Методическая статья

Флюорометрический анализ на основе Click-Химии для аполипопротеин N-ацилтрансферазы от характеристики ферментов до высокопроизводительного скрининга

2.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61146

⸱

13 мая 2020 г.

 ,  , 
1Institut Pasteur, Unité Biologie et génétique de la paroi bactérienne, Paris, France ; CNRS, UMR 2001 « Microbiologie intégrative et Moléculaire », Paris, France ; INSERM, Équipe Avenir, Paris, France

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлен чувствительный флуоресцентный анализ для мониторинга активности аполипопротеина N-ацилтрансферазы с использованием диацилглицерилпептида и алкин-фосфолипидов в качестве субстратов с клик-химией.

Аннотация

Липопротеины из протеобактерий посттрансляционно модифицируются жирными кислотами, полученными из мембранных фосфолипидов под действием трех интегральных мембранных ферментов, в результате чего образуются триацилированные белки. Первый этап в пути модификации липопротеинов включает перенос диацилглицерильной группы из фосфатидилглицерина в пролипопротеин, что приводит к диацилглицериловому пролипопротеину. На второй стадии сигнальный пептид пролипопротеина расщепляется, образуя аполипопротеин, который в свою очередь модифицируется третьей жирной кислотой, полученной из фосфолипида. Эта последняя стадия катализируется аполипопротеином N-ацилтрансферазой (Lnt). Путь модификации липопротеинов имеет важное значение в большинстве γ-протеобактерий, что делает его потенциальной мишенью для разработки новых антибактериальных агентов. Здесь описан чувствительный анализ для Lnt, который совместим с высокопроизводительным скринингом малых ингибирующих молекул. Фермент и субстраты представляют собой мембранно-внедренные молекулы; поэтому разработка теста in vitro не является простой. Это включает в себя очистку активного фермента в присутствии моющего средства, наличие алкин-фосфолипидов и субстратов диацилглицерильных пептидов, а также условия реакции в смешанных мицеллах. Кроме того, чтобы использовать тест активности в высокопроизводительной системе скрининга (HTS), прямое считывание реакционного продукта предпочтительнее связанных ферментативных реакций. В этом флуорометрическом ферментном анализе алкин-триацилированный пептидный продукт становится флуоресцентным посредством реакции щелчка-химии и обнаруживается в формате многоязычной пластины. Этот способ применим к другим ацилтрансферазам, в которых используются субстраты, содержащие жирные кислоты, включая фосфолипиды и ацил-КоА.

Введение

Бактериальные липопротеины характеризуются ковалентно связанными жирными кислотами на их амино-концах, через которые они закрепляются в мембранах 1,2. Зрелая часть белка очень разнообразна по структуре и функции, тем самым объясняя роль липопротеинов в различных биологических процессах в оболочке бактериальной клетки.

Липопротеины модифицируются жирными кислотами, полученными из фосфолипидов, после введения в цитоплазматическую мембрану. Пролипопротеины содержат фирменный мотив, липобокс, который содержит инвариантный остаток цистеина, который становится ацилированным и первой аминокислотой в зрелом белке. Первая стадия этого пути катализируется пролипопротеином фосфатидилглицерином: :d яцилглицерилтрансферазой (Lgt), которая переносит диацилглицерильную группу из фосфатидилглицерина в пролипопротеин через тиоэтерную связь между диацилглицерилом и цистеином. Сигнальная пептидаза II (Lsp) расщепляет сигнальный пептид от диацилглицерильного пролипопротеина, в результате чего образуется аполипопротеин, который закрепляется в мембране через его диацилглицерильный фрагмент. Третья и последняя стадия катализируется аполипопротеином N-ацилтрансферазой (Lnt), которая добавляет жирную кислоту из положения sn-1 фосфолипида на аполипопротеин, в результате чего образуется триацилированный зрелый липопротеин (рисунок 1)3. Реакция Lnt представляет собой двухступенчатую реакцию пинг-понга, в которой образуется стабильный промежуточный продукт тиоэфирного ацилового фермента. Побочный продукт лизофосфолипида высвобождается до ацилирования аполипопротеинового субстрата на второй стадии реакции.

Специфичность фосфолипидного субстрата определяется в анализе Lnt на основе сдвига подвижности N-ацилдиацилглицерилового пептида на высоком процентном содержании Tris-Tricine Urea SDS-PAGE4. Фосфолипиды с небольшими полярными головными группами, насыщенными [sn-1] и ненасыщенными [sn-2], были предпочтительными субстратами4. Анализ сдвига геля не подходит для обширных кинетических исследований аполипопротеина N-ацилтрансферазы или для HTS для идентификации ингибирующих молекул. Click-химия с использованием алкиновых жирных кислот была успешно использована для изучения модификации липопротеинов у бактерий5 и метаболизма жирных кислот у эукариот6. Недавно сообщалось, что анализ пальмитоилирования Ras пальмитоилирования in vitro выявил ингибиторы7.

В способе, описанном здесь, очищенный активный Lnt в моющем средстве инкубируют с субстратами в смешанных мицеллах с образованием алкин-триацилированного пептида, который впоследствии обнаруживается флуоресцентной спектрометрией.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Ферментная и субстратная подготовка

  1. Очистка фермента
    1. Производят и очищают фермент Lnt от моющих солюбилизированных мембран, как описано ранее 4,8. Вкратце, индуцируют экспрессию гена lnt-стрептокка, кодирующего Lnt с помощью С-концевой стрептококковой метки, при OD600 0,6 безводным тетрациклином (200 нг/мл) при 37 °C в течение 16 ч.
    2. Собирайте клетки центрифугированием при 4000 х г в течение 10 мин и выбрасывайте супернатант.
    3. Повторное суспендирование ячейки гранулы в буфере WA (20 мМ Tris-HCl pH 8, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ ЭДТА) до 100OD 600 единиц на мл.
    4. Разбейте ячейки двумя проходами через французский пресс нажимной ячейки при 10 000 фунтов на квадратный дюйм.
    5. Удалите неповрежденные клетки и мусор центрифугированием при 13 000 х г в течение 20 мин. Сохраните супернатант и выбросьте гранулу.
    6. Центрифугируют супернатант при 120 000 х г в течение 60 мин и собирают мембранные везикулы (полупрозрачные гранулы коричневого цвета). Выбросьте супернатант.
    7. Солюбилизируют интегральные мембранные белки из мембранной гранулы с 1% (мас./об.) н-додецил-β-D-мальтозидом (ДДМ) в буфере WA в течение 30 мин при комнатной температуре (RT). Центрифуга и удаление нерастворимого материала при 120 000 х г в течение 30 мин. Используйте надводную фракцию для очистки.
    8. Очистите Lnt-стрептококк на колонке аффинной хроматографии (см. Таблицу материалов) и колонне фильтрации геля S400 (см. Таблицу материалов), как описано Nozeret et al.8.
    9. Хранят очищенный фермент в буфере WA, содержащем 0,05% DDM и 10% глицерина при -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фермент стабилен более 5 лет.
  2. Получение алкин-фосфолипидных и биотинилированных субстратов фибробласт-стимулирующего лиганда (FSL-1-биотина)
    1. Аликвота 100 мкл специально синтезированного алкина-ПАПЫ (1-гексадек-15-иноил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, см. Таблицу материалов) солюбилизируется в хлороформе в пробирки по 1,5 мл.
    2. Проткните трубки шприцем и испарите хлороформ в скоростном вакууме при РТ в течение 2 ч. Хранить сухие образцы фосфолипидов при температуре -20 °C.
    3. Растворяют алкин-ПОУП в 0,1% Тритоне Х-100 при 500 мкМ перед применением. Добавьте 3-минутный этап обработки ультразвуком на водяной бане в RT для солюбилизации алкина-POPE при необходимости.
    4. Повторное суспендирование FSL-1-биотина в воде при 445 мкМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оба раствора можно хранить при температуре -20 °C в течение не менее 2 месяцев.

2. Трубчатый анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: На 1-й день устанавливают реакцию Lnt в пробирках объемом 1,5 мл (стадия 2.1) и покрывают 96 пластин скважин стрептавидином (стадия 2.2).

  1. Приготовление смеси реагентов и ферментативная реакция
    1. Для стандартного анализа Lnt смешайте алкин-POPE (конечные 50 мкМ из запаса 500 мкМ) и FSL-1-биотин (конечная концентрация 50 мкМ из запаса 445 мкМ) в реакционном буфере Lnt (50 мМ Tris-HCl pH 7,2, 150 мМ NaCl, 0,1% тритона X-100, содержащего 1% BSA) при конечном объеме 18 мкл в пробирках 1,5 мл. Выполняйте все условия в трех экземплярах.
    2. Соникировать субстратную смесь (приготовленную на стадии 2.1.1) в течение 3 мин на ультразвуковой водяной бане и инкубировать при 37°С в течение 5 мин до добавления фермента Lnt (стадия 2.1.3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: MTSES (натрий (2-сульфонатоэтил)метанетиосульфонат), тиол-специфический реагент, ингибирует Lnt8. Добавьте 10 мМТЭС (100 мМ запасного раствора в 100% ДМСО) в реакционные трубки (этап 2.1.1), которые будут использоваться в качестве отрицательных контрольных образцов. Отрегулируйте объем реакционного буфера Lnt таким образом, чтобы общий объем составлял 18 мкл.
    3. Добавляют активный (1 нг/мкл, соответствующий 17,2 нМ) или неактивный Lnt (C387S) (2 мкл 10 нг/мкл запаса в буфере WA, содержащем 0,05% DDM) и смешивают с подложками (стадия 2.1.2) путем пипетки вверх и вниз.
    4. Инкубируют реакцию при 37 °C в течение 16 ч в термомиксаторе с нагретой крышкой.
  2. Стрептавидиновое покрытие 96 плит скважин
    1. Готовят стоковый раствор стрептавидина по 2 мг/мл вH2O.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор можно хранить при -20 °C до 6 месяцев.
    2. Из исходного раствора готовят 10 мкг/мл стрептавидина в воде в качестве рабочего раствора. Добавьте 100 мкл раствора в каждую лунку 96-луночной пластины. Связывают стрептавидин с пластиной путем инкубации при 37 °C в течение ночи без крышки для воздушной сушки скважин.

ПРИМЕЧАНИЕ: На 2-й день выполните химию щелчков (этап 2.3), свяжите реакционную смесь Lnt с пластинами, покрытыми стрептавидином (этап 2.4), а также обнаружите флуоресценцию и проанализируйте результаты (этап 2.5).

  1. Щелк-химическая реакция
    1. Готовят исходные растворы Азидо-ФАМ (5 мМ в ДМСО), TCEP (Трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид; 50 мМ, приготовленный в воде), TBTA (Tris[(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил]амина; 2 мМ в трет-бутаноле:DMSO (4:1)) и CuSO4∙5H2O(50 мМ свежеприготовленный вH2O).
    2. В пробирках объемом 1,5 мл, содержащих реакционную смесь Lnt, приготовленную на стадии 2.1.4, выполняют щелк-химию путем добавления реагентов в следующем порядке: 0,2 мкл запаса Азидо-ФАМ (конечная концентрация 50 мкМ), 0,4 мкл запаса TCEP (конечная концентрация 1 мМ), 0,2 мкл запаса TBTA (конечная концентрация 0,02 мМ).
    3. Вихрь раствора в течение 5 с. Затем добавляют 0,4 мкл запаса CuSO4 (конечная концентрация 1 мМ). Вихрь снова в течение 5 с. Инкубируют образцы в темноте при RT в течение 1 ч.
  2. Связывание реакционной смеси Lnt с пластинами, покрытыми стрептавидином
    1. Промывайте лунки пластин со стрептавидиновым покрытием после ночной инкубации со стадии 2.2.2 3x с 200 мкл PBS-T1 (PBS, содержащий 0,05% Tween-20).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины стрептавидина можно использовать немедленно или хранить в сухом виде при температуре 4 °C.
    2. Перенесите 18 мкл из щелково-химической смеси со стадии 2.3.3 в скважину в пластине, покрытой стрептавидином, из 96 скважин и добавьте 100 мкл PBS-T1 для связывания N-ацил-FSL-1-биотина-FAM продукта со стрептавидиновыми пластинами.
    3. Используйте биотин-флуоресцеин (0,26 мкМ из запаса 3,1 мМ в ДМСО) в качестве положительного контроля для связывания стрептавидина и считывания флуоресценции.
    4. Инкубировать пластины на RT в течение 1 ч в темноте в термомиксаторе, встряхивая при 300 об/мин.
    5. Выполните этапы ручной мойки 96 плит скважины с помощью многоканальной электронной пипетки следующим образом: шесть промывок с 200 мкл PBS-T2 (PBS, содержащий 1% Tween-20), три промывки пипеткой, три промывки с 200 мкл PBS, три промывки с пипеткой.
  3. Обнаружение и анализ флуоресценции
    1. Добавьте 200 мкл PBS и запишите флуоресценцию при 520 нм в считывателе флуоресцентных микропластин. Сохраняйте результаты в программном обеспечении для работы с электронными таблицами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Биотин-флуоресцеин используется в качестве положительного контроля для связывания стрептавидина и обнаружения флуоресценции при 520 нм. Ожидается воспроизводимое считывание 30 000–40 000 а.е. с 0,26 мкМ биотин-флуоресцеина. Все образцы анализируются в трех экземплярах, включая контрольные.
    2. Рассчитайте стандартное отклонение для каждой реакции и рассчитайте P-значения для отрицательных контрольных и положительных образцов с помощью непарного t-теста с использованием статистического программного обеспечения.

3. Многоязычный пластинчатый анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: На 1-й день наладили реакцию Lnt в 384 плитах скважины (стадия 3.1) и покрыли 384 пластины скважин стрептавидином (этап 3.2).

  1. Приготовление смеси реагентов и ферментативная реакция
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество реагентов и фермента уменьшается по сравнению с трубчатым анализом, и реакция Lnt выполняется непосредственно в 384 пластинах скважины. Это позволяет использовать меньше материала и сократить шаги, которые могут быть дополнительно автоматизированы.
    1. Смешайте субстраты следующим образом: алкин-ПОУП (конечная концентрация 50 мкМ из запаса 500 мкМ) и FSL-1-биотин (конечные 50 мкМ из запаса 500 мкМ) в реакционном буфере Lnt (50 мМ Tris-HCl pH 7,2, 150 мМ NaCl, 0,1% тритона X-100, содержащего 1% BSA) в объеме 13,5 мкл на реакцию на скважину в формате пластины 384 лунки. Выполняйте все условия в трех экземплярах. Рассчитать общее количество реагентов, необходимых для количества реакций, которые должны быть выполнены (т.е. 5 184 мкл на одну пластину скважины 384).
    2. Наносите ультразвуком субстратную смесь в течение 3 мин на ультразвуковой водяной бане.
    3. Аликвота 13,5 мкл субстратной смеси на скважину в плите 384 скважины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве отрицательного контроля на скважину можно добавить 10 мМТЭС (625 мМ запасного раствора в 100% ДМСО). Отрегулируйте объем буфера Lnt (шаг 3.1.1) для достижения конечного реакционного объема 13,5 мкл.
    4. Инкубировать при 37 °C в течение 5 мин до добавления фермента Lnt (стадия 3.1.5).
    5. Добавьте 0,5 нг/мкл (что соответствует 8,6 нМ) активного фермента Lnt или неактивный вариант (C387S) (1,5 мкл из запаса 5 нг/мкл в буфере WA, содержащем 0,05% DDM) в буфере Lnt (50 мМ Tris-HCl pH 7,2, 150 мМ NaCl, 0,1% Triton X-100, 1% BSA) к каждой скважине, содержащей реакционную смесь со стадии 3,1.3. Смешайте реагенты путем пипетки вверх и вниз. Общий реакционный объем составляет 15 мкл.
    6. Запечатайте пластину пластиковой фольгой для многоскважинных пластин.
    7. Инкубировать при 37 °C в течение 16 ч в термомиксаторе с нагретой крышкой.
  2. Стрептавидиновое покрытие 384 плиты скважины
    1. Используйте 75 мкл стрептавидина (10 мкг/мл вH2O) со стадии 2.2.2 для покрытия скважин из 384 скважинной пластины. Пусть стрептавидин связывается с пластиной путем инкубации при 37 °C в течение ночи без крышки для воздушной сушки скважин.

ПРИМЕЧАНИЕ: На 2-й день выполните химию щелчков (этап 3.3), свяжите реакционную смесь Lnt с пластинами, покрытыми стрептавидином (этап 3.4), обнаружите флуоресценцию и проанализируйте результаты (этап 3.5).

  1. Щелк-химическая реакция
    1. Готовят исходные растворы Азидо-ФАМ (1,2 мМ в ДМСО), TCEP (трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид; 24 мМ, приготовленные вH2O), TBTA (Tris[(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил]амина; 0,48 мМ в трет-бутаноле:DMSO (4:1)) и CuSO4∙5H2O(24 мМ, свежеприготовленные вH2O).
    2. Смешайте три химических реагента: смесь Azido-FAM (конечная концентрация 50 мкМ), TCEP (конечная 1 мМ) и TBTA (конечная 0,02 мМ), каждая по 0,75 мкл в конечном объеме 2,25 мкл на лунку. Рассчитать необходимый объем на 384 плиты скважины (т.е. использовать 864 мкл при использовании всех скважин 384 плиты скважины). Энергично перемешать.
    3. Добавляют 2,25 мкл раствора реагента на скважину непосредственно к завершенной реакции Lnt в пластине 384 скважины со стадии 3.1.7.
    4. Смешивание путем пипетки вверх и вниз с помощью многоканальной электронной пипетки.
    5. Добавьте CuSO4 (0,75 мкл из запаса 24 мМ для конечной концентрации 1 мМ) и перемешайте путем пипетки вверх и вниз с помощью многоканальной электронной пипетки.
    6. Инкубировать на RT в течение 1 ч в темноте.
  2. Связывание реакционной смеси Lnt с 384 пластинами скважины со стрептавидиновым покрытием
    1. Промывайте колодцы пластин со стрептавидиновым покрытием после ночной инкубации со стадии 3.2.1 1x с 85 мкл PBS-T1.
    2. Перенесите 11 мкл реакции щелкающей химии из каждой лунки инкубационной пластины со стадии 3.3.6 на пластину, покрытую стрептавидином, со стадии 3.4.1 для связывания продукта N-ацил-FSL-1-биотин-FAM с пластинами стрептавидина.
    3. Добавьте 64 мкл буфера PBS-T1.
    4. Включить биотин-флуоресцеин (0,19 мкМ из запаса 3,1 мМ в ДМСО) в качестве контроля для связывания с скважинами, покрытыми стрептавидином.
    5. Инкубировать 384 пластины скважины на RT в течение 1 ч в темноте в термомикшере, встряхивая при 300 об/мин.
    6. Мойте пластины с помощью автоматизированной посудомоечной машины следующим образом: 10 стирок с 85 мкл PBS-T2, пластины встряхивают между промывками; 5 стирок с 85 мкл PBS, пластины встряхивают между стирками.
  3. Обнаружение и анализ флуоресценции
    1. Добавьте PBS (85 мкл) и запишите флуоресценцию в считывателе флуоресцентных микропластин при 535 нм.
    2. Анализируйте данные, как описано (шаг 2.5.2).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В реакции Lnt жирная кислота sn-1 из фосфолипидов переносится на диацилглицерилпептид, в результате чего образуется зрелый триацилированный пептид8. Анализ in vitro Lnt, описанный здесь, предназначен для использования фосфолипидов, содержащих алкиновую жирную кислоту (alkyne-POPE) и FSL-1-биотин в качестве субстратов, что приводит к образованию алкина-FSL-1-биотина. При щелковой химической реакции с азидо-ФАМ этот продукт должен быть флуоресцентно меченым и обнаруживаться флуоресцентной с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол для анализа Lnt, описанный здесь, основанный на флуоресцентном обнаружении триацилированного продукта, является чувствительным и воспроизводимым. Специфическое и эффективное связывание биотина со стрептавидином является ключевым элементом анализа. Субстрат Alkyne-POPE, оставшийся после завершения реакции Lnt, также флуоресцентно маркируется FAM, но эффективно удаляется после связывания на пластинах стрептавидина несколькими шагами промывки. Кроме того, добавление DMSO не влияет на активность Lnt и не влияет на а...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Фабриса Агу и Аликс Бушарла из Платформы химиогеномного и биологического скрининга, Центра технологических ресурсов и исследований (C2RT) в Институте Пастера в Париже за полезные предложения по протоколу, всех членов подразделения BGPB за поддержку и научные обсуждения и Саймона Легуда за критическое прочтение рукописи. Работа финансировалась Глобальными инициативами по уходу Института инфекционных заболеваний Карно и Института микробов и здоровья Карно (15 CARN 0017-01 и 16 CARN 0023-01).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ä kta Очиститель FPLC системаGE HealthcareNAЧистота: NA
Lnt
очистка алкина-POPEAvanti Polar Lipids900414PЧистота: >99%
Lnt субстрат
Azido-FAMLumiprobeA4130Чистота: 100% (чистый)
Клик-реактив
BioPhotometer PlusEppendorfN/AЧистота: NA
OD 600 нм
BioTek ELX 405 Выбрать пластинчатую шайбуBioTekN° серия 115800, n° материал 405 ВыбратьЧистота: NA
Ступени мойки
биотин-флуоресцеинSigma53608Чистота: ≥ 90%
Контроль флуоресценции
Пентагидрат сульфата меди(II)SigmaC3036Чистота: ≥ 98%
Реагент
Click DDMAnatraceD310AЧистота: ≥ 99% β+α; < 15% α
Моющее средство для очистки Lnt
Диметилсульфоксид (ДМСО)InvitrogenD12435Чистота: безводная
Сольбилизация Реактив
клик Электронная пипетка Voyager 8 каналов 0,5-12,5 мклINTEGRA4721Чистота: NA
Работа с реагентами
Французская ячейка давленияН/ДН/ДЧистота: NA
Разрушение клеток
FSL-1-биотинМикроколлекции ЭМСL7030Чистота: NA
Lnt субстрат
Greiner Bio-One 384-луночный стандартный полистирольный микропланшет CELLSTARGreiner781091Чистота: NA
Черный с прозрачным дном (чтение вверх или снизу)
Greiner Bio-One 96-луночный стерильный полистирольный планшет, высокая связкаGreiner655097Чистота: NA
Черный с прозрачным дном (чтение вверх или снизу)
Считыватель микропланшетов Infinite M1000 proTecanN/AЧистота: NA
Флуоресцентное детектирование
MTSES (натрия (2-сульфонатоэтил)метантиосульфоната)AnatraceS110MTЧистота: ~100%
Тиол-специфический ингибитор
Оптически прозрачный клей Seal SheetsThermo ScientificAB-1170Чистота: NA
Фольга для герметизации многолуночной пластины
Sephacryl S400 HR 16/60 гель фильтрационная колонкаGE HealthcareGE28-9356-04Чистота: NA
Lnt очистка
StrepTactin Sepharose 50 %IBA Biotechnology2-1201-010Чистота: NA
Lnt очистка
стрептавидинаSigmaS4762-1MGЧистота: ≥ 13 ед./мг белок
Биотинсвязывающий
TBTA (трис[(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил]аминSigma678937Чистота: 97%
Click реагент
TCEP (трис(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлоридSigma75259Чистота: ≥ Реагент 98%
Click Reagent
TECAN Infinite F500TecanN/AЧистота: NA
Флуоресцентная детекция
TECAN Infinite M1000 proTecanN/AЧистота: NA
Флуоресцентная детекция
Термомиксер CEppendorf5382000015Чистота: NA
Крышка с подогревом
Triton X-100Sigma93443Чистота: 10% в H2O
Lnt реакционный буфер
Ультра центрифугаBeckman LCN/AЧистота: NA
Фракционирование клеток

Ссылки

  1. Buddelmeijer, N. The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why. FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).
  2. Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).
  3. Jackowski, S., Rock, C. O. Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).
  4. Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).
  5. Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters. Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).
  6. Thiele, C., et al. Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry. ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).
  7. Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation. Science Reports. 7, 41147(2017).
  8. Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Science Reports. 9 (1), 15978(2019).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  10. Mao, G., et al. Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase. Nature Communication. 7, 10198(2016).
  11. Vogeley, L., et al. Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin. Science. 351 (6275), 876-880 (2016).
  12. Wiktor, M., et al. Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis. Nature Communication. 8, 15952(2017).
  13. Noland, C. L., et al. Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).
  14. Lu, G., et al. Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase. Nature Communication. 8, 15948(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Azido FAMZ

Похожие статьи