Анализ на основе флюса для идентификации модуляторов аутофагии при остеоартрозе

Uxía Nogueira-Recalde; Irene Lorenzo-Gómez; María I. Loza; Eduardo Domínguez; Beatriz Caramés

doi:10.3791/61078

Методическая статья

Анализ на основе флюса для идентификации модуляторов аутофагии при остеоартрозе

DOI:

10.3791/61078

⸱

8 июля 2020 г.

Uxía Nogueira-Recalde¹ , Irene Lorenzo-Gómez¹ , María I. Loza² , Eduardo Domínguez² , Beatriz Caramés¹

¹Grupo de Biología del Cartílago, Servicio de Reumatología, Instituto de Investigación Biomédica de A Coruña (INIBIC), Complejo Hospitalario Universitario de A Coruña, ²Biofarma Research Group, Center for Research in Molecular Medicine and Chronic Diseases (CIMUS), Universidad de Santiago de Compostela

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье подробно описывается мониторинг потока аутофагии для идентификации новых молекул с помощью клеточного визуализирующего скрининга.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аутофагия является центральным механизмом регуляции гомеостаза. Изменения аутофагии способствуют развитию заболеваний, связанных со старением. Фенотипические методы идентификации регуляторов аутофагии могут быть использованы для идентификации новых терапевтических средств. В данной статье описывается процесс скрининга на основе клеточной визуализации, разработанный для мониторинга аутофагического потока с использованием LC3 в качестве репортера аутофагического потока (mCherry-EGFP-LC3B) в хондроцитах человека. Сбор данных осуществляется с помощью автоматизированного микроскопа High Content Imaging Screening System. Был разработан и проверен протокол автоматизированного анализа изображений на основе алгоритма для идентификации молекул, активирующих аутофагический поток. Сообщается о критических шагах, пояснительных записках и улучшениях по сравнению с текущими протоколами мониторинга аутофагии. Физиологически значимые фенотипические подходы к скринингу целевых признаков старения могут способствовать более эффективным стратегиям разработки лекарств для возрастных заболеваний опорно-двигательного аппарата.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многие хронические заболевания связаны с признаками старения, в том числе дефектная аутофагия¹. Остеоартрит (ОА) является наиболее распространенным заболеванием суставов и оказывает значительное влияние на ограничение повседневной деятельности у стареющего населения, но ни профилактические меры, ни модифицирующие болезнь методы лечения пока не доступны².

Старение суставов и ОА связаны с признаками, определяющими прогрессирование дегенерации хряща, включая дефектную аутофагию и старение ^3,4. Нацеливание....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Генерация репортерной клеточной линии аутофагии иммортализованных хондроцитов человека

Примечание: Генерация репортерной клеточной линии аутофагии путем стабильной трансфекции pBABE-mCherry-GFP-LC3 путем установления количественного считывания проточной цитометрии была описана ранее¹¹. При ретровирусной трансфекции использовали две клеточные линии: HEK 293-T17 в процессе котрансфекции и T/C28a2 на стадии инфекции.

Процесс котрансфекции
1. Подготовьте питательную среду для клеток HEK 293-T17: 500 мл минимальной эссенциальной среды Eagle's (EMEM), 10% фетальной бы....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аутофагический поток может контролироваться в клетках с помощью фармакологической модуляции или реакции клеток на стресс. Инмортализированные хондроциты человека (T/C28a2) были использованы для создания репортерной клеточной линии аутофагии с использованием LC3 в качестве флуоресцентного репортера (mCherry-EGFP-LC3B) для аутофагии. На рисунке 1 показан схематический рабочий процесс скринингового анализа, начиная с разработки репортерной клеточной линии аутофагии в хондроцитах человека (mCher.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дефектная аутофагия является важным признаком возрастной дегенерации суставов, но ни профилактические, ни модифицирующие болезнь методы лечения, направленные на аутофагию, пока не доступны для лечения хрящевой дегенерации². Учитывая ее актуальность и клиническое значение, аутофагия стала объектом интереса для поиска и разработки лекарств, хотя методы прямого мониторинга изменений в этом ключевом механизме гомеостаза оказались сложными.

.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Instituto de Salud Carlos III - Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Испания, Plan Estatal 2013-2016 и Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), "Una manera de hacer Europa", PI14/01324 и PI17/02059, платформой Innopharma Pharmacogenomics, применяемой для валидации мишеней и открытия лекарственных препаратов-кандидатов на доклинических фазах, Ministerio de Economía y Competitividad. Мы также благодарим Фонд исследований в области ревматологии (FOREUM) за поддержку.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
100 мм Планшет для клеточной культуры	Corning	430167	Планшет для клеточных культур
12-луночный многопланшетный	Corning	353043	Планшет для клеточных культур
15 мл Центрифуга коническая пробирка	Falcon-Corning	352095	Центрифуга коническая пробирка
24-луночная многопланшетная	Corning	351147	Планшет для клеточных культур
25 см2 Колба	для клеточных культурFalcon-Corning	353014	Колба для клеточных культур
384-луночный мультипланшетный держатель клеток	Perkin Elmer	6007550	Планшет для клеточной культуры
6-луночный мультипланшет	Corning	351146	Планшет для клеточных культур
96-луночный мультипланшет	Corning	353077	Планшет для клеточной культуры
Акустическая технология работы с жидкостями	Labcyte	−	https://www.labcyte.com
Хлорохин	Sigma-Aldrich	C6628	ингибитор аутофагического потока
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури	D2650	Дисольвент
модифицированной среды Dulbecco's Eagle's (DMEM)	Lonza, Базель, Швейцария	BE-604F	T/C28a2 питательная
среда Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)	ATCC	30– 2003	HEK 293-T17 питательная среда
FACСкалибуровый цитометр	Becton Dickinson, CA	−	https://www.bdbiosciences.com/en-eu
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO	F9665	HEK 293-T17
сыворотка Фетальная сыворотка теленка (FCS)	Gibco by Life Technologies, CA	26010– 074	Сыворотка
FuGene	Promega	E2691	Нелипосомальная смесь липидов в качестве метода доставки плазмид для создания аутофагии зарегистрированной клеточной линии
Портативная электронная 384-канальная пипетка	Integra	−	https://www.integra-biosciences.com/united-states/en/electronic-pipettes/viaflo-96384#downloads
Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS)	Sigma-Aldrich	H6648	Buffer
HEK 293-T17	ATCC	CRL-11268	Линия почечных клеток. Для облегчения ретровирусной упаковки были использованы клетки
Content Screening System	Perkin Elmer	−	https://www.perkinelmer.com/es/product/operetta-cls-system-hh16000000
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	62249
Программное обеспечение для анализа изображений	Perkin Elmer	−	https://www.perkinelmer.com/es/product/harmony-4-9-office-license-hh17000010
Рабочая станция для работы с жидкостями	Perkin Elmer	−	https://www.perkinelmer.com/es/category/janus-liquid-handler-workstations
Робот-мойщик микроплит	Biotek	−	https://go.biotek.com/405tradein
Opti-MEM® (1шт.)	Thermo Fisher Scientific	11058	Трансфекционная среда
Параформальдегид (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Fixer
pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B	Addgene, Кембридж, Массачусетс	22418	Плазмида
pCL-Eco	Addgene, Кембридж, Массачусетс	12371	Плазмида
пенициллин-стрептомицин (P/S)	Sigma-Aldrich	P0781	Антибиотик
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	MP Biomedicals	2810305	буферным
пуромицином	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури	P8833	Антибиотик
рапамицин	Calbiochem, Германия	5053210	активатор аутофагического потока
Программное обеспечение CellQuestPro	Becton Dickinson	−	https://www.bdbiosciences.com/en-eu
Шприцевые фильтры 0,45 мкм; m	Corning	CLS431220	Стерильный фильтр
T/C28a2	−	&минус;	Клеточная линия хондроцитов человека
Трипсин	Gibco от Life Technologies, CA	15400054	Трипсин, используемый с клетками T/C28a2
Trypsin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SM-2002-C	Трипсин, используемый с клетками HEK 293-T17
VSV. G	Addgene, Кембридж, Массачусетс	14888	Плазмида

High для окрашивания ДНК

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lopez-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
Lotz, M. K., Carames, B. Autophagy and cartilage homeostasis mechanisms in joint health, aging and OA. Nature Reviews Rheumatology. 7 (10), 579-587 (201....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Анализ на основе флюса для идентификации модуляторов аутофагии при остеоартрозе

В этой статье

Краткое содержание

Аннотация

Введение

Протокол

Результаты

Обсуждение

Раскрытие информации

Благодарности

Материалы

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Теги

Похожие статьи