Методическая статья

Количественная оценка тканеспецифического снижения протеостатического снижения caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/61100

⸱

7 сентября 2021 г.

 ,  , 
1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Снижение протеостата является отличительной чертой старения, способствуя возникновению нейродегенеративных заболеваний. Мы описываем протокол количественного измерения протеостаза в двух разных тканях Caenorhabditis elegans посредством гетерологичной экспрессии полиглутаминных повторов, слитых с флуоресцентным репортером. Эта модель позволяет проводить экспресс-анализ протеостаза in vivo.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способность поддерживать правильную функцию и сворачивание протеома (белкового гомеостаза) снижается во время нормального старения, способствуя возникновению растущего числа возрастных заболеваний. Например, белки с полиглутаминными расширениями склонны к агрегации, как по примеру белка гентингтина и сопутствующего начала болезни Гентингтона. Возрастное ухудшение протеома было широко изучено с помощью трансгенных Caenorhabditis elegans, экспрессирующих повторы polyQ, слитые с желтым флуоресцентным белком (YFP). Эта трансгенная модель животных polyQ::YFP облегчает прямую количественную оценку возрастного снижения протеома путем визуализации прогрессирующего образования флуоресцентных очагов (т.е. белковых агрегатов) и последующего возникновения дефектов локомоции, которые развиваются в результате коллапса протеома. Кроме того, экспрессия трансгена polyQ::YFP может управляться тканеспецифическими промодерами, что позволяет оценить протеостаз через ткани в контексте интактного многоклеточного организма. Эта модель очень поддается генетическому анализу, обеспечивая тем самым подход к количественной оценке старения, который дополняет анализы продолжительности жизни. Мы описываем, как точно измерить образование фокусов polyQ::YFP в нейронах или мышцах стенки тела во время старения и последующего возникновения поведенческих дефектов. Далее мы расскажем, как эти подходы могут быть адаптированы для более высокой пропускной способности и потенциальных будущих применений с использованием других новых стратегий генетического анализа C. elegans.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белковый гомеостаз (протеостаз) определяется как клеточная способность поддерживать правильную функцию и сворачивание протеома. Неотъемлемая проблема протеостаза заключается в обеспечении того, чтобы все белки были должным образом свернуты и поддерживались в нативной конформации, которая дополнительно усиливается разнообразной природой размера белка, аминокислотного состава, структурной конформации, стабильности, оборота, экспрессии, субклеточной компартментализации и модификаций1. Протеостаз поддерживается благодаря скоординированному действию большой протеостатической сети, состоящей примерно из 2000 уникальных белков, которые регулируют правильный синтез, сворачивание, торговлю и деградацию в протеоме2,3. Компонентами рабочей лошадки протеостатической сети являются девять основных семейств молекулярных шаперонов4. Каждая ткань и тип клеток преимущественно используют специфические подмножества молекулярных шаперонов, по-видимому, в соответствии с различными требованиями различных протеомов5.

Одним из отличительных признаков нормального старения организма является прогрессирующее снижение и коллапс клеточного протеостаза, который считается основной основой для возникновения и прогрессирования растущего числа возрастных заболеваний. Например, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона и боковой амиотрофический склероз (БАС) имеют общую характеристику: в каждом случае проявление нейродегенерации обусловлено генетическими изменениями, которые предрасполагают мутантный белок к агрегации (амилоид-β/тау, α-синуклеин, HTT, FUS/TBD-43/SOD-1, соответственно)6,7,8,9,10 . Во время старения целостность и индуцируемость протеостатической сети снижается, что приводит к накоплению протеотоксических агрегатов, что приводит к клеточной дисфункции и нейродегенерации. Следует отметить, что белковые конформационные заболевания не являются уникальными для нейронов и происходят в нескольких тканях, как подчеркивается диабетом II типа, множественной миеломой и муковисцидозом11,12,13,14. Таким образом, выяснение механизмов, способных сохранить протеостаз, будет способствовать разработке целенаправленных вмешательств для лечения заболеваний и содействия здоровому старению.

Маленькая почвенная нематода Caenorhabditis elegans (C. elegans)сыграла важную роль в обнаружении генов и выяснении путей, которые изменяют протеостаз. Многие компоненты протеостатической сети и сигнальные пути трансдукции, которые регулируют протеостаз, эволюционно сохраняются. Кроме того, C. elegans снизил сложность и избыточность по сравнению с системами позвоночных, что делает его более поддается генетическому анализу и открытию генов. Дополнительные преимущества C. elegans, которые привели к его широкому использованию в качестве модельной системы для изучения протеостаза, включают: мощную генетическую и функциональную геномику, короткий жизненный цикл (3 дня) и продолжительность жизни (3 недели), компактный и хорошо аннотированный геном, наличие широкого ассортимента генетических мутантов и простоту визуализации тканеспецифических изменений в клеточной биологии с помощью флуоресцентных репортеров.

Прогрессирующий распад протеостаза во время старения может быть легко количественно определен в C. elegans. Лаборатория Моримото впервые продемонстрировала, что расширение полиглутамина, слитое с желтым флуоресцентным белком(polyQ::YFP),может быть использовано для количественной оценки протеостатического снижения C. elegans во время старения15,16,17,18. Слияние YFP до 35 и более глутаминов приводит к возрастному образованию флуоресцентных очагов наряду с признаками клеточной патологии. Следует отметить, что этот диапазон расширения глютамина отражает длину полиглутаминового тракта белка Гентингтина, при котором патология болезни Гентингтона начинает наблюдаться у людей (обычно >35 ЦАГ-повторов)19. Штаммы с экспрессией polyQ::YFP в мышечных, кишечных или нейрональных клетках были использованы для подтверждения того, что возрастное снижение протеостаза происходит в разных типах клеток и тканей. Мышечно-специфическая экспрессия polyQ::YFP (т.е. unc-54p::Q35::YFP)была наиболее широко используемым тканеспецифическим репортером, поскольку накапливающиеся флуоресцентные очаги легко поддаются количественной оценке в течение первых нескольких дней взрослой жизни с помощью простого флуоресцентного рассекающего микроскопа(рисунок 1A-1B). Кроме того, животные становятся парализованными в середине жизни, так как протеом внутри мышцы разрушается из-за протеотоксического эффекта репортера(рисунок 1C). Аналогичным образом, возрастное снижение нейронального протеостаза можетсопровождаться (rgef-1p::Q40::YFP)путем непосредственной количественной оценки образования очагов/агрегатов и возрастного снижения скоординированных изгибов тела после помещения животных в жидкость(рисунок 2).

Здесь мы представляем подробный протокол о том, как измерить возрастную прогрессию накопления белковых агрегатов и связанную с ней протеотоксичность, индуцированную экспрессией полиглутаминных повторов в нейронной и мышечной ткани у C. elegans. Мы приведем примеры типичных результатов, полученных с использованием этих штаммов и методов. Кроме того, мы показываем, как мы использовали эти методы для изучения транскрипционной регуляции протеостатической сети. Мы обсуждаем дополнительные способы, которыми эти репортеры могут быть легко интегрированы с другими существующими реагентами или адаптированы для больших экранов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка реагентов

  1. Выберите гены, представляющие интерес, для инактивации с помощью РНК-систем на основе питания. Покупайте акции HT115 E. coli, содержащие РНКи-клон интереса20. Альтернативно, субклонирует кДНК интересующего гена в мультиклонитный участок плазмиды L4440.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить деградацию дцРНК внутри бактерий, используйте штамм HT115. Это штамм E. coli с дефицитом RNase III с IPTG-индуцируемой активностью Т7-полимеразы. Для исследований протеостаза, в которые не используются РНКи на основе питания, можно использовать либо HT115, либо OP50 E. coli на стандартных пластинах NGM.
  2. Подготовьте 5 x 6 см пластин для каждого условия испытания. Для экспериментов с использованием РНКи индуцируют продукцию дцРНК в трансформированной HT115 E. coli. Для исследований без RNAi можно использовать OP50 E. coli на стандартных пластинах NGM (см. Дополнительный файл 1 для стандартных рецептов NGM и RNAi пластин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины RNAi можно хранить при 4 °C в течение нескольких месяцев перед посевом бактериями.
  3. Выращивать культуры кишечной палочки в течение ночи (16-20 ч) при 37 °C в встряхивательном инкубаторе при 220 об/мин. Выращивайте HT115 E. coli в бульоне Лурия (LB) с ампициллином (50 мкг/мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: СтандартНАЯ OP50 E. coli не является устойчивой к антибиотикам, но также доступны варианты, устойчивые к стрептомицину.
    1. Концентрировать бактерии центрифугированием при 2 400 х г в течение 15-20 мин в настольной центрифуге, аспирировать супернатант и повторно суспендировать гранулу в 1/10 от стартового объема (т.е. 10-кратной концентрации) LB с ампициллином для HT115 или LB без ампициллина для стандартного OP50.
    2. Aliquot 200 мкл концентрированных 10x бактерий на каждую пластину (3-4 реплики на каждое условие теста, с 2 дополнительными резервными пластинами, которые будут использоваться в случае загрязнения).
    3. Дайте открытым пластинам высохнуть в чистой среде, такой как ламинарной скамье, пока вся жидкость не будет поглощена, или дайте покрытым пластинам высохнуть на лабораторном стенде в течение ночи.
  4. Для засеянных пластин РНКи, высушенных в вытяжке, храните высушенные тарелки в червячной коробке на ночь (до 24 часов) при комнатной температуре. После 1 дня при РТ пластины можно хранить при 4 °C до 2 недель в герметичном пакете (чтобы пластины не высыхали). Перед использованием позвольте пластинам, хранящимся при температуре 4 °C, вернуться к комнатной температуре в мешке с застежкой-молнией, чтобы предотвратить попадание конденсата в воздух грибковых загрязнений.
    1. При использовании РНКи на основе кормления оставляйте посеянные бактерии HT115 на пластинах РНКи при комнатной температуре не менее чем за 12 часов до добавления C. elegans. Пластины РНКи содержат IPTG, который индуцирует выработку дцРНК. Альтернативно, IPTG можно добавлять к жидким культурам в конце этапа 1.3.1, за 2 часа до посева.
    2. Избегайте длительного хранения посеянных пластин HT115 при комнатной температуре (более нескольких дней), чтобы избежать растрескивания агара, которое заставит C. elegans зарыться в агар.

2. Синхронизация C. elegans

ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите, следует ли синхронизировать C. elegans либо щелочной гипохлоритной обработкой взрослых особей, либо яйцекладкой.

  1. Синхронизировать животных путем гипохлоритной обработки гравидных взрослых животных для содействия высвобождению эмбрионов22.
    1. Для обработки гипохлоритом промыть гравидные гермафродиты 2 раза буфером М9, затем повторно суспендировать в 5 мл раствора гипохлорита (3,25 мл раствора гипохлорита, 1 мл буфера М9 и 0,75 мл 5 М NaOH) в течение 5 мин, ежеминутно встряхивая повторно суспендированных животных. Через 5 мин открутите животных и промыте 3 раза буфером M9.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Было установлено, что лечение гипохлоритом влияет на протеостаз21.
    2. После обработки гипохлоритом дайте эмбрионам вылупиться ночью в 3 мл раствора М9 с вращением при 20 °C.
    3. Рассчитайте плотность животных L1 (или, альтернативно, эмбрионов) на мкл, опустив 10 мкл раствора L1 3x на пластину 6 см и подсчитав количество животных L1 для расчета среднего количества животных L1 на мкл. Животные L1 будут оседать с течением времени. Поэтому периодически смешивайте растворы L1, чтобы избежать оседания.
    4. Посейте 50 животных L1 на тарелку, подсчитайте и запишите количество посеянных и переместите пластины в инкубатор при 20 °C. Важно знать фактическое количество животных на каждой пластине в начале анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Синхронизация животных L1 путем ночного вылупления в M9 обычно используется, поскольку она сводит к минимуму гетерогенность развития после помещения животных на пищу. Тем не менее, синхронизация происходит через остановку развития в ответ на сигналы голодания, которых для некоторых исследований следует избегать (см.23 для дополнительного обсуждения). В качестве альтернативы, примерно синхронизированные животные могут быть получены через яйцекладку, см. 2.2.
    5. Заморозьте и храните остатки животных L1 в жидком азоте или морозильной камере при -80 °C. Таким образом, образец каждого штамма на момент экспериментальной установки сохраняется, создавая ценный ресурс для будущих исследований и улучшая воспроизводимость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: См. Дополнительный файл 1 для рецептов раствора гипохлорита и M9.
  2. Чтобы синхронизировать животных через яйцекладку, поместите 20 молодых взрослых животных (день 1 взрослой жизни) на каждую тарелку на 4-6 часов и позвольте им отложить яйца, пока на тарелку не будет примерно 50 яиц. Удалите всех взрослых особей и переместите тарелки с яйцами в инкубатор при 20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гравидные взрослые животные должны быть синхронизированы в первый день взрослой жизни. Пожилые животные могут откладывать яйца, которые были сохранены в матке, вызывая высвобождение яиц, которые находятся на более продвинутой стадии развития.

3. Производство потомства

ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо принять меры для предотвращения производства потомства или для отделения синхронизированной стартовой популяции от их потомства. Предотвращение производства потомства может быть достигнуто химическим путем путем добавления 5-фтор-2'-дезоксиуридина (FUdR) к пластинам, что описано здесь. Некоторые исследования сообщают, что FUdR может изменять протеостаз24,25. Альтернативные подходы к предотвращению производства потомства обсуждаются ниже.

  1. Сделайте 1000-кратный раствор FUdR, растворив 1 г FUdR в 10 мл сверхчистого H2O. Фильтр стерилизуйте бульон FUdR с фильтром 0,2 мкм и шприцем 10 мл. Аликвот 1 мл бульона в стерильную трубку 1,5 мл. Заморозить и хранить при -20 °C.
  2. Выращивайте животных при 20 °C до стадии L4. Животным N2, выращенным из синхронизированных L1s от обработки гипохлоритом, требуется примерно 40 часов роста при 20 °C, чтобы достичь L4. Темпы роста для других штаммов должны быть эмпирически проверены перед экспериментированием. Подробнее о том, как точно поставить C. elegans, см. 26.
    1. К каждой 6-сантиметровой пластине с животными L4 добавьте 100 мкл 80x FUdR. Очень важно добавить FUdR на этапе L4.
  3. Верните пластины в червячную коробку и положите коробку в сумку с замком на молнии. Вернуться в соответствующий инкубатор.

4. Измерение снижения протеостаза в мышечной ткани с помощью полиглутамино-экспрессирующих животных

Примечание: Для выявления снижения протеостаза в мышечных клетках могут быть использованы два метода: визуализация образования белковых агрегатов во время старения (4.1) и измерение протеотоксичности, которую эти агрегаты вызывают с возрастом через начало паралича (4.2).

  1. Визуализация образования полиглутаминового агрегата в мышцах во время старения
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возрастное прогрессирование агрегации белка в мышечных клетках визуазируется с помощью полиглутаминных (polyQ) повторов, слитых с желтым флуоресцентным белком (YFP). Этот протокол описывает использование штамма AM140 rmIs132[unc-54p::Q35::YFP],но также могут использоваться и другие штаммы варианта полиглутамина. Трансген polyQ::YFP экспрессируется в мышце с помощью мышечно-специфического промотора unc-54. Синхронизированные животные, экспрессирующие unc-54p::p olyQ::YFP, визуализируются на 1, 2, 3 и 4 день взрослой жизни. Для визуализации агрегатов unc-54p::p olyQ::YFP используйте составной микроскоп, оборудованный для флуоресценции, или флуоресцентный рассекающий микроскоп. AM140 доступен в Центре генетики Caenorhabditis (CGC) по адресу: https://cgc.umn.edu/strain/AM140.
    1. В дни визуализации (день 1, 2, 3 и 4 взрослой жизни) выберите 20 животных и установите на микроскоп установку слайда с 3% агарозной прокладкой и 5 мкл капли 10 мМ азида натрия (разбавленный в буфере M9).
    2. После того, как все животные обездвижены азидом натрия (~ 5 минут), визуализируем все тела животных с помощью 10-кратной увеличительную линзу(рисунок 1A). Для визуализации используйте фильтр FITC и одинаковую экспозицию для каждого животного. Отбрасывайте слайды после изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, очаги YFP также могут быть количественно определены непосредственно на пластинах, но движение должно быть ингибировано путем нанесения потока углекислого газа на пластину во время оценки. Этот альтернативный метод наиболее уместен при скрининге большого количества состояний (см. обсуждение для получения более подробной информации).
    3. После получения изображений подсчитайте количество очагов в мышцах стенки тела всего животного. Фокусы представляют собой более яркие прерывистые сигналы, которые можно отличить от более тусклого растворимого сигнала в фоновом режиме.
    4. График прогрессирования накопления очагов YFP с 1, 2, 3 и 4 дней. Постройте график XY, где X представляет дни взрослой жизни, а Y представляет число unc-54p::p olyQ::YFP фокусы(рисунок 1B). Количество очагов в экспериментальном состоянии (например, понижение генов или сверхэкспрессия) сравнивается с контрольными животными. Выполните статистический анализ между группами в каждый момент времени, наблюдаемый для каждого испытания.
      1. При сравнении количества очагов только для двух условий выполняйте независимый образец t-теста в каждый момент времени.
      2. При сравнении количества очагов для более чем двух условий выполните омнибусный односторонний анализ ANOVA для каждой точки времени, включая данные для всех условий в этот момент времени. Если омнибус ANOVA дает значительное p-значение (т.е. p < 0,005), выполните пост-специальный анализ с попарно независимыми выборочными t-тестами для определения конкретных условий, между которыми была обнаружена значительная разница в фокусах (например, для групп A, B и C сравните A & B, A & C и B & C).
  2. Измерение частоты паралича животных в качестве суррогата токсичности полиглутамина в мышечных клетках
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возрастное увеличение агрегатов polyQ в мышцах вызывает снижение мышечной функции, которая управляет локомоцией. Этот дефект локомоции может быть определен путем измерения прогрессирующей скорости паралича у поликв-экспрессирующих животных. Для анализа паралича синхронизированные unc-54p: :p olyQ: YFP экспрессивные животные оцениваются на 3, 5, 7 и 9 день взрослой жизни. Добавьте дополнительные временные точки, по мере необходимости, чтобы расширить диапазон подсчета баллов, чтобы вы могли оценить эффект генетического возмущения.
    1. В скоринговые дни (3, 5, 7 и 9 день взрослой жизни) посмотрите на 6 см пластины, содержащие 50 животных, и запишите количество парализованных животных. Выньми из тарелки парализованных животных. Если животные выползли с тарелки или умерли, они должны быть подвергнуты цензуре; запишите событие, чтобы его можно было учесть в анализе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Животное считается парализованным, когда не наблюдается движения после воздействия на него легких или мягких стимулов прикосновения. Глоточная насосная активность используется для определения того, живы или мертвы неподвижные животные.
    2. По завершении эксперимента рассчитайте частоту паралича для каждого состояния. Делайте это в каждый момент времени, разделив долю парализованных животных на общее количество животных, наблюдаемых для этого состояния в то время. Если вы наблюдаете несколько пластин на условие в каждый момент времени (т. е. реплицируете пластины), рассчитайте соотношение отдельно для каждой реплики.
    3. График прогрессии частоты паралича на графике XY (диаграмма рассеяния). X представляет дни взрослой жизни, а Y представляет показатели паралича. Частота паралича животных unc-54p::p olyQ::YFP сравнивается с контрольными животными(рисунок 1C). Проводить статистический анализ между группами; для нескольких испытаний, лечите испытания независимо. Используйте регрессию пропорциональных опасностей Кокса и тест Вальда. Большинство инструментов анализа данных, поддерживающих анализ выживаемости, также поддерживают моделирование Кокса.
      1. Преобразование данных: каждое условие должно иметь два столбца, один для времени, а другой для «события». В каждый наблюдаемый момент времени добавьте строку с «0» для каждого парализованного животного и «1» для каждого подвергнутого цензуре животного. Общее количество рядов должно быть равно количеству стартовых животных на пластине для этого условия.
      2. Выполните моделирование пропорциональных опасностей Кокса, а затем тест Вальда в соответствии с инструкциями для вашего статистического программного обеспечения. Одномерная модель будет подходить для типичных экспериментальных конструкций. Для более чем двух условий, если тест с включенными всеми условиями указывает на значительный результат (т.е. p < 0,005), могут быть выполнены попарные тесты между условиями для определения конкретной значимой пары (пар) условий.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Модель Кокса опирается на предположение, что условие (условия) теста модулируют вероятность события пропорционально с течением времени. Это означает, например, что модель Кокса не подходит для сравнения состояния, при котором большинство животных парализованы на 1-й день, с состоянием, при котором большинство животных парализованы на 9-й день. Расширения модели Кокса и другие подходы к сравнению пропорций, парализованных в каждый момент времени, доступны для случаев, когда предположение о пропорциональных опасностях не выполняется (см.27,28,29,30).

5. Измерение снижения протеостаза в нейрональной ткани с помощью полиглутамина экспрессирующих животных.

ПРИМЕЧАНИЕ: Два комплементарных метода используются для анализа снижения протеостаза в нейронах (1) путем количественной оценки образования белковых агрегатов (флуоресцентных очагов) во время старения и (2) путем измерения возрастного снижения нейронального протеома с помощью анализа на основе движения.

  1. Визуализация образования полиглутаминового агрегата в нейронах во время старения
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подобно анализу, уже обсуждавному в мышечной ткани, возрастная прогрессия агрегации белка в нейронах визуалируется путем экспрессии белка слияния polyQ::YFP, управляемого пан-нейрональным тканеспецифическим промотером rgef-1. В частности, мы используем AM101: rmIs110 [rgef-1p::Q40::YFP],слияние сорока глутаминов с YFP16. Для визуализации rgef-1p::p olyQ::YFP используйте составной микроскоп, оснащенный для флуоресценции 40-кратным увеличением линзы. AM101 доступен в CGC по адресу: https://cgc.umn.edu/strain/AM101.
    1. В дни визуализации (4, 6, 8 и 10 день взрослой жизни) выберите 20 животных и установите на микроскоп слайд, содержащий 3% агарозную прокладку с каплей 5 мкл 10 мМ азида натрия (разбавленный в буфере M9).
    2. После того, как все животные обездвижены азидом натрия (~ 5 минут), сделайте z-стековые снимки головы животных с помощью 40-кратной увеличительную линзу(рисунок 2A). Отбрасывайте слайды после изображения.
    3. После получения изображений обрабатывают z-стеки для получения максимальной проекции и используют для количественной оценки количество очагов в нейронах, расположенных на области нервного кольца. Фокусы представляют собой более яркие прерывистые сигналы, которые можно отличить от более тусклого растворимого сигнала в фоновом режиме.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы специально выбрали область нервного кольца для количественной оценки агрегатов rgef-1p::p olyQ::YFP, поскольку это область, где большинство нейронов сходятся, чтобы создать синаптические связи. Однако для измерения уровней образования агрегатов в двигательных нейронах можно количественно оценить агрегаты rgef-1p::p olyQ::YFP, расположенные на спинном или вентральном нервном пуповине.
    4. График прогрессирования накопления очагов YFP от D4, D6, D8 и D10. Сделайте это на графике XY, где X представляет дни взрослой жизни, а Y представляет число rgef-1p::p olyQ::YFP фокусов(рисунок 2B). Количество очагов в экспериментальном состоянии (например, понижение генов или сверхэкспрессия) сравнивается с контрольными животными. Статистический анализ количества очагов для нейронов проводится так же, как и для мышечных polyQ-очагов; см. шаги 4.1.4 и связанные с ними примечания.
  2. Измерение изгибов тела как суррогатная мера протеотоксичности полиглутамина в нейронах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протеотоксический стресс, вызванный прогрессирующим совокупным накоплением нейронального polyQ, определяется путем просмотра дефектов двигательных нейронов с помощью анализа. Количественно оценить количество изгибов тела в течение 30 секунд при подвешении в физиологическом буфере M9(Дополнительный файл 1).
    1. На 2-й день взрослой жизни выберите 10 синхронизированных животных из тарелки и поместите на 10 мкл каплю буфера M9 на слайд микроскопа. Повторите этот шаг по крайней мере четыре раза, чтобы получить образец из 40 или более животных.
    2. Видеозапись движения 10 животных, помещенных на слайд микроскопа с буфером M9 10 мкл в течение 30 с на стереомикроскопе с видеокамерой. Повторите этот шаг 4 раза, чтобы получить общее число выборок 40. Масштаб и положение должны быть отрегулированы таким образом, чтобы все животные были видны в кадре в течение полных 30 секунд.
    3. После того, как все видео с животными, которые будут проанализированы, будут записаны, воспроизвести видео и забить изгибы тела каждого животного. Один изгиб тела определяется как когда вульва животного переходит из одной стороны в противоположную и обратно в исходное положение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы находим, что дикие животные обычно имеют 49 ± 0,79 изгиба тела за 30 секунд.
    4. Отрисуть количество изгибов тела для каждого животного в столбцовом графике, где каждая точка представляет количество изгибов тела в 30 с (ось Y) с различными условиями, протестированными на оси X. Количество изгибов тела животных unc-54p::p olyQ::YFP сравнивается с контрольными животными(рисунок 2C). Проводить статистический анализ между группами независимо друг от друга для каждого испытания; если анализ повторяется в нескольких точках времени, проанализируйте данные независимо для каждого момента времени.
      1. При рассмотрении только двух условий выполните t-тест независимого образца.
      2. При рассмотрении более двух условий одновременно сначала выполните омнибусный односторонний анализ ANOVA, включающий данные для всех условий в этом испытании времени / точке времени. Если омнибус ANOVA дает значительное p-значение (т.е. p < 0,005), выполните пост-специальный анализ с попарно независимыми t-тестами образца для определения конкретных условий, между которыми была обнаружена значительная разница в количестве изгибов тела.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У C. elegansмодель повтора полиглутамина сыграла важную роль в идентификации генов, которые регулируют протеостатическую сеть. Например, ранее мы показали, что гомеодомайн, взаимодействующий с протеинкиназой(hpk-1),транскрипционный кофактор, влияет на протеостаз во время старения, регулируя экспрессию аутофагии и молекулярных шаперонов31. Мы обнаружили, что потеря hpk-1,либо путем глушения RNAi, либо у животных hpk-1 (pk1393) с нулевым мутантом, увеличивает коли...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Старение характеризуется постепенным снижением протеостаза. Протеостаз поддерживается сложной системой, протеостатической сетью, для скоординированного, динамического, стресс-реагирующего контроля сворачивания, деградации и трансляции белка. Почему протеостаз терпит неудачу в процессе старения, плохо изучено, но распадающийся эпигеном, снижение индуцируемости стрессовых реакций и потеря компенсаторных перекрестных помех совпадают с этим срывом. У C. elegans транскрипционная индуцируемость множественных форм стре...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить бывших и нынешних членов лаборатории Самуэльсона за их помощь в совершенствовании этого метода и / или обсуждении, которое помогло разработке этой рукописи. Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом по проблемам старения Национальных институтов здравоохранения под номерами RF1AG062593 и R21AG064519. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. Спонсоры не имели никакого значения в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
24-луночные планшеты для культивированияGreiner Bio-One#662102
2 мл 96-луночные планшетыGreiner Bio-One#780286
600 &; L 96-луночные планшетыGreiner Bio-One#786261
96-контактный пластинчатый репликаторNunc250520
Воздухопроницаемый пластинчатый уплотнительVWR60941-086
бактериологический агарAffymetrix/USB10906
бакто-пептонVWR90000-368
C. elegans РНКи клонированная библиотека в бактериях HT115- AhringerИсточник: BioscienceC. elegans RNAi Collection (Ahringer)См. также Kamath et al., Nature 2003.
Библиотека клонов РНК-интерференции C. elegans в бактериях HT115 - VidalSource BioscienceC. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)См. также Rual et al., Genome Research 2004. Эту библиотеку также можно получить в Дхармаконе.
FuDR (5-фтор-2'-дезоксиуридин)Alfa AesarL16497
Защитные стекла для стеклянного микроскопаVWR48404-455
Стеклянные стекла для микроскопаVWR160004-422
IPTG (изопропилбета-D-1-тигалактопиранозид)Gold Bio12481C100
Ретугловая необработанная однолуночная пластина, 128x86 ммThermo-Fisher
Азид натрия, CAS #26628-22-8Sigma-AldrichS2002
Микроскоп Zeiss Axio Imager M2m с программным обеспечением AxioVision v4.8.2.0Zeissнеизвестен
Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad микроскопZeissнеизвестен
242811

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wolff, S., Weissman, J. S., Dillin, A. Differential scales of protein quality control. Cell. 157 (1), 52-64 (2014).
  2. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
  3. Powers, E. T., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W., Balch, W. E. Biological and chemical approaches to diseases of proteostasis deficiency. Annual Review of Biochemistry. 78, 959-991 (2009).
  4. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  5. Sala, A. J., Bott, L. C., Morimoto, R. I. Shaping proteostasis at the cellular, tissue, and organismal level. Journal of Cell Biology. 216 (5), 1231-1241 (2017).
  6. Braak, H., Braak, E., Strothjohann, M. Abnormally phosphorylated tau protein related to the formation of neurofibrillary tangles and neuropil threads in the cerebral cortex of sheep and goat. Neuroscience Letters. 171 (1-2), 1-4 (1994).
  7. Poirier, M. A., Jiang, H., Ross, C. A. A structure-based analysis of huntingtin mutant polyglutamine aggregation and toxicity: evidence for a compact beta-sheet structure. Human Molecular Genetics. 14 (6), 765-774 (2005).
  8. Vilchez, D., Saez, I., Dillin, A. The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases. Nature Communications. 5, 5659(2014).
  9. Eftekharzadeh, B., Hyman, B. T., Wegmann, S. Structural studies on the mechanism of protein aggregation in age related neurodegenerative diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 156, 1-13 (2016).
  10. Pokrishevsky, E., Grad, L. I., Cashman, N. R. TDP-43 or FUS-induced misfolded human wild-type SOD1 can propagate intercellularly in a prion-like fashion. Scientific Reports. 6, 22155(2016).
  11. Mukherjee, A., Morales-Scheihing, D., Butler, P. C., Soto, C. Type 2 diabetes as a protein misfolding disease. Trends in Molecular Medicine. 21 (7), 439-449 (2015).
  12. Sikkink, L. A., Ramirez-Alvarado, M. Biochemical and aggregation analysis of Bence Jones proteins from different light chain diseases. Amyloid. 15 (1), 29-39 (2008).
  13. Qu, B. H., Strickland, E., Thomas, P. J. Cystic fibrosis: a disease of altered protein folding. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 29 (5), 483-490 (1997).
  14. Qu, B. H., Strickland, E. H., Thomas, P. J. Localization and suppression of a kinetic defect in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator folding. Journal of Biological Chemistry. 272 (25), 15739-15744 (1997).
  15. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
  16. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  17. Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. New England Journal of Medicine. 355 (21), 2254-2255 (2006).
  18. Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes & Development. 22 (11), 1427-1438 (2008).
  19. Walker, F. O. Huntington's disease. Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).
  20. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 0002(2001).
  21. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840(2013).
  22. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  23. Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. Journal of Visualized Experiments. (136), e57819(2018).
  24. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
  25. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964(2014).
  26. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
  27. Schemper, M. Cox Analysis of Survival Data with Non-Proportional Hazard Functions. Journal of the Royal Statistical Society. Series D (The Statistician). 41 (4), 455-465 (1992).
  28. Royston, P., Parmar, M. K. The use of restricted mean survival time to estimate the treatment effect in randomized clinical trials when the proportional hazards assumption is in doubt. Statistics in Medicine. 30 (19), 2409-2421 (2011).
  29. Campbell, I. Chi-squared and Fisher-Irwin tests of two-by-two tables with small sample recommendations. Statistics in Medicine. 26 (19), 3661-3675 (2007).
  30. Busing, F. M., Weaver, B., Dubois, S. 2 x 2 Tables: a note on Campbell's recommendation. Statistics in Medicine. 35 (8), 1354-1358 (2016).
  31. Das, R., et al. The homeodomain-interacting protein kinase HPK-1 preserves protein homeostasis and longevity through master regulatory control of the HSF-1 chaperone network and TORC1-restricted autophagy in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 13 (10), 1007038(2017).
  32. Garcia, S. M., Casanueva, M. O., Silva, M. C., Amaral, M. D., Morimoto, R. I. Neuronal signaling modulates protein homeostasis in Caenorhabditis elegans post-synaptic muscle cells. Genes & Development. 21 (22), 3006-3016 (2007).
  33. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  34. Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
  35. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  36. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  37. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
  38. Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
  39. Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438(2011).
  40. Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
  41. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 119-128 (2005).
  42. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  43. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
  44. Johnson, D. W., et al. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad complexes integrate diverse longevity signals. PLoS Genetics. 10 (4), 1004278(2014).
  45. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  46. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Proteostasis DeclineC elegans AgingPolyQ YFP ReporterTissue Specific ExpressionFluorescent Foci QuantificationLocomotion DefectsNeuronal ProteostasisMuscle ProteostasisGenetic AnalysisHPK 1 Regulation

Похожие статьи