Здесь представлен протокол количественной оценки инфекционных вирусных частиц с использованием мониторинга электрического импеданса инфицированных клеток в режиме реального времени. Практическое применение данного метода представлено путем количественной оценки распада вируса гриппа А при различных физико-химических параметрах, имитирующих условия окружающей среды.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мониторинг выживаемости вируса гриппа вне хозяина с помощью анализа клеток в режиме реального времени
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Методы количественной оценки вирусных частиц представляют собой критический аспект многих вирусологических исследований. Хотя существует несколько надежных методов, они либо отнимают много времени, либо не могут обнаружить небольшие вариации. Здесь представлен протокол для точной количественной оценки вирусного титра путем анализа вариаций электрического импеданса инфицированных клеток в режиме реального времени. Клеточное сопротивление измеряется с помощью биосенсоров микроэлектрода золота, расположенных под клетками в микропластинах, величина которых зависит от количества клеток, а также их размера и формы. Этот протокол позволяет в режиме реального времени анализировать пролиферацию, жизнеспособность, морфологию и миграцию клеток с повышенной чувствительностью. Также приведен пример практического применения путем количественной оценки распада вируса гриппа А (IAV), представленного различным физико-химическим параметрам, влияющим на вирусную инфекционность с течением времени (т.е. температуре, солености и рН). Для таких приложений протокол снижает необходимую рабочую нагрузку, а также генерирует точные количественные данные инфекционных вирусных частиц. Это позволяет сравнивать склоны инактивации между различными IAV, что отражает их способность сохраняться в данной среде. Этот протокол прост в исполнении, обладает высокой воспроизводимостью и может быть применен к любому вирусу, вызывающему цитопатические эффекты в клеточной культуре.
Введение
Передача вируса зависит от сочетания нескольких факторов. Для вируса, секретируемого в окружающей среде, его передача также зависит от способности сохраняться в условиях вне хозяина. Таким образом, изучение вирусной инактивации в целом является решающим шагом в оказании помощи национальным органам здравоохранения и лицам, формирующим политику, в осуществлении мер контроля и биобезопасности.
За последнее десятилетие значительно возросли знания о персистенции вируса в естественных и лабораторных условиях. В случае вирусов гриппа А (IAV) их пути передачи представляют вирусные частицы в широком диапазоне условий окружающей среды. В частности, о....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Обрабатывать все вирусы гриппа в соответствии с соответствующими требованиями уровня биобезопасности (BSL-2 или выше в зависимости от подтипа). Используйте штаммы IAV с низкой историей прохождения (менее 5x на клетках MDCK), чтобы обеспечить низкую вариацию между экспериментами.
1. Подготовка реагентов и исходных материалов
- Подготовка клеток MDCK и стерильной клеточной культуральной среды
- Культивируйте клетки собачьей почки Мадина-Дарби (MDCK) в модифицированной среде Орла (MEM), дополненной 10% инактивированной теплом сывороткой для телят плода (FCS) и антибиотиками (100 единиц / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина)....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Исходные данные, полученные через 120 ч при различных концентрациях клеток MDCK, от 15 000 до 120 000 клеток на лунку, показаны на рисунке 1. Через 24 ч измерения CI показывают, что клетки в колодцах, засеянных 30 000 клеток, все еще находились в экспоненциальной фазе роста, и эта концентрация клеток использовалась для дальнейших экспериментов. Рисунок 2 иллюстрирует линейную корреляцию между значениями CIT50 и начальной множественностью инфекции. Кле.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
RTCA - это технология на основе импеданса, которая все чаще используется для мониторинга свойств клеток в режиме реального времени, таких как клеточная адгезия, пролиферация, миграция и цитотоксичность. В этом исследовании способность этой технологии оценивать выживаемость IAV вне хозяина демонстрируется путем измерения наклона инактивации вируса. Привередливые методы, такие как TCID50 и анализы бляшек, заменяются объективной оценкой жизнеспособности клеток в режиме реального времени, что отражает цитопатическ.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,25%Трипсин | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 см<суп>2 колба для культуры тканей | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 пластин) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-пластины доступны в различной упаковке |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | Приборы xCELLigence RTCA S16 доступны в различных форматах (16-луночные, 96-луночные, одно- или многопланшетные) |
Ссылки
- Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. Routes of influenza transmission. Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, Suppl 2 42-51 (2013).
- Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
