ и выберите область исследования Spot. Выберите Метод и выберите выходные свойства: Интенсивность, Пятно, Флуоресцеин, Внутри границ.
    8. Щелкните структурный блок Вычислить свойства интенсивности и выберите RFP для конкретного маркерного канала. Выберите исследуемую популяцию Ядра внутри границ и выберите область исследования Spot (2). Выберите Метод и выберите выходные свойства: Интенсивность, Пятно (2), RFP, Внутренние границы.
    9. Щелкните структурный блок «Определение результатов », выберите « Ядра внутри границ» популяции, выберите «Количество объектов ядер (среднее)», выберите «Пятна относительной интенсивности флуоресцеина – среднее значение на скважину» и выберите «Пятна относительной интенсивности (2) – RFP – среднее значение на скважину».
  5. Для количественного определения аутофагического потока используют тот же метод, который был описан ранее для анализа проточной цитометрии11. Установите соотношение mCherry/EGFP для пятен относительной интенсивности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки с более высоким потоком менее зеленые, что увеличивает соотношение mCherry/EGFP в ячейке. Идентификация и точное количественное определение значимого числа релевантных сигналов, поступающих от событий потока аутофагии в клетках, очень важно для установления статистически значимых различий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аутофагический поток может контролироваться в клетках с помощью фармакологической модуляции или реакции клеток на стресс. Инмортализированные хондроциты человека (T/C28a2) были использованы для создания репортерной клеточной линии аутофагии с использованием LC3 в качестве флуоресцентного репортера (mCherry-EGFP-LC3B) для аутофагии. На рисунке 1 показан схематический рабочий процесс скринингового анализа, начиная с разработки репортерной клеточной линии аутофагии в хондроцитах человека (mCher...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дефектная аутофагия является важным признаком возрастной дегенерации суставов, но ни профилактические, ни модифицирующие болезнь методы лечения, направленные на аутофагию, пока не доступны для лечения хрящевой дегенерации2. Учитывая ее актуальность и клиническое значение, аутофагия стала объектом интереса для поиска и разработки лекарств, хотя методы прямого мониторинга изменений в этом ключевом механизме гомеостаза оказались сложными.

...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Instituto de Salud Carlos III - Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Испания, Plan Estatal 2013-2016 и Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), "Una manera de hacer Europa", PI14/01324 и PI17/02059, платформой Innopharma Pharmacogenomics, применяемой для валидации мишеней и открытия лекарственных препаратов-кандидатов на доклинических фазах, Ministerio de Economía y Competitividad. Мы также благодарим Фонд исследований в области ревматологии (FOREUM) за поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100 мм Планшет для клеточной культурыCorning430167Планшет для клеточных культур
12-луночный многопланшетныйCorning353043Планшет для клеточных культур
15 мл Центрифуга коническая пробиркаFalcon-Corning352095Центрифуга коническая пробирка
24-луночная многопланшетнаяCorning351147Планшет для клеточных культур
25 см2 Колбадля клеточных культурFalcon-Corning353014Колба для клеточных культур
384-луночный мультипланшетный держатель клетокPerkin Elmer6007550Планшет для клеточной культуры
6-луночный мультипланшетCorning351146Планшет для клеточных культур
96-луночный мультипланшетCorning353077Планшет для клеточной культуры
Акустическая технология работы с жидкостямиLabcyte−https://www.labcyte.com
ХлорохинSigma-AldrichC6628ингибитор аутофагического потока
Диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma-Aldrich, Сент-Луис, МиссуриD2650Дисольвент
модифицированной среды Dulbecco's Eagle's (DMEM)Lonza, Базель, ШвейцарияBE-604FT/C28a2 питательная
среда Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)ATCC30– 2003HEK 293-T17 питательная среда
FACСкалибуровый цитометрBecton Dickinson, CA−https://www.bdbiosciences.com/en-eu
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MOF9665HEK 293-T17
сыворотка Фетальная сыворотка теленка (FCS)Gibco by Life Technologies, CA26010– 074Сыворотка
FuGenePromegaE2691Нелипосомальная смесь липидов в качестве метода доставки плазмид для создания аутофагии зарегистрированной клеточной линии
Портативная электронная 384-канальная пипеткаIntegra−https://www.integra-biosciences.com/united-states/en/electronic-pipettes/viaflo-96384#downloads
Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS)Sigma-AldrichH6648Buffer
HEK 293-T17ATCCCRL-11268Линия почечных клеток. Для облегчения ретровирусной упаковки были использованы клетки
Content Screening SystemPerkin Elmer−https://www.perkinelmer.com/es/product/operetta-cls-system-hh16000000
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific62249
Программное обеспечение для анализа изображенийPerkin Elmer−https://www.perkinelmer.com/es/product/harmony-4-9-office-license-hh17000010
Рабочая станция для работы с жидкостямиPerkin Elmer−https://www.perkinelmer.com/es/category/janus-liquid-handler-workstations
Робот-мойщик микроплитBiotek−https://go.biotek.com/405tradein
Opti-MEM® (1шт.)Thermo Fisher Scientific11058Трансфекционная среда
Параформальдегид (PFA)Sigma-Aldrich158127Fixer
pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3BAddgene, Кембридж, Массачусетс22418Плазмида
pCL-EcoAddgene, Кембридж, Массачусетс12371Плазмида
пенициллин-стрептомицин (P/S)Sigma-AldrichP0781Антибиотик
Фосфатно-солевой буфер (PBS)MP Biomedicals2810305буферным
пуромициномSigma-Aldrich, Сент-Луис, МиссуриP8833Антибиотик
рапамицинCalbiochem, Германия5053210активатор аутофагического потока
Программное обеспечение CellQuestProBecton Dickinson−https://www.bdbiosciences.com/en-eu
Шприцевые фильтры 0,45 мкм; mCorningCLS431220Стерильный фильтр
T/C28a2−&минус;Клеточная линия хондроцитов человека
ТрипсинGibco от Life Technologies, CA15400054Трипсин, используемый с клетками T/C28a2
TrypsinSigma-Aldrich, St. Louis, MOSM-2002-CТрипсин, используемый с клетками HEK 293-T17
VSV. GAddgene, Кембридж, Массачусетс14888Плазмида
High для окрашивания ДНК

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lopez-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  2. Lotz, M. K., Carames, B. Autophagy and cartilage homeostasis mechanisms in joint health, aging and OA. Nature Reviews Rheumatology. 7 (10), 579-587 (2011).
  3. Carames, B., Taniguchi, N., Otsuki, S., Blanco, F. J., Lotz, M. Autophagy is a protective mechanism in normal cartilage, and its aging-related loss is linked with cell death and osteoarthritis. Arthritis & Rheumatology. 62 (3), 791-801 (2010).
  4. Carames, B., Olmer, M., Kiosses, W. B., Lotz, M. K. The relationship of autophagy defects to cartilage damage during joint aging in a mouse model. Arthritis & Rheumatology. 67 (6), 1568-1576 (2015).
  5. Kroemer, G. Autophagy: a druggable process that is deregulated in aging and human disease. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 1-4 (2015).
  6. Leidal, A. M., Levine, B., Debnath, J. Autophagy and the cell biology of age-related disease. Nature Cell Biology. 20 (12), 1338-1348 (2018).
  7. Maiuri, M. C., Kroemer, G. Therapeutic modulation of autophagy: which disease comes first. Cell Death & Differentiation. 26 (4), 680-689 (2019).
  8. Vinatier, C., Dominguez, E., Guicheux, J., Carames, B. Role of the inflammation- autophagy-senescence integrative network in osteoarthritis. Frontiers in Physiology. 9, 706(2018).
  9. du Toit, A., Hofmeyr, J. S., Gniadek, T. J., Loos, B. Measuring autophagosome flux. Autophagy. 14 (6), 1060-1071 (2018).
  10. N'Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO Reports. 10 (2), 173-179 (2009).
  11. Gump, J. M., Thorburn, A. Sorting cells for basal and induced autophagic flux by quantitative ratiometric flow cytometry. Autophagy. 10 (7), 1327-1334 (2014).
  12. Yoshii, S. R., Mizushima, N. Monitoring and Measuring Autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865(2017).
  13. Nogueira-Recalde, U., et al. Fibrates as drugs with senolytic and autophagic activity for osteoarthritis therapy. EBioMedicine. 45, 588-605 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

LC3mCherry EGFP LC3B
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи