Методическая статья

Червь выравнивания и Worm_CP, два трубопровода с открытым исходным кодом для выпрямления и количественной оценки флуоресценции изображения данных, полученных от Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/61136

⸱

28 мая 2020 г.

 ,  ,  ,  , 
1Babraham Institute

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Worm-align/Worm_CP - это простой рабочий процесс FIJI/CellProfiler, который может быть использован для выпрямления и выравнивания образцов Caenorhabditis elegans и оценки анализа изображений на основе всего червя без необходимости предварительного обучения. Мы применили Worm-align/Worm_CP к количественной оценке теплового шока индуцированного выражения у живых животных или липидных капель в фиксированных образцах.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Проблема, часто встречаемая при получении данных изображений от фиксированных или анестезировал C. elegans является то, что черви крест и кластера со своими соседями. Эта проблема усугубляется увеличением плотности червей и создает проблемы для визуализации и количественной оценки. Мы разработали рабочий процесс на основе FIJI, Worm-align, который может быть использован для создания одно- или многоканаленных монтажей выбранных пользователем, выпрямленных и выровненных червей из необработанных данных изображений C. elegans. Worm-align — это простой и удобный рабочий процесс, который не требует предварительной подготовки ни пользователя, ни алгоритма анализа. Монтажи, созданные с Worm-выравнивание может помочь визуальный осмотр червей, их классификации и представления. Кроме того, выход Worm-align может быть использован для последующей количественной оценки интенсивности флуоресценции у одиночных червей, либо непосредственно на FIJI, либо на других платформах программного обеспечения для анализа изображений. Мы демонстрируем это, импортируя выход Worm-align в Worm_CP, конвейер, который использует программное обеспечение CellProfiler с открытым исходным кодом. Гибкость CellProfiler позволяет включить дополнительные модули для скрининга с высоким содержанием. В качестве практического примера мы использовали конвейер на двух наборах данных: первый набор данных — это изображения червей-репортеров теплового шока, которые выражают зеленый флуоресцентный белок (GFP) под контролем промоутера неуязвимого гена hsp-70 тепловогоудара, а вторым набором данных являются изображения, полученные от фиксированных червей, окрашенных для жировых запасов флуоресцентным красителем.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Относительно простой организм, нематод C. elegans, является чрезвычайно полезной моделью системы для изучения заболеваний человека. Около 38% генов в геноме C. elegans имеют функциональные аналоги у человека1,2. Одной из уникальных характеристик C. elegans является то, что он является оптически прозрачным, что позволяет легко получить доступ к информации in vivo относительно (суб) клеточной экспрессии флуоресцентных репортеров в тканях. Это делает C. elegans главным моделью организма для экранов с высоким содержанием с помощью платформ на основе изображений3. Однако одна из проблем, которая часто усложняет эти исследования, заключается в том, что при визуализации плотных популяций червей они, как правило, пересекаются и группируются, что делает сравнение между отдельными червями сложным, затуманив анализ изображений ниже по течению и количественную оценку.

Существующие решения, которые преодолевают эту проблему, как правило, полагаются на оптимизацию протокола культивирования и визуализации, например, с помощью микро-жидкостиустановок 4, что позволяет одиночных червей, которые будут захвачены вотдельных изображений 5,6. Другие применили алгоритмы машинного обучения, позволяющие распознавание одиночных червей, даже в слипаемой популяции. Прекрасным примером последнего является WormToolbox, который является модульным расширением платформы анализа изображений с открытым исходным кодом, CellProfiler7. WormToolbox предлагает высокопрофильное и высококонтентное решение для анализа C. elegans,и явно выигрывает от его включения в CellProfiler, так как дополнительные модули анализа могут быть легко включены. Хотя WormToolbox поставляется с предварительно обученной моделью (DefaultWormModel.xml), для каждого нового приложения обычно требуется переподготовка алгоритма машинного обучения. Онлайн-уроки о том, как это сделать, доступны на Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). Несмотря на это, установка и использование WormToolbox требует значительных инвестиций во времени для начинающих пользователей.

Здесь мы описываем простой и экономически и эффективный по времени протокол к культуре, а также изображения популяций C. elegans. Для оценки отдельных червей на приобретенных изображениях мы разработали простой рабочий процесс на основе ФИДЖИ с открытым исходным кодом, названный Worm-align. Червь выравнивания могут быть использованы для создания одно- или многоканаленных монтажей выпрямленных и выровненных червей. Во-первых, пользователь должен вручную выбрать отдельных червей для анализа, нарисовав линию от головы до хвоста. Worm-align будет использовать этот выбор для обрезки выбранных червей из изображения обзора, и генерировать монтаж, в котором выбранные черви выпрямляются и выравниваются, чтобы облегчить визуальное сравнение и представление.

Кроме того, выход Worm-align может быть использован для последующей количественной оценки интенсивности флуоресценции у одиночных червей, либо непосредственно на FIJI, либо на других платформах программного обеспечения для анализа изображений. Мы демонстрируем это, импортируя выход Worm-align в Worm_CP, конвейер, который использует программное обеспечение CellProfiler с открытым исходным кодом. Гибкость CellProfiler позволяет включить дополнительные модули для скрининга с высоким содержанием. Мы использовали трубопровод Worm_CP для количественной оценки реакции теплового удара, хорошо сохраненный защитный механизм, который refolds белков, которые неправильно из-за стрессоров, таких каквысокая температура 8. В частности, мы применили трубопровод к червям, несущим интегрированный многопрофильный трансген, где промоутер теплошокового неопровержимого гена hsp-70 (C12C8.1) приводит в движение зеленый флуоресцентный белок (GFP)9. Мы также использовали трубопровод Worm_CP на фиксированных животных, которые были помечены флуоресцентным красителем, который визуализирует липидные капли (LDs), основной орган хранения жира в C. elegans10. Хотя этот рабочий процесс не имеет пропускной способности, предлагаемой WormToolBox, он является удобной и простой альтернативой для визуальной презентации и анализа экспериментов на основе изображений C. elegans.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Фиксация червей для изображения жира с использованием флуоресцентного красителя для липидных капель (BODIPY)10

  1. Подготовь синхронизированную популяцию C. elegans путем отбеливания в соответствии со стандартнымипроцедурами 2. Плита около 1000 L1-стадии червей на 9 см нематод роста средств массовой информации (NGM) пластины в состоянии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Больше червей подготовлены, чем на самом деле количественно в конце, в связи с потерей червей при обработке.
  2. Для изображения животных на стадии молодых взрослых (около 50 ч после L1 покрытие при 20 градусов по Цельсию), мыть каждый 9 см пластины с 15 мл M9 в конической трубе, центрифуга при 252 х г в течение 1 мин, и удалить супернатант.
  3. Повторите стирку и оставьте 1 мл M9 над гранулами червей.
  4. Передача 1 мл M9, содержащих червей в 2 мл низким содержанием белка связывания микроцентрифуг трубки, используя низкие советы удержания.
  5. Спин вниз на 252 х г в микроцентрифуге в течение 1 мин и удалить супернатант, будьте осторожны, чтобы не коснуться червя гранулы в нижней части трубки.
  6. Для мониторинга содержания жира с использованием 4,4-дифлюоро-1,3,5,7,8-пентаметил-4-бора-3а,4а-диаза-с-индацеин (БОДИПИ) окрашивание10 (Таблица материалов), исправить червей либо путем добавления 0,5 мл 60% изопропанола червя гранулы в течение 3 мин11, или путем добавления 2 мл ледяного метанола в течение 10 мин. Для обеих процедур, инвертировать трубку каждые 30 с.
    ВНИМАНИЕ: Если метанол является выбранным реагентом фиксации, этот шаг должен быть предпринят в дымовой капот из-за его токсичности.
  7. Удалите как можно больше фиксации, не касаясь червя гранулы и добавить 1 мл M9. Пусть черви оседают на дне трубки в течение 3-5 минут.
  8. Вымойте снова с 1 мл M9, пусть черви оседают и удалить супернатант, оставляя около 50 йл в трубке. Защитите трубку с помощью зажима.
  9. Заморозить-трещины червей, погружая надежно закрытой трубки в жидком азоте, а затем в теплую ванну воды при 40 градусов по Цельсию.
  10. Повторите шаг 1.9 еще раз.
  11. Добавьте 0,5 мл БОДИПИ, разбавленного в M9 при конечной концентрации 1 мкг/ЛЬ, и поместите на ротатор при комнатной температуре в течение 1 ч.
  12. Через 1 ч, пусть черви оседают на дне трубки в течение 3-5 минут.
  13. Удалите супернатант и добавьте 1 мл M9.
  14. Пусть черви оседают на дне и удалить супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, можно спина вниз на 252 х г в течение 1 мин, так как это, кажется, не влияет на морфологию.
  15. Добавьте 0,5 мл M9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если фиксатор 60% изопропанола, черви могут быть использованы только в течение 48 ч. Если фиксатором является метанол, черви должны быть использованы в течение 24h.

2. Подготовка агарозы колодки для установки червей

ПРИМЕЧАНИЕ: Критический шаг при подготовке агарозы площадку, чтобы получить площадку регулярной толщины. В противном случае, черви по всей площадке будет в различных координационных плоскостей, что делает его сложно получить целенаправленное изображение более широкого поля зрения.

  1. Приготовьте 2% агарозные прокладки, добавив 0,2 г агарозы в 10мл стерилизованногоH 2 O в стакане или конической колбе. Тепло в микроволновой печи в течение 30 с, пока агароза начинает кипеть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не перегревайте и не останавливайся, как только появляются пузырьки; в противном случае это увеличивает вязкость агарозы, что затрудняет достижение желаемой толщины колодки.
  2. После того, как агароза расплавится, обойтись капли расплавленной агарозы в центре микроскопа стеклянный слайд с помощью 1000 йл наконечник пипетки с его самого конца вырезать. Немедленно, но деликатно, держите другой стеклянный слайд очень близко к капле агарозы и отпустите его на агарозу, чтобы сформировать площадку регулярной толщины для лучших результатов микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Освобождение верхнего слайда с высоты не только сформирует пузырьки, но и приведет к неравномерной площадке. Кроме того, можно также использовать два стеклянных слайда фланговых слайд с площадкой, с тонким слоем ленты на каждом слайде.
  3. После минимум 2-3 минут, аккуратно удалите верхнюю горку. Используя сторону верхнего слайда, обрежьте площадку, чтобы сделать ее квадратной формы. Намонтировать червей в течение 5 минут, чтобы предотвратить площадку от высыхания перед использованием.

3. Монтаж фиксированных червей для визуализации

  1. Создайте микропипюту для рта, расширяя тонкую стеклянную капиллярную часть в пламени горелки Bunsen(рисунок 1A). После расширения в пламени, разбить капилляр на две части(рисунок 1B). Выберите наиболее адекватные, как правило, самый длинный, и проверить, является ли конец капилляра открыт, пытаясь аспирировать воду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если жидкость не попадает в капилляр, она слишком тонкая или заблокированная. Аккуратно вырезать конец капилляра с ножницами, избегая резки слишком много, как черви будут аспирированы, если отверстие слишком большой.
  2. Подключите стеклянный капилляр из шага 3.1 в капиллярныйадаптер (рисунок 1C),связанный с 6-мм силиконовой трубкой и подключите другой конец 6-мм силиконовой трубки в фильтр 0,2 мкм, прикрепленный к 3-мм силиконовой трубке на другомконце (рисунок 1С). Подключите наконечник фильтра 1 мл(рисунок 1C) в свободный конец 3-мм силиконовой трубки для аспирации жидкости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтр 0,2 мкм добавляется между ртом экспериментатора и капилляром, чтобы обеспечить максимальную безопасность экспериментатора. Аналогичный раствор используется для рот микропипеты, используемые для обработки эмбрионовмыши 12. Изменение фильтра (как правило, каждые несколько месяцев), если рот micropipette не аспирации жидкости больше.
  3. Используя микропипюты во рту под микроскопом вскрытия, удалите как можно больше жидкости вокруг червя гранулы фиксированных червей(рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трубопровод супернатант из использования ручного micropipette может быть использован в качестве альтернативы рот пипетки в шагах от 3,1 до 3,3, чтобы удалить как можно больше супернатантов, как это возможно. Добавьте 6 мкл монтажной среды. Мы находим, однако, что этот метод не работает так эффективно, потому что чрезмерная жидкость в колодки создает разреженную плотность червя, что делает изображение более трудоемким. Возобновление шага 3.6. Посмотрите на дно трубки и убедитесь, что пипетка не аспирировать червей.
  4. Быстро добавьте 10 МКЛ монтажнойсреды (таблицаматериалов) к нижней части трубки.
  5. Промыть 10 йл наконечник в PBS со следами моющего средства (0,01% Тритон), чтобы предотвратить червей от прилипания к бокам пластиковой наконечник пипетки. Вырезать самый конец кончика с ножницами.
  6. Передача 8 МКЛ монтажной среды, содержащей червей, на агарозную площадку, подготовленную в шаге 2.3. Под микроскопом аккуратно встряхните горку, чтобы избежать перекрытия червей.
  7. Обложка падение монтажной среды на агарозной площадке с 18 мм х 18 мм крышки(рисунок 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Меньшие крышки являются предпочтительными, поскольку они оказывают меньшее давление на червей. Держите крышку с парой пинцета и применить один край крышки против агарозы площадку, прежде чем аккуратно хранение крышки с пинцетом.

4. Монтаж живых червей для визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы изображение живых червей, они должны быть обездвижены на площадке. Один из способов достижения этой цели заключается в том, чтобы парализовать их с агонистом никотиновых рецепторов: levamisole (Таблица материалов).

  1. Pipette 3'4 йл 3 мМ левамизол растворяется в M9 на агарозной площадке, созданной в шаге 2.3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Там должно быть достаточно жидкости объем, что черви не друг на друга, но не слишком много жидкости, что черви слишком редки на площадку. Опытные сборщики червей могут использовать 3 МКЛ левамизола. Менее опытные сборщики, возможно, потребуется добавить больший объем левамизола, так что левамизол не полностью испаряется.
  2. Выберите 30-50 червей на состояние в каплю левамизола.
  3. Обложка капли левамизола на агарозной площадке с 18 мм х 18 мм крышки. Изображение червей в пределах 1 ч, как парализующий агент в конечном итоге приведет к смерти червей.

5. Изображения слайдов с эпифлуоресценции микроскопа

  1. С агарозой площадку равномерной толщины, изображение всех червей на слайде сразу с помощью 6 х 6 или 7 х 7 большое изображение, например, с 20x цель флуоресцентного микроскопа. Если толщина колодки не овея, приобрети несколько меньших 3 х 3 или 4 х 4 изображения одного и того же слайда.
  2. Используйте те же настройки для интенсивности флуоресценции и времени экспозиции для всех условий. Отрегулируйте каждый параметр, чтобы соответствовать слайду, который имеет яркую интенсивность, гарантируя, что нет насыщения пикселей. Для получения конкретных инструкций по приобретению изображений следуйте инструкциям производителя микроскопа.

6. Создание монтажных изображений выровненных одиночных червей с помощью конвейера Worm-align FIJI

  1. Установите пакет программного обеспечения для анализа изображений с открытым исходным кодом FIJI13/ImageJ14 https://imagej.net/Fiji. Если доступна предварительная установка FIJI, убедитесь, что она обновлена до версии 1.52a или позже, так как некоторые функции, используемые в макросах (например, функции таблицы), требуют этого. Скачать макрос Worm-align из Github: https://github.com/hannekeo/Worm-align.
  2. Откройте FIJI и запустите макрос Worm-align. Выполните Червь выравнивания, нажав плагины | Макрос | Вы бегите в главном меню-баре FIJI(рисунок S1). Теперь найдите скрипт Worm-align.ijm на компьютере.
  3. Макро инициализируется, спрашивая расположение изображений. Трубопровод будет работать как на одноканайных, так и на многоканаментных флуоресцентных изображениях(рисунок S2). Выберите папку ввода, и макрос автоматически создаст папку вывода, где все результаты будут сохранены(рисунок S3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы выбранная папка содержит только файлы изображений, так как наличие других форматов файлов приведет к с краху макроса. В идеале, только группа вместе изображения, которые были захвачены с теми же настройками микроскопа. Червь-выравнивание будет принимать много различных форматов файлов, в том числе nd2, czi, tif, rgb, jpg и png. Название папки вывода будет таким же, как папка ввода, с "_output" добавлен в качестве почтовой фикса, т.е. если папка ввода "изображения", выход будет найден в "images_output". Папка вывода будет содержать четыре субфолдера, в которых данные будут сохранены.
  4. Позвольте макросу открыть первое изображение в папке ввода и использовать его в качестве репрезентативного изображения для извлечения параметра для создания монтажа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Червь-выравнивание автоматически выберет первое изображение в папке ввода для создания настроек, которые будут применяться ко всем другим изображениям в папке. Если другое изображение считается более репрезентативным для набора данных, убедитесь, что это изображение выбрано путем сохранения копии изображения в папке ввода, изменяя имя так, чтобы теперь было у перечислено в верхней части списка (например, '0_RepresentativeImage').
  5. С помощью инструмента прямого рисования нарисуйте линию по ширине червя(рисунок S4) и используйте длину этой линии, чтобы определить высоту обрезанных областей для одиночных червей. Для каждого канала укажите имя, таблицу осмотра (LUT), настройки интенсивности (B и C) и следует ли включить его в монтаж (рисунок S4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры записываются и сохраняются в файле настроек, настройках.csv, расположенных в подсобном подсобном производстве CellProfiler папки вывода.
  6. После того, как все настройки были захвачены, пользователю показано, как будут выглядеть изображения после применения применяемых настроек(рисунок S5). Отметьте верхнюю коробку, если параметров достаточно. Выберите параметры для генерации монтажа (удалите клещей, если не требуется): 1. Создать монтаж выбранных червей для каждого изображения, или 2. Создать комбинированный монтаж, в котором все черви, выбранные на всех изображениях в папке ввода будут объединены в один монтаж. Нажмите OK, чтобы выполнить остальную часть макроса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если верхняя коробка не отмечена перед нажатием 'OK', макрос будет повторно использовать настройку, так что настройки изображения могут быть оптимизированы.
  7. Конвейер Worm-align теперь открывает все изображения в папке ввода. Для каждого изображения, рисовать линии на продольной оси всех червей, которые будут включены в монтаж и / или количественно (Рисунок 4 и рисунок S6) с помощью инструмента "сегментированная линия" (на основной бар меню FIJI). Для обеспечения надлежащего выравнивания червя, рисовать линии последовательно с головы до хвоста (или наоборот), и по всей длине червя (см. примеры "хороший" и "плохой" рисунок линии на рисунке 4B).
  8. Добавьте каждую строку к менеджеру roi,нажав на Ctrl-T. Worm-align использует линии, добавленные в менеджер ROI, в сочетании с параметром ширины червя (установленный в шаге 6.4) для создания обрезанных изображений отдельных выбранных червей. Сбор линейных ROIs сохраняется в подфолдере «данных». Эта папка также содержит копию исходного изображения, показывающего строки, а также количество червя. Линии цветные с таблицей Glasbey_on_dark осмотра. Изображения выпрямленных червей сохраняются в single_worms субфолдере папки вывода. Кроме того, при выборе в шаге 6.6 этого протокола, Worm-выравнивание производит монтажи всех червей, выбранных в обзор изображения и / или для всех изображений обзора в папке ввода (см. рисунок 4C и рисунок S7). Эти монтажи можно найти в "выровненном" субфолдере папки вывода.

7. Анализ интенсивности флуоресценции одного червя с использованием вывода из Worm-align в автоматизированном трубопроводе CellProfiler

  1. Для обработки и анализа данных ниже по течению вывода Worm-align загрузите и установите пакет программного обеспечения для анализа изображений с открытым исходным кодом 'CellProfiler15,16 https://cellprofiler.org/. Скачать Worm_CP.cpproj с GitHub: https://github.com/hannekeo/Worm-align
    ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный здесь пример конвейера был построен с использованием CellProfiler2.2.0 и не может работать в более поздних версиях CellProfiler.
  2. Перед запуском конвейера Worms_CP.cpproj убедитесь, что все ожидаемые выходные изображения присутствуют в подфолдере CellProfiler исходной папки Worm-align: обработанная копия исходного изображения (названная: Original_), двоичная маска изображения популяции червей (названная: Mask_), линия маски линий, нарисованных на выбранных червях (названный: Lines_), и одно изображение, представляющее каждый из каналов, присутствующих в исходном изображении (названный по номеру).
  3. Чтобы количественно оценить интенсивность флуоресценции у одиночных червей, нажмите на модуль ввода изображений и просто перетащите папку вывода CellProfiler в окно, в которое говорят файлы и папки Drop. Если список изображений присутствует в предыдущем анализе, сначала удалите их, нажав правой кнопкой мыши в окне и выбрав список файлов Clear. Чтобы исключить файл "Настройки.csv" из списка изображений, выберите либо "Изображения только" или "Таможня" с "Расширение является tif, tiff.tif или ome.tiff' для настроек фильтра(рисунок S8).
  4. Нажмите на модуль ввода метаданных. Во втором методе извлечения нажмите на желтую папку и найдите субфолдер CellProfiler в папке вывода WormAlign (рисунок S9). Выберите файл Настройки.csv и свяжите настройки в файле с выходом CellProfiler, сопоставляя метаданные в файлах CSV с данными на изображениях (метаданные канала).
  5. Нажмите на модуль ввода NamesAndTypes и вставьте новое изображение для каждого канала исходного изображения, которое будет количественно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Уже присутствуют в примере трубопровода маска червя, два цветных изображения, линия маски и исходное изображение, и три серые изображения масштаба (зеленый и красный канал). Список в этом модуле должен быть скорректирован, если исходные изображения имеют более или менее каналов, чем пример изображения.
  6. Убедитесь, что название изображений в каждой колонке этикетки / маски / червей является правильным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Имена изображений на одной строке должны соответствовать одному и тому же исходному изображению для анализа. Если в процессе анализа изображений допущена ошибка, некоторые выходные изображения будут отсутствуют, а имена под меткой/маской/червями трех столбцов больше не будут соответствовать одному и тому же исходному изображению для каждой строки. Если это так, найдите, где ошибка.
  7. Настройка вывода Press View для выбора папки для сохранения вывода из Cellprofiler.
  8. Нажмите Режим тестирования запуска. Оказавшись в тестовом режиме, перепроверьте настройки конвейера, применив их к первому изображению в наборе данных, нажав на Run (который будет проходить через все активные модули в конвейере) или Step (который будет проходить через конвейер по одному модулю за раз).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Находясь в тестовом режиме, извлеченные измерения не будут экспортироваться, даже если модуль ExportToSpreadsheet присутствует (и активен) в конвейере.
  9. Как только конвейер выполнит так, как должен, нажмите режим exit Test Mode, а затем нажмите Analyze Images. Как в настоящее время настроено, Worms_CP будет (1) использовать изображение Mask_ для сегментации грубой маски червя и изображения Lines_ (рисунок S10A), чтобы выделить выбранных червей и производить одиночные маски червя (Рисунок S10C), (2) измерить интенсивность флуоресценции всех каналов, присутствующих в входных изображений в этих червей определены и замаскированы. Конвейер может также измерять интенсивность фона(рисунок S10B)и соответствующим образом корректировать все изображения (указанные порогом слова в названии измеренного параметра, например: Intensity_MeanIntensity_green_threshold), (3) измерять размер выбранных червей и (4) экспортировать все измеренные параметры(рисунок S10D).
  10. Откройте выход Worm_CP, состоящий из двух файлов csv, червей.csv и линий.csv которые сохраняются в выбранной папке вывода (см. рисунок S11). Эти файлы могут быть открыты в Excel или R (Studio) для постобработки и отчетности. Если требуется дополнительный выход, например на данные изображения, он может быть выбран в модуле ExportToSpreadsheet в конвейере.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Культивирование и визуализация C. elegans в соответствии с методом, описанным в этом протоколе, производит большие обзорные изображения популяций червей. Для облегчения визуального осмотра и классификации червей из этих изображений мы разработали Worm-выравнивание. Worm-align — это простой и удобный скрипт FIJI, который может быть использован для создания монтажей выпрямленных и выровненных червей. Черви выбираются из обзорных изображений, рисуя линию вдоль продольной оси червей. Каждому выбранного червя присваивается номер, обрезается и выпрямляется, и добавляется в монтаж. Монтажи могут быть сгенерированы на изображение или объединить все изображения из исходной папки ввода.

Как и ожидалось, выход трубопровода во многом зависит от качества линий, нарисованных поверх изображений. Чтобы проиллюстрировать этот момент, рисунок 4 показывает несколько примеров строк и их выход из Worm-align. Полная линия от головы до кончика хвоста производит правильно выровненный червь (помеченный как "хороший"). На рисунке 4 также показано, как отслеживание неточностей во время выполнения червя-выравнивания влияет на выход выравнивания. Из аннотированного монтажа, включенного в рисунок 4C, следует позаботиться, чтобы избежать следующих ошибок, так как они препятствуют правильному выравниванию червей:

  • Несогласованное отслеживание червя с головы до хвоста (с надписью "хвост к голове"). Это приводит к том, что черви ориентируются в разные стороны (т.е. голова к голове по сравнению с голова к хвосту) в выравнивании.
  • Неполная трассировка (помечена как "неполная"). Это приводит только к части червя, который был прослежен, чтобы быть обрезаны для монтажа.
  • Включение нескольких червей в один след (помеченный как "червь с двумя головами"). Это приводит к червей плюс (значительные разделы) их соседи вставляются в той же панели монтажа.
  • Добавление случайных строк к изображению (помечено как «случайное»). Это приводит к вставке случайных панелей в монтаж.

Для создания монтажа это не проблема, если две отдельные линии пересекаются (помечены как "пересекающиеся") или соединены на обоих концах червя (помечены "присоединился"), до тех пор, как каждая линия прослеживает всю длину отдельного червя: Червь выравнивания скрипт индивидуально и последовательно выбирает каждую строку ИП, культур и выпрямляет его, так что каждая панель в окончательном монтаже будет представлять собой одну строку. В случае пересекающихся червей однако, хотя полная длина выпрямленных червей появляются для червя "пересекая1" и червя "intersecting2" в монтаже (см. рисунок 5A-B), это явно заметно, что эти черви пересекают друг друга в оригинальном обзорном изображении. Таким образом, можно сделать вывод, что визуальная идентификация пересекающихся линий возможна из наложения изображения, найденного в подфолдере"данных" (рисунок 5A),а также из панелей отдельных червей в монтаже (рисунок 5B). Кроме того, любое перекрытие червей/линий может быть идентифицировано из таблицы контроля качества (КК), генерируемой для каждого обработанного изображения Червем-выравниванием, и сохранено в подфолдере данных. В этой таблице замыкаются три параметра для каждого из линейных ИИ, нарисованных на изображении (см. рисунок 5C):Из них длина указывает на длину линии рентабельности инвестиций, что является хорошим показателем размера червя; и номер Worm указывает порядок, в котором линии были нарисованы на обзоре изображения. Наконец, последний столбец указывает, существует ли перекрытие между червем/линией, о котором идет речь, и любым из других червей/линий, выбранных на изображении. В случае перекрытия число в этой колонке будет отличаться от числа, перечисленного в столбце worm. В сочетании с изображением наложения, таблица КК должна помочь исследователю принимать обоснованные решения о том, какие черви должны быть исключены из монтажа и/или количественной оценки.

Выход Червь-выравнивание может быть использован для последующей количественной оценки интенсивности флуоресценции у одиноких червей. В FIJI, линия ROIs может быть использована для измерения интенсивности флуоресценции в исходных данных изображения, например, путем выполнения простого скрипта FIJI ' Worm-quant.ijm', который также можно найти в репозитории Worm-aligny на Github. Кроме того, выход Worm-align может быть импортирован в программное обеспечение для анализа изображений третьих лиц. Мы демонстрируем это, импортируя выход Worm-align из двух наборов данных в Worm_CP, конвейер, который мы создали в CellProfiler. Worm_CP использует файлы в субфолдере 'CellProfiler' папки вывода Worm-align для тонкой настройки сегментации масок тех отдельных червей, выбранных во время выполнения макроса Worm-align. В частности, он использует маску линии (названный: Lines_), чтобы изолировать выбранных червей от популяции червей, замеченных в двоичной маске (названный: Mask_). Следует отметить, что линии, пересекающиеся на обзорномизображении (рисунок 5A),хотя и не являются проблемой для генерации монтажей, являются проблематичными для Worm_CP трубопровода. Почему это так, иллюстрируется на рисунке 5 D-E. Worm_CP использует маску линии(рисунок 5D), а не отдельные ROIs для оказания помощи в идентификации отдельных червей. Пересекающаяся линия, нарисованная второй во время выполнения Worm-align, накладывается на первую линию, и поэтому интенсивность вдоль этой линии будет иметь roi2, в том числе в бите, где линия 1 и 2 перекрывается. В результате CellProfiler будет сегментировать линию2 как один объект, но line1 как два объекта, которые разделены, где он пересекается с линией2. Это означает, что CellProfiler будет производить две (половина) маски червя для червя 'intersecting1' (Рисунок 5E). Самый простой способ исключить эти события из окончательного анализа (при необходимости) — определить количество червей пересекающихся червей из таблицы КК (субфолдер данных) и удалить измерения этих червей из выходных файлов CellProfiler. Пожалуйста, обратите внимание, что черви не обязательно будут выделены одинаковое число в FIJI и CellProfiler: Для идентификации номера червя FIJI в выходе CellProfiler посмотрите на значения Intensity_Max_Intensity в файле вывода 'Lines.csv'. Любое Intensity_Max_Intensity значение, которое отображается в таблице "Lines.csv" более одного раза на изображение, является признаком окупаемости этой линии, что приводит к перелому маски червя.

После того, как отдельные маски червя сегментированы, Worm_CP может измерить интенсивность флуоресценции в выбранных червей для всех записанных каналов. Все измерения взяты из исходных (сырых) данных изображения, хотя следует отметить, что CellProfiler автоматически перемасштабирововывал интенсивность пикселей по шкале 0-1. Это достигается путем деления значения интенсивности необработанных пикселей на максимально возможную интенсивность пикселей для изображения. В случае 8-битных изображений это значение составляет 255, а в случае 16-битных изображений это 65535. Поэтому значения интенсивности CellProfiler должны умножаться на максимально возможное значение интенсивности, чтобы восстановить значения, эквивалентные необработанным данным изображения. Выход Worm_CP состоит из двух файлов csv, 'worms.csv' и 'Lines.csv' которые сохраняются в выбранной папке вывода. При проверке этих файлов, ясно, что CellProfiler записывает большое количество параметров, связанных с интенсивностью флуоресценции. Из них Intensity_IntegratedIntensity соответствует общей флуоресценции на червя (т.е. сумме интенсивности флуоресценции во всех пикселях, которые истолковывают маску отдельного червя). Параметр Intensity_MeanIntensity средней интенсивности флуоресценции у отдельного червя (т.е. средней интенсивности флуоресценции на пиксель для всех пикселей, содержащихся в отдельном черве). В связи с случайным возникновением (малых) ошибок в сегментации червь маски рекомендуется, чтобы средние измерения интенсивности используются при сравнении флуоресценции измерений отдельных червей между двумя условиями. Если вы хотите вычесть фоновую флуоресценцию из количественных мер, используйте measurments, названные MeanIntensity_Threshold.

Мы использовали трубопровод Worm_CP для количественной оценки интенсивности флуоресценции от фиксированных животных, которые были помечены флуоресцентным красителем, который включает в липидные капли (LDs) (Рисунок 6). Для проверки количественной оценки флуоресценции из трубопровода Worm-align/Worm_CP мы количественно околимленную интенсивность флуоресценции в том же наборе червей из набора данных BODIPY либо трубопроводом Worm-align/Worm_CP, либо ручной количественной оценкой в FIJI/ImageJ. Ручная количественная оценка была выполнена на FIJI/ImageJ путем обхода каждого червя, а также темной фоновой зоны на каждом изображении. Интенсивность флуоресценции была измерена в менеджере рентабельности инвестиций, и значение, измеренное для фона изображения, было вычтено из измерения флуоресценции червя каждого червя,как описано 17. Мы сравнили диких червей типа (WT) N2 с мутантами dbl-1(nk3), которые демонстрируют снижение содержания липидных капель18. Как и ожидалось, зеленая флуоресценция интенсивность значительно снижается между WT и dbl-1(nk3) червей с обоими методами(рисунок 6A,B). Примеры выровненных червей можно наблюдать на рисунке 6C,D. Содержание липидных капель снижается на 17% (p-value'lt;0.0001, неоплаченный т-тест) между WT и dbl-1(nk3) с помощью ручной количественной оценки, и на 14% (p-value-0.0051 неоплаченный т-тест) с помощью трубопровода Worm_CP. Снижение содержания липидных капель наблюдается здесь, в dbl-1(nk3) с обоими методами количественной оценки в соответствии слитературой 18. Это показывает, что количественная оценка приобретенных изображений флуоресценции с помощью Worm_CP CellProfiler сравнима с ручной количественной оценкой.

Мы также использовали Worm_CP для количественной оценки реакции теплового удара в живых червей, выражаюющих GFP под контролем теплового удара неодобоваемого гена hsp-70 (C12C8.1)9. На рисунке 7 показаны репрезентативные изображения живых C. elegans, несущих теплоотзвукий hsp-70 (C12C8.1)p::Репортер GFP. При отсутствии теплового стресса черви не вызывают экспрессии GFP(рисунок 7A,B). Однако, когда черви подвергаются короткому тепловому удару в 30 мин при температуре 34 градусов по Цельсию, они вызывают выражение GFP(рисунок 7C,D). Уровни экспрессии GFP с тепловым шоком и без него количественно определены на рисунке 7E.

В нынешнем виде Worm_CP является очень основным трубопроводом. Тем не менее, этот подход позволяет более точную сегментацию отдельных масок червя, что позволяет более точную количественную оценку интенсивности флуоресценции у тех червей, отобранных из изображения. По этой причине мы предпочитаем этот подход грубой количественной оценке в FIJI, используя только линейные маски. Кроме того, CellProfiler предлагает преимущество, что дополнительные модули анализа могут быть легко включены в конвейер. Например, для набора данных, который смотрит на содержание липидных капель, вставка дополнительных модулей в конвейер Worm_CP может исследовать липидные капли номера и интенсивность флуоресценции отдельных капель в этих червей, выбранных в обзоре изображений.

figure-results-1
Рисунок 1: Создание рот микропайп . Стеклянная капиллярная удлиняется в пламени горелки Bunsen(A), пока не обеспечивает тонкие удлиненные конечности (B). Расширенный стеклянный капилляр затем подключен к адаптер кусок рот микропипюты. (C)Схема микропайетта рта. Микропипет для рта был собран со стеклянным капилляром, подключенным к адаптеру. Силиконовая трубка диаметром 6 мм соединяет адаптер с фильтром шприца диаметром 0,2 мкм, используемым для обеспечения безопасности. Другой конец фильтра крепится к 3-мм силиконовой трубке, заканчиваемой наконечником фильтра 1mL. Экспериментатор может аспирировать через кончик фильтра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Стремление жидкости, окружающей червя гранулы, используя рот микропипюты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Добавление крышки на червей, лежащих на агарозной площадке Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Примеры выпрямления червя с помощью Червь-выравнивание на флуоресценции изображения, приобретенные у живых животных, несущих транскрипционного репортера жира-7p::GFP в кишечнике и красный маркер совместной инъекции в глотке (myo-2p::tdtomato). (A)Скриншот композитного изображения, приобретенного на флуоресцентном микроскопе живых червей в день 3 взрослой жизни. Изображение было открыто с помощью Worm_align и линии были нарисованы вдоль продольной оси червей с помощью Worm-выравнивания. (B)Скриншот того же изображения, что и в (A), с примерами прокомментировал хороший и плохой рисунок линий вдоль оси червей, используя Червь выравнивания. (C)Примеры линий, нарисованных поверх червей, которые могут подняться до неправильно выровненных червей. Червь выравнивания выход червей, выбранных в B. Изображения были приняты с 20x цель на перевернутый широкоугольный микроскоп (см. Таблицу материалов) с зеленой флуоресценции интенсивности No 1, воздействия 60 мс и красный флуоресценции интенсивности No 8, экспозиция 60 мс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Примеры выпрямления червя с помощью Червя-выравнивания на пересекающихся червей. (A) Скриншот композитного изображения, приобретенного на флуоресцентный микроскоп живых червей в день 3 взрослых животных проведения транскрипционного репортера жира-7p::GFP в кишечнике и красный маркер совместной инъекции в глотке (myo-2p::tdtomato). Пересекающиеся черви помечены как "пересекающиеся1" и "пересекающиеся2", в то время как не пересекающиеся черви помечены как "хорошие3" и "хорошие4". (B) Монтаж, созданный Червь-выравнивание представляющих выпрямленных червей, выбранныхв( A ). В монтаже заметно, что черви 1 и 2 пересекались на исходном изображении (черви помечены как "пересекаясь1" и "пересекаясь2"). (C)Скриншот таблицы КК от Worm-align, который позволяет обнаружить случаи, когда черви пересекаются. Длина: длина линии рентабельности инвестиций; номер червя: порядок, в котором были нарисованы линии; последний столбец указывает, существует ли перекрытие между червем/линией интереса и любым другим червем. В этом примере червь в первом сыром (червь номер1) перекрывается с червем номер 2, о чем свидетельствует число "2" в последней колонке. (D) Скриншот линий, нарисованных с Червь-выровнять на четырех червей, выбранных вA.( E ) Скриншот масок, порожденных Червь-выровнять на четырех червей, выбранных в, показывая, как маски для двух пересекающихся червей отображаются. В этом случае две маски вместо одной теперь соответствующи червю "intersecting1". Изображения были сделаны с 20x цель на перевернутом широкоугольный микроскоп (см. Материалы таблице) с зеленой флуоресценции интенсивности 1, воздействия 60ms и красный флуоресценции интенсивности No 8, экспозиция 60 мс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Worm_CP измеряет флуоресценцию так же точно, как и ручная количественная оценка. Сравнение флуоресценции количественно молодых взрослых червей фиксированной и окрашенных для содержания липидных капель с зеленым флуоресцентным красителем BODIPY, используя либо Worm_CP трубопровода (A) или ручной количественной оценки (B). Содержание липидных капель WT и dbl-1 (nk3) отслеживалось путем фиксации и окрашивания животных БОДИПИ, которые перекалибровывания в жирные кислоты липидных капель (см. протокол А). Молодые взрослые животные были зафиксированы с 60% изопропанола и окрашенных с BODIPY для 1h. Тот же набор животных был количественно либо с помощью трубопровода Worm_CP (см. шаг 7) или ручной количественной оценки в соответствии со стандартнымипроцедурами 17. (A)Количественная оценка флуоресценции с использованием Worm_CP трубопровода. WT: n'22 животных, средняя флуоресценция 1.016 (A.U) ± 0.206 SD; dbl-1(nk3): n'25 животных, средняя флуоресценция 0.8714 (A.U) ± 0.126 SD. Неоплаченный t-test. b) Ручная количественная оценка флуоресценции. WT: n'22 животных, средняя флуоресценция 1,048 ± 0,153 SD; dbl-1(nk3): n'25 животных, средняя флуоресценция 0,8632 ± 0,109 SD. Неоплаченный т-тест. (C, D) Пример представителя или выход Worm-Align для WT(C) и dbl-1(nk3) (D) животныхвыпрямленных с трубопроводом Worm-align. Изображения были сделаны с 20x целью на перевернутом микроскопе widefield (см. Таблицу материалов) с зеленой интенсивностью флуоресценции 2, exposure-60ms. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 7: Пример количественной оценки флуоресценции и выравнивания живых червей из изображений флуоресценции живых червей, несущих транскрипционные репортер hsp-70(C12C8.1)p::GFP после теплового удара. (A) После короткого теплового удара (30 мин при температуре 34 градусов по Цельсию), молодые взрослые черви были восстановлены при температуре их выращивания (25 градусов по Цельсию) и установлены затем изображены 3,5h после теплового удара. Около 30 червей были количественно после теплового удара с помощью червя выравнивания трубопровода. (A-B) Примеры выровненных червей, которые не подверглись тепловому удару. (C-D) Примеры тепловых червей, несущих hsp-70 (C12C8.1)p::GFP с помощью Worm-align. (E) показывает GFP Средняя интенсивность (параметр Worm_CP: MeanIntensity_Threshold) ВТ молодых взрослых червей, выращенных, без теплового удара или при воздействии теплового удара (34 кк в течение 30 мин). Изображения были сделаны с целью 20x на перевернутом микроскопе widefield (см. таблицу материалов) с зеленой интенсивностью флуоресценции 1, выдержкой 60ms; нет HS: n-12, HS: n-32. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная цифра 1: Расположение на FIJI, где после установки можно найти макрос Червя-выравнивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Выбор папки, содержащей все изображения, сделанные с одинаковыми настройками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Поколение 4 субфолдеров в папке вывода в FIJI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Рисование линии по ширине червя и настройки канала для монтажа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная цифра 5: Предварительный просмотр изображения с примененными настройками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная цифра 6: Рисование линии вдоль продольной оси червей, представляющих интерес для включения в монтаж и/или количественную оценку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 7: Монтаж выбранных червей в папке вывода, под папкой "выровнены". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 8: Очистка предыдущих изображений из предыдущего анализа в Cell Profiler. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная диаграмма 9: Импорт метаданных в CellProfiler из папки вывода Worm-align, выбрав подсвое .csv настройки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 10: Конвейер CellProfiler Worm_CP.cpproj использует изображения Lines_ для сингла выбранных червей (A) и производит одиночные маски червей, представляющих интерес (C). Трубопровод также измеряет фоновую интенсивность (B). Перспективы всех параметров, измеренных конвейером, Worm_CP.ccproj, которые экспортируются в файле csv (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная цифра 11: Выбор выходных файлов в "ExportToSpreadsheet в Worm_CP.cpproj. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Worm-align — это конвейер обработки изображений на основе FIJI, который легко генерирует монтажи выбранных пользователем червей, в которых черви выпрямляются и выравниваются, чтобы помочь визуальному сравнению, классификации и представлению. Хотя эта функция также предлагается некоторыми существующими инструментами, в частности, модуль WormToolbox в CellProfiler7, Червь-выравнивание требует сравнительно небольшой опыт предварительного анализа изображений: Пользователям нужно только проследить эти черви они хотели бы выбрать для монтажа (и анализа). Хотя отслеживание червей на необработанных данных изображения является простым процессом, особенно когда сенсорный экран компьютера или планшета доступна, это имеет первостепенное значение, что линии правильно обращается вдоль продольной оси червей. Неполные линии, которые следуют только часть червя, приведет к частичной червей в монтаж (т.е. червей отсутствует головы хвостовых концов) и частичной сегментации маски во время анализа CellProfiler. Кроме того, если линии из двух отдельных червей крест, черви не будут правильно обработаны в монтаже выравнивания червя, а также для количественной оценки флуоресценции. Для контроля качества изображение наложения выделения строки на исходное изображение сохраняется в папке данных вместе с таблицей КК. Из них проблемные линии, которые приведут к неправильно сегментированных червей могут быть легко определены и исключены из монтажа и / или последующего анализа.

Хотя прямой вклад экспериментатора в выборе червей, возможно, кажется немного трудоемким, он представляет собой явное преимущество рабочего процесса по сравнению с другими в экспериментах, где черви из разных стадий развития присутствуют в том же изображении: Черви могут быть выбраны во время "отслеживания шаг", с изложением только те черви, которые находятся в правильном этапе развития. Кроме того, черви могут быть отфильтрованы с помощью вывода из Worm_CP на основе либо длины линии трассировки, или области маски сегментации, как надежные показатели длины / размера червей. Возможно, алгоритмы машинного обучения могут бороться за распознавание червей на разных стадиях развития, так как их размер и внешний вид в изображениях DIC настолько различны.

Выход Worm-align может быть использован для последующей количественной оценки интенсивности флуоресценции у одиночных червей, либо непосредственно на FIJI, либо на других платформах программного обеспечения для анализа изображений. Мы продемонстрировали это, импортируя выход Worm-align в простой конвейер CellProfiler (Worm_CP), который позволяет количественно оценить многоканаканалистную интенсивность флуоресценции у тех отдельных червей, которые были выбраны во время работы конвейера Worm-align. Мы выбрали этот подход из-за гибкости программного обеспечения CellProfiler: Это просто включить дополнительные модули в конвейер для анализа дополнительных функций в отдельных червей (например, измерения размера липидных капель, или стресс гранулы, ядра, митохондрии). Кроме того, одиночные маски червя потенциально могут быть использованы для обучения новой модели для WormToolbox7.

Основные преимущества этого метода в том, что он быстрый и требует простой установки крепления червя. Этот метод быстрее, поскольку он не требует тратить время на изучение работы программного обеспечения, ни работает наборы обучения через алгоритммашины 7. Кроме того, этот метод работает с живыми или фиксированными червями, просто установленными на обычных агарозных прокладках. Нет необходимости использовать сложные микрофлюидные камеры, разработанные другими методами5,6.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Кристиана Ланкта в BIOCEV (Прага, Чешская Республика) за то, что он учил нас технике микропайпета для установки фиксированных червей, а д-р Фатима Сантос и д-р Дебби Драге (Debbie Drage) поделились установкой безопасности на микропипете рта. Мы также благодарим Франческу Ходж за редактирование рукописи, Шарлин Мердок и Babraham институт объектов за их поддержку. OC поддерживается ERC 638426 и BBSRC «BBS/E/B000C0426».

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AgaroseMeLford Biolaboratories LtdMB1200
Аспираторная трубкаSigma-AldrichA5177для создания ротовой микропипетки (см. шаг протокола)
Стакан
BODIPY 493/593InvitrogenD3922стоковый раствор приготовлен в ДМСО при 1 мг/мл
ЦентрифугаMSE MISTRAL 1000
Коническая колба
КрышкаКлинок VWR631-0120
Фильтр 0.2 & микро; m для шприцаSartrius16534-KФильтр, для создания ротовой микропипетки (см. шаг протокола)
Изопропанол
левамизола гидрохлоридSigma-AldrichBP2123mM раствор приготовлен путем растворения левамизола в M9
Жидкий азотЖидкий азот установка
Low Retention Tip 1000&микро; LStarlabS1182-1830
МетанолVWR химикаты20847.307
Предметные стекла для микроскопа, MENZEL GLASSERThermo ScientificBS7011/2
МикроскопNikonEclipse Ti
Микроволновая печьDelongi
M9приготовленная в лаборатории по 15
NGM >9 см, приготовленные в лаборатории в соответствии 15
PBSприготовлены в лаборатории
Пробирка Protein LoBind 2 млEppendorf22431102
Triton SIGMAT9284-500ML
Кольцевые колпачкиSIGMA-ALDRICHZ611247-250EAстеклянные микрокапиллярные трубки для создания рта микропипетка (см. шаг протокола)
RotatorStuart Scientific
Силиконовая трубка полупрозрачнаяНаучная лаборатория ПоставщикиTSR0600200Pстенка 6,0 мм x 2,0 мм - для создания ротовой микропипетки (см. шаг протокола)
Стерилизованная вода H2OMilliQ, автоклавированная в лаборатории
10&микро; L TipsStarlabS1120-3810
200&микро; L НаконечникиStarlabS1120-8810
1000&микро; L TipsStarlabS1122-1830
15mL Центрифужная трубкаCORNING430791
Vecta ShieldVECTOR94010монтажная среда для защиты от выцветания (H-1000) без DAPI
,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shave, D. D., Greenwald, I. OrthoList: A compendium of C. elegans genes with human orthologs. PLoS One. 6 (5), 20085(2011).
  2. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  3. Letizia, M. C., et al. Microfluidics-enabled phenotyping of a whole population of C. elegans worms over their embryonic and post-embryonic development at single-organism resolution. Microsystems & Nanoengineering. 4 (6), (2018).
  4. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , (2013).
  5. Atakan, H. B., et al. Automated Platform for Long-Term Culture and High-Content Phenotyping of Single C. elegans Worms. Scientific Reports. 9 (1), 120-135 (2019).
  6. Atakan, H. B., Cornaglia, M., Mouchiroud, L., Auwerx, J., Gijs, M. A. M. Automated high-content phenotyping from the first larval stage till the onset of adulthood of the nematode Caenorhabditis elegans. Lab on a Chip. 19 (1), 120-135 (2018).
  7. Wählby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nature Methods. 9 (7), 714(2012).
  8. Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. Biology. 76 (9), 91-99 (2012).
  9. Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS Genetics. 9 (4), (2018).
  10. Klapper, M., et al. Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches. Journal of Lipid Research. 52 (6), 1281-1293 (2011).
  11. Wählby, C., et al. and low-throughput scoring of fat mass and body fat distribution in C. elegans. Methods. 68 (3), 9(2014).
  12. Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis. Nature Protocols. 2 (3), 739-752 (2007).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18, 529(2017).
  15. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome. 7, 100(2006).
  16. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
  17. Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans. Science. 335 (6064), 82-85 (2012).
  18. Clark, F. J., Meade, M., Ranepura, G., Hall, D. H., Savage-Dunn, C. Caenorhabditis elegans DBL-1/BMP Regulates Lipid Accumulation via Interaction with Insulin Signaling. G3. 8 (1), Bethesda. 343-351 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

C elegansWorm alignWorm CPImageJ FijiCellProfiler

Похожие статьи