Методическая статья

Изоляция эндокардиальных и коронарных эндотелиальных клеток от вентрикулярной свободной стены Крысиного Сердца

21.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61126

⸱

15 апреля 2020 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Cardiology, Stanford School of Medicine, 2Vera Moulton Wall Center for Pulmonary Vascular Disease, Stanford School of Medicine, 3Stanford Cardiovascular Institute, Stanford School of Medicine, 4Division of Pulmonary Biology, Department of Pediatrics, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 5Center for Stem Cell and Organoid Medicine, CuSTOM, Division of Developmental Biology, and Perinatal Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем протокол для изоляции эндокардиальных и коронарных эндотелиальных клеток от крысиных сердец через последовательное пищеварение ткани в буфере пищеварения, сбор клеток от периодических циклов центрифуги, и очистка клеток с использованием анти-крысы CD31 микробусы.

Аннотация

Было показано, что эндокардиальные эндотелиальные клетки (EECs) и коронарные эндотелиальные клетки (CECs) различаются по происхождению, развитию, маркерам и функциям. Следовательно, эти две популяции клеток играют уникальную роль в сердечных заболеваниях. Текущие исследования с участием изолированных эндотелиальных клеток исследуют популяции клеток, состоящие как из EECs, так и из ЦЭк. В этом протоколе излагается метод независимой изоляции этих двух популяций клеток для характеристик и конкретных клеток. После сбора левой и правой стенки желудочка, эндотелиальные клетки с внешней поверхности и внутренней поверхности отдельно освобождаются с помощью раствора буфера пищеварения. Последовательное пищеварение внешней поверхности и внутреннего эндокардиального слоя сохранило разделение двух эндотелиальных популяций клеток. Отдельная изоляция ЕЭК и ЦЭК проверяется еще раз путем выявления маркеров, характерных для каждой популяции. На основе ранее опубликованных одноклеточных РНК профилирования в сердце мыши, Npr3, Hapln1, и Cdh11 экспрессия генов является уникальным для EECs; в то время как экспрессия генов Fabp4, Mgllи Cd36 уникальна для ЦС. Данные qPCR выявили обогащенное выражение этих характерных маркеров в соответствующих образцах, что свидетельствует об успешной изоляции ЕЭК и ЦИК, а также поддержании клеточного фенотипа, что позволяет проводить дальнейший клеточный функциональный анализ.

Введение

В этой статье содержится подробный протокол (измененный из Gladka et al.1) для вскрытия и последующей изоляции эндокардиальных эндотелиальных клеток (EECs) и коронарных эндотелиальных клеток (CECs) от крысиных сердец. Способность исследовать эти популяции клеток независимо позволило бы исследовать механизмы типа клеток, лежащие в основе различных сердечных заболеваний, которые могли бы служить в качестве потенциальных терапевтических целей. Однако успешный метод самостоятельного сбора популяций этих клеток еще не опубликован.

ЦЭЦ отличаются от EECs в отношении их происхождения, маркеров и функций во время развития сердца и болезни11,22,3,4,,5,,6,7. EECs вытекают из брюшной поверхности сердечного мезодерма3. Они возникают из клеток-прародителей Flk1в ответ на сигнализацию VEGF и HIF и образуют внутренний слой трех дискретных областей развивающегося сердца: предсердий, желудочка и синусового вена3,6. Отслеживание генетической линии предполагает, что плюрипотентные эндокардиальные клетки синусовой веносвых венозных клеток, которые мигрируют в форме субэпикардиального слоя3. Впоследствии субэпикардиальный слой дифференцируется в коронарных артериях и венах, в том числе CECs, которые остаются через периферийные стенки желудочков3,4. Этот эндокардиальный эндотелиальный путь регулируется VEGFC, ELA/APJ и SOX17 сигнализации3,4,,6,,8,9. Желудочковый эндокардий получает меньше ЦЭк межжелудочковой перегородки неизвестным механизмом3. Впоследствии локализованная дифференциация между EECs и CECs предлагается маркерами, специфичными для этих двух популяций клеток, включая Mgll, Fabp4 и выражение Cd36 в ЦЭК, или Npr3, Cdh11 и Hapln1 выражение в EECs3,5,10.

EECs и CECs играют различные роли в сердечной функции. Эндокардиальный к мезенхимальному переходу, формированию клапанов, периоду камерного созревания, регулированию оттока тракта и развитию атриовентрикулярного канала зависит от EECs6. Кроме того, ЦЭК способствуют вазомоторному тону и воспалению коронарных артерий11. Эти отклонения в функции приводят к индивидуальной роли в развитии болезни4,12. Например, данные свидетельствуют о том, что неисправность EECs может привести к врожденному заболеванию клапана6, безумство миокарда6, атриовентрикулярной секторной перегородки эффект6, эндокардиальный фиброэластоз13, гипопластический синдром левого сердца13, желудочковой гипоплазии13, и сердечной гипертрофии12. Аналогичным образом, исследования показали, что ненормальные CECs способствовать ишемической болезни сердца14 и тромбоз11.

Успешная изоляция EECs и CECs необходима для достижения всеобъемлющих знаний об этих двух популяциях клеток, которые могут быть использованы как в исследованиях, так и в клинических условиях. Определение факторов роста и дифференциации этих популяций клеток даст рекомендацию для дифференциации эндотелиальных подтипов от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs). Кроме того, полная идентификация отклонений в развитии, регулировании и функции EECs и CECs имеет жизненно важное значение для понимания геномных и эпигеномных факторов, ответственных за многочисленные заболевания сердца в клеточном типе-специфическим образом. В этой статье излагаются шаги для успешного сбора EECs и CECs независимо, и предоставляет доказательства разделения путем оценки уровня экспрессии генов клеточных типконкретных маркеров.

Протокол

Все процедуры для животных были одобрены Административной группой по уходу за лабораторными животными (APLAC31608) Стэнфордского университета.

1. Подготовка буферов

  1. Подготовьте буфер пищеварения с помощью реагентов, перечисленных в таблице 1.
    1. Подготовка DNase I фондовых решение: Растворите DNase I в RNase воды для фондового решения 2000 единиц / мл (1 мг /мл). Aliquot и хранить складе раствора при -20 градусах Цельсия.
    2. Подготовка раствора liberase: Растворите liberase с rNase-свободной водой для разрешения штока 5 мг/мл. Поверните его на роликовой банке при 4 градусах по Цельсию в течение 30 мин. Aliquot и храните складраствор при -20 градусов по Цельсию.
  2. Подготовьте сортировочный буфер путем разбавления 0,5 М этиленденеамитететраацетической кислоты (ЭДТА) и 10% раствора сыворотки сыворотки крупного рогатого скота (BSA) с 1x фосфатным буферным сольниковым раствором (PBS) для конечной концентрации 2 мМ ЭДТА и 0,5% BSA.

2. Коллекция сердца

ПРИМЕЧАНИЕ: Шесть крыс Sprague Dawley весом 50-100 г были использованы в этом протоколе. Не наблюдалось никаких гендерных различий.

  1. Эвтанизировать крысу с CO2 и поместить ее в положение на спине на рассекающей платформе. Прикрепите конечности вниз и стерилизовать живот и грудь с 70% этанола.
  2. Откройте живот ножницами и вставьте 21 G иглу в часть задней полы вены, расположенной за кишечником. Потяните шприц поршень обратно, снятие крови из вены, пока печень появляется светлее в цвете и не больше крови могут быть сняты, что свидетельствует о достаточном удалении крови.
  3. Используя ножницы, откройте грудь тщательно, чтобы избежать повреждения легких и сердца. Поднимите арку аорты / атриум с щипками и сократить аорты, легочной артерии, легочных вен, и вены полы освободить и удалить сердце.
  4. Вымойте сердце с 50 мл холодного 1x Хэнкс 'сбалансированный солевой раствор (HBSS) буфер 3x, чтобы удалить чрезмерную кровь.
  5. Под микроскопом микродиссекции, удалить правый желудочковой свободной стенки в 5 мл трубки, содержащей Dulbecco в модифицированной среде Eagle (DMEM)(Рисунок 1A,B).
    1. Положите сердце на его льстить, заднее лицо, чтобы определить левую и правую сторону.
    2. Найдите легочную артерию, самую переднюю вену и артерии, разветвляющиеся с верхней части сердца, и прорежьте легочную артерию до правой желудочковой камеры. На передней стороне сердца, вырезать вдоль перегородки до достижения вершины. Продолжить резки с вершины до задней стороне сердца вдоль перегородки до легочной артерии и правой желудочковой камеры точки соединения(рисунок 1A).
    3. Начиная с легочной артерии и правой точки соединения желудочка, вырезать как переднюю и заднюю сторону сердца перпендикулярно к предыдущему вскрытию и от перегородки, пока правая стенка желудочков освобождается от остальной части сердца (Рисунок 1B).
  6. Под микроскопом микродиссекции, удалить левый желудочковой свободной стенки в 5 мл трубки, содержащей DMEM(Рисунок 1C,D).
    1. Найдите аорту, ветвящийся от верхней части сердца за легочной артерией, и повторите метод, описанный в шаге 2.5, чтобы отрезать левую стенку желудочка.

3. Пищеварение ЕЭК

  1. Поместите как правый, так и левый желудочковые свободные стены ткани в 60 см культуры блюдо с внутренней поверхностью лежал плоский, лицом вниз(Рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренняя поверхность является внутренней поверхностью слегка вогнутой формы желудочка, как показано на рисунке 2A,C.
  2. Добавьте в блюдо 0,5-1 мл буфера пищеварения, поместив кончик пипетки прямо под ткань. Продолжайте, пока не будет погружена только внутренняя поверхность.
  3. Инкубировать блюдо в 5% CO2,37 КС инкубатор в течение 5 мин.
  4. Добавить EC среде в культуре блюдо, чтобы остановить пищеварение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите количество буфера пищеварения к среде EC как коэффициент 1:5.
  5. Используйте 1 мл пипетки, чтобы промыть внутреннюю поверхность желудочков с помощью EC среды и перенести стока в трубку сбора 50 мл через 40 мм ситечко(рисунок 2E). Храните коллекции на льду для очистки ниже по течению.

4. Пищеварение ЦИК

  1. Вырезать вдоль внешней поверхности левого желудочка без загрязнения от внутреннего слоя(рисунок 2B,D) и поместите каждый в отдельной трубке 5 мл, содержащей 1 мл буфера пищеварения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Левый желудочек можно определить как более толстый желудочек, а внешняя поверхность может быть определена как внешняя грань слегка вогнутого желудочка.
  2. Используя рассечение ножницами, фарш стенки желудочка в малых, 1 мм3 штук.
  3. Инкубировать трубку в водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 15-20 мин. Вортекс каждые 2-3 мин.
  4. Пипетка 4 мл EC среды в 5 мл трубки для прекращения пищеварения.
  5. Перенесите раствор с серологическим пипеткой 5 мл в трубку 50 мл через 40-мм ситечко(рисунок 2E). Храните коллекции на льду для очистки ниже по течению.

5. Коллекция клеток

  1. Центрифуга труб на 300 х г в течение 10 минут при комнатной температуре (RT), а затем аспирации супернатанта.
  2. Если гранулы появляются красными, resuspend гранулы в 1-2 мл 1x красных кровяных телец (РБК) lysing буфера(рисунок 2F).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если НЕТ РБК, перейдите к шагу 6.
  3. Инкубировать трубки в водяной бане 37 градусов в течение 5 мин.
  4. Пипетка 10 мл PBS в 50 мл труб, чтобы остановить лиза.
  5. Центрифуга труб на 300 х г в течение 10 минут на RT, а затем аспирации супернатанта.

6. Сортировка ЕС

  1. Добавьте 90 кЛ сортирующего буфера и 10 зл анти-CD31 PE антитела в 50 мл труб.
  2. Vortex трубки, а затем инкубировать их в течение 10 минут в холодильнике 4 кс.
  3. Добавьте 10 мл сортировки буфера в трубки, тщательно перемешайте, а затем центрифугу при 300 х г в течение 10 минут на RT.
  4. Аспирировать супернатант и resuspend гранулы в 80 злител сортировожного буфера и 20 Зл анти-PE микробусов.
  5. Вихрь трубки и инкубировать при 4 кв КС в течение 15 мин.
  6. Вымойте клетки, добавив 10 мл сортировки буфера в трубки, тщательно перемешать, а затем центрифуги их на 300 х г в течение 10 минут на RT.
  7. Призадыхать супернатант и resuspend гранулы в 500 л сортировки буфера.
  8. Поместите столбец, содержащий суперпарамагнитные сферы, в магнитный сепаратор и промыть столбец 3 мл сортирующего буфера.
  9. После того, как колонна "остановка потока", пипетка 500 л ячеек подвески в колонны, а затем мыть колонны с сортировочным буфером. Повторите мыть 3x, каждый с 3 мл сортировки буфера(рисунок 2G).
  10. Снимите столбцы с сепаратора и поместите их поверх новой трубки коллекции 15 мл.
  11. С помощью пипетки добавьте 5 мл среды EC к столбику и продвиайте решение с помощью колонны.
  12. Centrifuge коллекции труб на 300 х г в течение 10 минут на RT, а затем аспирации супернатанта.
  13. Извлеките РНК из клеточных гранул образцов ЕЭК и ЦИК с помощью комплекта, следуя инструкциям производителя. Минимум 500 нг РНК могут быть получены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После извлечения РНК образец может храниться при -80 градусов по Цельсию.
  14. Обратный транскриб 500 нг РНК, чтобы получить cDNA с помощью случайного грунтовки и комплект, следуя инструкциям производителя.
  15. Выполните количественные ПЦР для проверки эндокардиальных и эндотелиальных популяций(рисунок 2H). Последовательность праймерперечислений указана в таблице 2.
    1. Добавьте 5 кДНК ЕЭК или CEC (1 нг/Л) в скважины пластины 384 qPCR. Добавьте кДНК ЕЭК или ЦИК в достаточное количество скважин, чтобы было три скважины на количество грунтовок.
    2. Смешайте 6 qL 2x qPCR SYBR зеленый буфер с 0,5 л из каждого 10 км грунтовки, в том числе как вперед, так и обратной грунтовки, и добавить их в один хорошо соответствующие каждому кандидату гена.
    3. Запечатать пластину с пластиковой пленкой и центрифуги в течение 1 мин при 300 х г на RT.
    4. Поместите пластину в машину qPCR, а затем запустите программу при 95 градусах по Цельсию в течение 3 мин, затем 95 градусов по Цельсию в течение 15 с, а затем 55 градусов по Цельсию в течение 60 с. Повторите последующие два шага в течение 45 циклов.

Результаты

Процесс изоляции ЕЭК и ЦИК описан на рисунке 2. Успешная изоляция ЕЭК и ЦЭК была определена путем оценки наличия панэндотелиальных маркеров клеток, а также маркеров, отличающихся от двух популяций подтипов. Как и предсказывалось, qPCR показал, что по отношению к β-актин, EECs выразил более высокие уровни эндокардиальных маркеров Npr3, Hapln1, и Cdh11 по сравнению с ЦЭк (Рисунок 3A). Аналогичным образом, CECs выразили более высокие уровни коронарных маркеров Fabp4, Mgll, и Cd36 по сравнению с EECs(рисунок 3B). Кроме того, как EECs и CECs выразил пан-EC маркер гена Cdh5, с несколько более высоким уровнем в ЦИК(рисунок 3C).


Диаграмма анатомии сердца; меченые аорта, желудочки, артерии; Исследование путей кровотока.
Рисунок 1: Диаграмма вскрытия сердца. ()Первый разрез сделал, чтобы отделить правый желудочек свободной стенки от перегородки. (B) Второй разрез сделал, чтобы освободить правый желудочек полностью. (C) Первый разрез сделал, чтобы отделить левый желудочек свободной стенки от перегородки. (D) Второй разрез сделал, чтобы освободить левый желудочек полностью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.


Диаграмма выделения клеток сердца с пищеварением, лизисом эритроцитов, сортировкой MACS и анализом количественной ПЦР.
Рисунок 2: Диаграмма настройки пищеварения ЦЭК и EECs и следующий механизм для сортировки клеток. (A) Внутренняя бесплатная желудочковая стенка и (B) внешние желудочковой свободной стенки были (C) погружен в пищеварительной буфер или (D) переваривается в пищеварительном буфере соответственно. (E) Сбор и фильтрация клеточных растворов с последующим (F) красная кровяная клетка (РБК) лиза и (G) магнитно-активированной сортировки клеток (MACS) с использованием антитела CD31. (h)Очищенные ECs были обработаны для проверки экспрессии генов с помощью qPCR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.


Сравнительная таблица экспрессии генов, показывающая ЭЭК и ЦЭК для Npr3, Cdh11, Hapln1, Mgll, Fabp4, Cd36.
Рисунок 3: данные qPCR, подтверждающие изоляцию ЦЭК и EECs. (A) Уровни экспрессии генов маркеров EEC Npr3, Cdh11и Hapln1 в EECs и CECs были количественно в режиме реального времени PCR. (B) Уровни экспрессии генов маркеров ЦИК Mgll, Fabp4, и Cd36 в EECs и CECs были количественно в режиме реального времени PCR. (C) маркер Cdh5 по пан-EC был количественно оценен в EECs и CECs в режиме реального времени PCR. (n No 3 в каждой группе). Бары представляют собой среднее для СЭМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Таблица 1. Пищеварительный буфер (1,5 мл)
 Фондовый Con.Заключительный Con.Объем
Либерасе ТМ5 мг/мл0,5 мг/мл150 ул
Dnase I1 мг/мл20 мкг/мл30 уль
ГЕПЕС1 M10 мМ15 уль
DMEM--1305 ул

Таблица 1: Рецепт буфера пищеварения.

Таблица 2. Праймер Последовательности
Имя генаВпередОбратный
Npr3TCCTGCAAATCATGTGGGGTTAGGAATCTTCCCAGCTCTCC
Cdh11ГТГААТГККККККТКГГКТГГГGTAATTCTGGGGCCCTTGC
Hapln1CCAGCTAAGTGGGACTCGAAGGGGCCATTCAGCTGGTGGATG
МгллCCCGGGGCAAAGACГААГАГАГКЦкТГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГ
Fabp4AGAAGTGGGGTGGCTTCGАКТКТГАККГАГАГАГАГАГАГАГАГА
Cd36GCAAACGACTGCGCAGGTCAACCCGGTCACTTGGTTCtCTGA
Cdh5ККАТТАГАГАКАКАКККККККККККККККККККККККККККTGTGGAACGTGTACTGTTGG
B-актинTCTGTGTGGATTGGTGGGGCTCCGGACTCATTACTTCCTGC

Таблица 2: Праймер Последовательности

Обсуждение

ЦЦО и ЕЭК различаются по происхождению, маркерам и функциям и, таким образом, могут играть уникальную роль в развитии и заболеваниях. Существующие протоколы эндотелиальной изоляции клеток ограничиваются макрососудистыми тканями, пренебрегая сбором ЕЭК, тем самым ограничивая изучение функций ЦИК и ЕЭК. Важно, чтобы изолировать и изучить эти две популяции самостоятельно, так как эти знания будут служить ссылкой на дифференциацию iPSCs в CECs и EECs для будущих исследований и облегчить изучение этих популяций клеток для потенциальных терапевтических целей для различных сердечных заболеваний. Этот новый протокол излагает метод изоляции EECs от внутренней поверхности и CECs от внешней поверхности желудочковой свободной стенки взрослых крыс.

В этом протоколе крайне важно очень точно контролировать время каждого шага. Поскольку количество EECs очень ограничено в ткани сердца крысы, мы свели к минимуму время пищеварения внутреннего слоя сердца, чтобы предотвратить повреждение клеток и, что более важно, загрязнение ЦИК. Немедленное добавление среднего решения ЕС для прекращения ферментатической реакции также очень важно для поддержания высокой жизнеспособности клеток. Красный гранулы, следующие за сбором клеток, предполагают наличие большого количества РБК. В зависимости от количества загрязнения РБК, для деградации РБК можно добавить 1-2 мл буфера лисиса РБК. Используя текущий протокол, мы смогли изолировать 105 EECs от шести крысиных сердец. Эти клетки могут быть посеяны на блюдо клеточной культуры для дальнейшего расширения и характеристики.

При подготовке ткани для свободного сбора стены, сердце было промыто HBSS, чтобы удалить большинство оставшихся RBCs. HBSS является рекомендуемой среде из-за его четкого внешнего вида, что позволяет визуализации клеток крови, в отличие от DMED содержащие фенол красный. Состав буфера пищеварения обеспечивает достаточное освобождение эндотелиальных клеток, где фермент пищеварения liberase полоски ткани подвергаются клетки, DNase I удаляет ДНК из мертвых клеток для содействия отслоение клеток, которые могут быть ингибированы клеевого качества ДНК, HEPES буфер балансирует рН, и DMEM является модифицированной базальной среды с более высокой концентрацией аминокислот и витаминов для лучшего поддержания клеток и содержит необходимые для активации кальция.

Согласно одноклеточному секвенированию РНК (scRNA-seq), полученному как от человека15, так и от сердца мыши10,было сообщено несколько маркеров, приписываемых конкретным популяциям ЕС. Мы выбрали некоторые из наиболее обогащенных генов для изучения чистоты изолированных EECs (т.е., Npr3, Cdh11, и Hapln1) и EECs (т.е., Mgll, Fabp4, и Cd36). По сравнению с маркерами q-Actin, Npr3, Cdh11и Hapln1 продемонстрировали повышенное экспрессию в EECs по сравнению с ЦИКами. Аналогичным образом, выражение Mgll, Fabp4, и Cd36 маркеров было больше в ЦСПо по сравнению с EECs. Однозначно выраженные маркеры для каждого образца соответствуют маркерам, характерным для EECs и CECs соответственно, что свидетельствует об успешной изоляции.

Однако нынешний протокол не может исключить перекрестное загрязнение между двумя популяциями ЕС во время изоляции, даже при тщательно контролируемом последовательном пищеварении. Таким образом, некоторые маркеры поверхности клеток могут быть применены для дальнейшей очистки. Например, NPR3 обычно маркируетэндокардий 10,в то время как APJ может проследить большинство CECs16. Поскольку эти два маркера выражены на поверхности клетки, они могут быть использованы для флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS), а также антитела, используемые для дальнейшей очистки различных популяций EC. Кроме того, человек15 и мышь10 сердце scRNA-seq может подтвердить обогащение Npr3 в EECs, и Cd36 потенциально может быть использован для очистки ЦИК.

В заключение, представленный протокол излагает независимую изоляцию EECs и CECs от крысиного сердца. Всесторонняя идентификация клеточных свойств, включенных путем изоляции клеток, может быть использована для значительных приложений вниз по течению.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы высоко ценят доктора Лингли Ванг за ее помощь в составлении протокола о животных и кафедру педиатрии в Стэнфорде за поддержку инфраструктуры. Эта работа была поддержана NIH/NHLBI K99 HL135258 (до M.G.).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтансульфоновая кислота (HEPES)Gibco15630080
1M 15мл ТубыEppendorf0030122151
50мл ТубыNunc339652
5мл ПробиркиEppendorf30119401
ACK Лизирующий буферGibcoA1049201
Anti-CD31 PEMiltenyi Biotec130-115-505
Анти-ПЭ микрогранулыMiltenyi Biotec130-048-801
Бычий сывороточный альбумин (БСА)Miltenyi Biotec130-091-37610%
CFX384 Сенсорная система обнаружения ПЦР в реальном времениBio-rad1855485для количественной ПЦР
ДНК IWorthingtonLK 0031721 мг/мл в воде
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco10313021
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2)LonzaCC-3162EC Medium
Этилендиаминетрауксусная кислота (ЭДТА)Invitrogen155750200,5 M
Сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS) X1Gibco14025092
Hard-Shell 384-луночные ПЦР-планшеты, тонкостенные, с юбкой, прозрачные/белыеBio-radHSP3805Для количественной ПЦР
высокопроизводительный набор для обратной транскрипции кДНКApplied Biosystems4368813
Liberase TMSigma Aldrich54011190015 мг/мл MACS
LsКолонка Miltenyi Biotec130-042-401Для изоляции КЭ MACS
MultiStandMiltenyi Biotec130-042-302Для изоляции КЭ
Microseal 'B' PCR Plate Герметизирующая пленка, адгезивная, оптическаяBio-radMSB1001для qPCR
Узкие щипцыF.S.T11002-12Для забора сердца
Нейлоновое стерильное ситечкоFalcon35234040 мм
Фосфатный буферный раствор (PBS) X1Gibco1001023
PowerUp SYBR Green Master MixApplied BiosystemsA25780Для qPCR
Quick-RNA Microprep KitZymo ResearchR1050Для экстракции РНК
S& T Щипцы - SuperGrip TipsF.S.T00632-11Для забора сердца
Косоглазие Ножницы - Карбид вольфрамаF.S.T14574-11Для забора сердца
Весенние ножницы Vannas - MicroserratedF.S.T15007-08Для забора сердца

Ссылки

  1. Gladka, M. M., et al. Single-Cell Sequencing of the Healthy and Diseased Heart Reveals Cytoskeleton-Associated Protein 4 as a New Modulator of Fibroblasts Activation. Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).
  2. Koren, C. W., Sveinbjornsson, B., Smedsrod, B. Isolation and culture of endocardial endothelial cells from Atlantic salmon (Salmo salar) and Atlantic cod (Gadus morhua). Cell and Tissue Research. 290 (1), 89-99 (1997).
  3. Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).
  4. Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
  5. Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases. Nature Reviews in Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).
  6. Zhang, H., Lui, K. O., Zhou, B. Endocardial Cell Plasticity in Cardiac Development, Diseases and Regeneration. Circulation Research. 122 (5), 774-789 (2018).
  7. Yu, S. Y., et al. Isolation and characterization of human coronary artery-derived endothelial cells in vivo from patients undergoing percutaneous coronary interventions. Journal of Vascular Research. 46 (5), 487-494 (2009).
  8. Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
  9. Kamimura, T., Yamagishi, T., Nakajima, Y. Avian coronary endothelium is a mosaic of sinus venosus- and ventricle-derived endothelial cells in a region-specific manner. Development, Growth and Differentiation. 60 (2), 97-111 (2018).
  10. Zhang, H., et al. Endocardium Minimally Contributes to Coronary Endothelium in the Embryonic Ventricular Free Walls. Circulation Research. 118 (12), 1880-1893 (2016).
  11. Kinlay, S., Libby, P., Ganz, P. Endothelial function and coronary artery disease. Current Opinion in Lipidology. 12 (4), 383-389 (2001).
  12. Jacques, D., Bkaily, G. Endocardial endothelial cell hypertrophy takes place during the development of hereditary cardiomyopathy. Molecular and Cell Biochemistry. 453 (1-2), 157-161 (2019).
  13. Grossfeld, P., Nie, S., Lin, L., Wang, L., Anderson, R. H. Hypoplastic Left Heart Syndrome: A New Paradigm for an Old Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 6 (1), (2019).
  14. Li, Y., et al. Down-regulated RGS5 by genetic variants impairs endothelial cell function and contributes to coronary artery disease. Cardiovascular Research. , (2019).
  15. Miao, Y., et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals Endocardial Defect in Hypoplastic Left Heart Syndrome. bioRxiv. , (2019).
  16. Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CD31

Похожие статьи