Method Article

Введение точечных мутаций в плюрипотентные стволовые клетки человека с помощью бесшовного редактирования генома

DOI:

10.3791/61152

⸱

May 10th, 2020

 ,  , 
1MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем подробный метод бесшовного редактирования генов в плюрипотентных стволовых клетках человека с использованием донорской плазмиды на основе piggyBac и мутанта Cas9 nickase. Две точечные мутации были введены в экзон 8 локуса ядерного фактора гепатоцитов 4 альфа (HNF4α) в эмбриональных стволовых клетках человека (hESCs).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Специально разработанные эндонуклеазы, такие как управляемые РНК кластеризованные регулярно интерраспространенные короткие палиндромные повторы (CRISPR)-Cas9, обеспечивают эффективное редактирование генома в клетках млекопитающих. Здесь мы описываем подробные процедуры беспрепятственного редактирования генома локуса ядерного фактора гепатоцитов 4 альфа (HNF4α) в качестве примера в плюрипотентных стволовых клетках человека. Объединив донорскую плазмиду на основе piggyBac и мутант CRISPR-Cas9 nickase в двухэтапном генетическом отборе, мы демонстрируем правильное и эффективное нацеливание на локус HNF4α.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) представляют собой неограниченный источник соматических клеток для исследований или клиники1. Нацеливание генов в hPSCs предлагает мощный метод изучения функции генов во время спецификации клеток и понимания механизмов заболевания. Хотя эффективные методы редактирования генома существуют, модификация генов в hPSCs остается технически сложной задачей. Стандартное нацеливание генов путем гомологичной рекомбинации в hPSCs происходит на низкой частоте или даже не обнаруживается в некоторых генах2, и поэтому в этих клеткахнеобходим двухцепочечный разрыв ДНК (DSB), стимулируемый генным таргетированием (называемый редактированием генов). Кроме того, трансфекция hPSCs и последующее одноклеточное клонирование не очень эффективны, хотя одноклеточный апоптоз может быть уменьшен за счет использования ингибитора Rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK)4. Наконец, потенциальные целевые и нецелевые мутации в интересующем гене также могут быть проблематичными. Следовательно, надежный протокол необходим для внесения индивидуальных генетических изменений в HPSC.

Технология CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) и CRISPR-ассоциированного белка 9 (Cas9) в настоящее время является хорошо зарекомендовавшим себя инструментом в редактировании генов. Транскрибированная CRISPR РНК (crRNA) и трансактивирующая РНК (tracrRNA) образуют единую направляющую РНК (sgRNA), которая комплексуется с белком Cas9, обеспечивая генно-специфическое расщепление5. Система CRISPR/Cas9 программируется путем изменения направляющей последовательности sgRNA с 20 bp, что означает, что почти любой локус, который удовлетворяет требованию протоспейсер-смежного мотива (PAM), может быть отредактирован. Тем не менее, дикий тип Cas9 может переносить некоторые несоответствия между его направляющей последовательностью и мишенью ДНК, что может вызвать нежелательные нецелевые эффекты. Для улучшения его специфичности был разработан мутант никазы (Cas9n). Cas9n, содержащий мутацию D10A или N863A, обладает только одним функциональным нуклеазным доменом и в результате может проколоть ДНК только на одной цепи. Пара Cas9n, правильно расположенных и ориентированных, может эффективно индуцировать ДНК DSB, и нецелевые эффекты резко уменьшаются6. Чтобы обеспечить эффективную модификацию Cas9n, было показано, что две Cas9n-sgRNA в идеале должны быть размещены со смещением от -4 до 20 bp и всегда создавать 5' свес6.

Cas9(n)-sgRNA-индуцированный DSB может быть использован для редактирования генома в hPSCs 7,8. Он может создать нокаут гена через негомологичную репарацию соединения конца или ввести модификацию гена с помощью гомологического репарации (HDR), если присутствует донорский шаблон ДНК. Протокол, описанный здесь, использует донорскую плазмиду на основе транспозона piggyBac (или целевой вектор) для HDR, в которой маркер лекарственной устойчивости окружен транспозонными инвертированными повторами. Преимущество этого подхода включает в себя эффективный скрининг и бесшовное редактирование генов, как впервые продемонстрировали Yusa et al.9,10. Кассета выбора лекарств позволяет обогащать клетки интегрированным вектором, которые впоследствии экранируются с помощью ПЦР соединения для идентификации клеток, полученных с помощью HDR. Кроме того, кассета выбора лекарственного средства может быть позиционирована для замены целевых последовательностей для расщепления Cas9(n), поэтому после HDR не происходит дальнейшего разрыва ДНК, что устраняет мутации «на» мишени, возникающие в результате повторного расщепления Cas9(n). Кроме того, используя точное иссечение, катализируемое транспозазой piggyBac, маркер отбора затем удаляется из генома, не оставляя шрама. После удаления маркера выбора лекарственного средства9 остается только исходная эндогенная последовательность TTAA для введения piggyBac. Даже если участки TTAA должны быть созданы путем введения замен, шансы на нарушение регуляторных элементов уменьшаются по сравнению с другими методами10.

Здесь мы опишем подробные процедуры для реализации бесшовного редактирования генома в hPSCs. Объединив донорскую плазмиду на основе piggyBac и мутант CRISPR-Cas9 nickase в двухэтапном генетическом отборе, мы ввели две предопределенные точечные мутации в ген11 ядерного фактора гепатоцитов 4 альфа (HNF4α). Этот подход является надежным и эффективным и позволил провести углубленный анализ важной роли, которую играет HNF4α в спецификации эндодермы и гепатоцитов из плюрипотентных стволовых клеток человека11.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Проектирование и построение плазмид экспрессии CRISPR/Cas9n-sgRNA

  1. Поиск 20-bp направляющих последовательностей непосредственно вверх по течению от любого 5'-NGG рядом с местом, подлежащим изменению. Пара одноповодных РНК (sgRNAs) необходима при использовании Cas9 nickase (Cas9n) из Streptococcus pyogenes . Пара sgRNAs должна быть в состоянии генерировать 5'-дюймовые свесы при проколе со смещением от -4 до 20 bp6.
  2. Упорядочить необходимые олиго и вектор pSpCas9n-2A-puro.
  3. Клонирование sgRNA в вектор pSpCas9n для совместной экспрессии с Cas9n в соответствии с опубликованным протоколом12.

2. Проектирование и построение вектора таргетинга на основе piggyBac

  1. Загрузите целевую последовательность генов и найдите сайт TTAA рядом с сайтом, который будет изменен.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние между участком TTAA и сайтом, подлежащим изменению, должно быть как можно меньшим. Если в пределах кодирующей последовательности и сайт TTAA не присутствует на расстоянии 100 bp, необходимо ввести его, сделав синонимичные нуклеотидные замены.
  2. Разработайте гомологические рукава (HA) и включите желаемые точечные мутации в HA. Оптимальная длина HA должна быть в районе 500 - 1200 bp.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется вводить синонимичные нуклеотидные замены для мутации последовательности PAM, чтобы избежать потенциального повторного расщепления Cas9n.
  3. Постройте конечный вектор таргетинга в соответствии с установленным протоколом10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В векторе таргетинга, используемом здесь, кассета выбора PURO-deltaTK, управляемая промотером PGK, окружена транспозонными инвертированными повторами.

3. Генетическое редактирование плюрипотентных стволовых клеток человека

  1. Поддерживать плюрипотентные стволовые клетки человека (hPSCs) в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 на рекомбинантных поверхностях с покрытием ламинин 521 (5 мкг/мл) в среде mTeSR113. Клетки должны достичь 70-85% слияния через 72 часа после соотношения расщепления 1:3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если они присутствуют, удалите спонтанно дифференцированные клетки перед ежедневным изменением среды, осторожно аспирируя их.
  2. В день трансфекции покрывают достаточное количество лунок 24-луночной пластины 300 мкл раствора ламинина 521 (5 мкг/мл) при 37 °C в течение не менее 2 ч.
  3. Аккуратно удалите раствор покрытия и добавьте 300 мкл свежей среды mTeSR1, дополненной ингибитором ROCK 10 мкМ, в каждую лунку, а затем поместите пластину обратно в инкубатор для приема клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания пластин в любой момент при удалении раствора ламининового покрытия.
  4. Переместите запас HPSC из инкубатора, удалите отработанную среду, а затем промыть клетки один раз, используя 1 мл стерильного 1x DPBS.
  5. Добавьте 1 мл нежного реагента диссоциации клеток в каждую лунку 6-луночной пластины и инкубируйте при 37 °C в течение 6-8 мин для диссоциации клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно постучите по тарелке и проверьте, могут ли клетки легко отсоединиться, чтобы решить, достаточно ли долгое пищеварение.
  6. Осторожно пипетку вверх и вниз с помощью наконечника P1000, чтобы снять все HPSC.
  7. Прекратить диссоциацию путем добавления 2 мл свежей среды mTeSR1, дополненной ингибитором ROCK 10 мкМ (Y-27632) к клеточной суспензии.
  8. Хорошо перемешайте и переложите одноэлементную суспензию в пробирку объемом 50 мл и центрифугу при 200 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
  9. Удаляют супернатант и хорошо восстанавливают клетки в свежей среде mTeSR1 объемом 2 мл, дополненной ингибитором ROCK 10 мкМ.
  10. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра. Используйте Trypan Blue для окрашивания и исключения мертвых клеток.
  11. Перенесите 8 x 105 до 1 x 106 живых клеток в трубку 1,5 мл для каждой реакции нуклеофекции и центрифугу при 200 x g в течение 3 мин. Затем осторожно аспирируйте надосадочную.
  12. Смешайте 3 мкг парных плазмид экспрессии Cas9n-sgRNA и 5 мкг векторной плазмиды-мишени в 100 мкл смешанного раствора/добавки для нуклеофекции из набора нуклеофекции стволовых клеток человека. Используйте контрольную плазмиду GFP из комплекта и приготовьте смесь контрольных плазмид GFP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно сделать макси-преп всех плазмид, чтобы уменьшить загрязнение эндотоксинами до нуклеофекции. Концентрация плазмид должна составлять приблизительно 1 мкг/мкл.
  13. Используйте смесь ДНК (объем ~ 111 мкл) для повторного суспендирования подготовленных клеток и переноса ее в электропорационную кювету (поставляется с набором нуклеофекции), избегая пузырьков.
  14. Электропорировать клетки с помощью нуклеофекционного устройства, выбирая оптимизированные условия для плюрипотентных стволовых клеток человека.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если нуклеофекционный набор для плюрипотентных стволовых клеток человека используется впервые, необходимо протестировать программу электропорации и выбрать наиболее эффективную.
  15. Немедленно добавьте 500 мкл свежей и теплой среды с температурой 37 °C mTeSR1, дополненной ингибитором ROCK 10 мкМ, в электропорированные клетки. Переложите смесь в 2 лунки 24-луночной плиты, приготовленной из этапов 3.2 и 3.3.
  16. Быстро поместите пластину обратно в инкубатор 37 °C / 5% CO2 и дайте клеткам восстановиться.
  17. Через 12-16 ч измените среду поддержания клеток. Если клетки установили клеточно-клеточный контакт, отзовите ингибитор ROCK, если нет, продолжайте дополнять среду ингибитором.
  18. Между 24-48 ч проверьте эффективность нуклеофекции, изучив экспрессию GFP в контрольных клетках. GFP-положительные клетки должны быть не менее 30 процентов.
  19. Через 48 ч после нуклеофекции начинайте отбор клеток, дополняя среду mTeSR1 1 мкг/мл пуромицина.
  20. Через 72 ч после нуклеофекции дополните среду mTeSR1 0,5 мкг/мл пуромицина. Если слияние клеток ниже 30%, также дополните среду ингибитором ROCK 10 мкМ.
  21. Через 4-6 дней после нуклеофекции проходят пуромицин-резистентные клетки до 10-15 х 96-луночных пластин при концентрации 0,8 клетки/лунка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо дополнить среду ингибитором ROCK 10 мкМ и пуромицином 0,5 мкг/мл.
  22. Поддерживайте эти клетки при 37 °C / 10% CO2 в течение 10-12 дней, образуя колонии, полученные из одной клетки. Доливайте средним один раз через 7 дней после посева.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повышенный уровень CO2 помогает отдельным HPSC формировать колонии из нашего опыта.
  23. Пометьте скважины, содержащие одну колонию, и замените среду свежей средой mTeSR1, содержащей 0,5 мкг/мл пуромицина, но без ингибитора ROCK.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента клетки будут выращиваться при 37 °C / 5% CO2.
  24. Через два дня меняют среду для скважин, содержащих недифференцированные колонии. Дополните среду ингибитором ROCK 10 мкМ и пуромицином 0,5 мкг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых скважинах клетки могут дифференцироваться и должны быть выброшены.
  25. Используйте наконечники пипеток P2, чтобы аккуратно соскоблить колонии. Перенесите клеточную суспензию, полученную из одной колонии, в 2 новые скважины на отдельных 96-луночных пластинах и используйте одну для генотипирования и одну для поддержания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно тщательно поддерживать колонии и сводить уровень спонтанной дифференциации к минимуму.
  26. Возьмите пластину, содержащую клетки, для генотипирования, как только слияние в большинстве скважин достигнет 50% или выше. Сбросьте отработанную среду, а затем промыть ячейки один раз с помощью DPBS.
  27. Лизируйте клетки в хорошо, используя буфер лизиса Брэдли, и изолируйте геномную ДНК из каждой лунки в пластине в соответствии с соответствующим протоколом (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate).
  28. Используют метод ПЦР с тремя праймерными соединениями для генотипирования как левой, так и правой гомологии рук независимо10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Схема, показывающая метод ПЦР, представлена на рисунке 2.
  29. Отправьте соединительные продукты ПЦР для обоих гомологических рукавов из 4-5 колоний для секвенирования Сэнгера и получите последовательности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Результат секвенирования 2 установленных колоний показан на рисунке 3А.
  30. Сохраните колонии с правильным генотипом и отбросьте остальные.
  31. Расширяйте правильные колонии при непрерывном отборе пуромицина и замораживайте их при скорейшем прохождении.

4. Удаление транспозона из целевых плюрипотентных стволовых клеток человека

  1. Поддерживать одну колонию с правильным генотипом под 0,5 мкг/мл отбора пуромицина.
  2. Нуклеофект 8 х 105 до 1 106 клеток с гиперактивной транспозазой 5 мкг (pCMV-hyPBase), как описано выше (Раздел 3, этапы 3.4-3.18). Выполняйте управляющую нуклеофекцию GFP параллельно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пуромицин должен быть удален из среды mTeSR1 сразу после нуклеофекции этих клеток.
  3. Выращивайте и просчитывайте клетки с помощью кассеты выбора puro-deltaTK, удаленной в соответствии с опубликованными процедурами10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно тщательно следовать первоначальным процедурам. FIAU, или 1-(2-дезокси-2-фтор-β-d-арабинофуранозил)-5-йодурацил), использовался в качестве аналога тимидина для отрицательного отбора, полученного из вируса простого герпеса тимидинкиназы (HSV-tk).
  4. Упорядочить измененную область, чтобы подтвердить удаление транспозона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Результат секвенирования 3 установленных колоний показан на рисунке 3B.
  5. Сохраняйте колонии с правильным генотипом и расширяйте для дальнейшего использования.
  6. Выполните характеристику маркеров плюрипотентности в выбранных колониях, прежде чем использовать их для дальнейшего анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Характеристика двух установленных колоний показана на рисунке 4.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стратегия таргетинга на основе векторов
Ген гепатоцитарного ядерного фактора 4 альфа (HNF4α) был выбран для целенаправленного редактирования генома с целью введения двух точечных мутаций в экзон 8. Пара Cas9n-sgRNA со смещением 11 bp была разработана близко к месту, подлежащему модификации. Вектор таргетинга на основе piggyBac работал как шаблон восстановления, направленный на гомологию, для введения желаемых точечных мутаций. 967 bp 5'-HA и 1142 bp 3'-HA, включающие синонимические нуклеотидные замены или желаемые точечные мутации, были усилены и клонированы в конечный вектор нацеливания. Сайт вставки piggyBac находился на расстоянии 16 bp и 22 bp от двух желаемых точечных мутаций. Колонии, содержащие селекционную кассету puro-deltaTK, были отобраны с пуромицином в первом раунде. После того, как селекционная кассета была удалена путем иссечения транспозазы во втором раунде, целевой сайт был легко модифицирован только с желаемыми точечными мутациями, включенными в ген (рисунок 1).

Генетическое редактирование в плюрипотентных стволовых клетках человека
Для скрининга правильно нацеленных клеток для генотипирования использовался метод ПЦР на основе трех праймеров (рисунок 2). Секвенирование Сэнгера проводили для подтверждения результатов ПЦР (рисунок 3А). После удаления кассеты отбора модифицированную область снова секвенировали, чтобы подтвердить правильное введение желаемых точечных мутаций (рисунок 3B).

Создание колонии и характеристика отредактированных плюрипотентных стволовых клеток человека
Колонии с правильным генотипом отбирались и расширялись по мере необходимости. Установленные колонии должны быть охарактеризованы перед использованием для дальнейшего анализа. Отредактированные клетки имеют ту же морфологию, что и родительские клетки (рисунок 4А). Они также экспрессируют репрезентные маркеры плюрипотентных стволовых клеток человека, включая факторы транскрипции NANOG и OCT4 (рисунок 4B), а также маркеры клеточной поверхности SSEA4 и TRA-1-60 (рисунок 4C).

figure-results-1
Рисунок 1: Нацеливание на векторную стратегию11. Пара плазмид экспрессии Cas9n-sgRNA использовалась для индуцирования двухцепочечного разрыва ДНК в экзоне 8 гена HNF4α. Вектор таргетинга с кассетой отбора использовался для введения предопределенных точечных мутаций, расположенных на расстоянии 16 bp и 22 bp. Эта селекционная кассета содержалась в транспозоне piggyBac , состоящем из положительно-отрицательного маркера отбора (puro-deltaTK), управляемого конститутивно активным промотором (PGK). Через гомологически направленный путь репарации клетки-мишени включали кассету отбора. Транспозонное иссечение, опосредованное транспозазой, приводит к бесшовной модификации с присутствием только точечных мутаций. Красный крест указывает на расположение желаемых точечных мутаций. HA = гомологическая рука; PB = piggyBac; PM = точечная мутация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Три метода ПЦР на основе праймеров. Для скрининга клеток, нацеленных на гены, использовалось генотипирование на основе ПЦР. Три праймера, LA-F1, -R1 и -R2, были использованы для усиления левой области гомологии руки. Независимо друг от друга, RA-F1, -F2 и -R1 использовались для усиления правой области гомологии руки. По результатам гелевого электрофореза были выделены нецелевые клетки, гетерозиготные и гомозиготные клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Результаты секвенирования генетически модифицированных клеток11. Продукты ПЦР из двух клонов были секвенированы и подтверждены правильность вставки селекционной кассеты в целевой локус (А). 5' и 3' piggyBac инвертированные терминальные повторы (ITR) были окружены прямыми повторами TTAA. Три клона были секвенированы после транспозонного иссечения (B). Пара Cas9n-sgRNA со смещением 11 bp была использована для введения двухцепочечного разрыва ДНК. В ген были введены две предопределенные точечные мутации (от A до G и от A до C). Одна синонимическая мутация была введена для мутации протоспейсер-смежного мотива (PAM), а другая для создания сайта TTAA, необходимого для иссечения piggyBac . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Характеристика отредактированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Морфология двух отредактированных клеточных линий и родительских клеток (А), шкала = 100 мкм. Экспрессию плюрипотентных маркеров стволовых клеток NANOG и OCT4 исследуют путем иммуноокрашивания (В, шкала бар = 50 мкм), в дополнение к SSEA4 и TRA-1-60 методом проточной цитометрии (С) в двух модифицированных клеточных линиях и родительских клетках. IgG использовался в качестве отрицательного контроля. DAPI использовался для окрашивания ядра. Проценты были рассчитаны как среднее значение трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, описанный в настоящем описании, может быть использован для введения предопределенных точечных мутаций в эндогенный локус в гПСК. Комбинация вектора нацеливания на основе piggyBac и парных плазмид экспрессии CRISPR/Cas9n оказалась надежной и эффективной11. После редактирования гена HNF4α 12 из 43 проанализированных клонов были правильно нацелены, что было определено путем скрининга ПЦР на соединения. В частности, эффективность биаллелевого таргетирования составляла около 21% (9/43), а эффективность моноаллельного таргетирования составляла около 7% (3/43).

После целевых экспериментов крайне важно поддерживать отбор пуромицина, чтобы сохранить целевой локус доступным для транспозазы piggyBac во время первого раунда скрининга. Это позволит свести к минимуму заглушение кассеты выбора PURO-deltaTK, управляемой промоутером PGK, и уменьшит фон во втором раунде скрининга10. Недавний отчет показал, что промотор CAG более устойчив к глушению, чем промотор PGK в hPSCs14. Таким образом, замена промоутера для кассеты выбора может улучшить эту систему в будущем. Также важно сравнить количество резистентных колоний из hyPBase- и GFP-трансфектированных клеток. После успешного удаления транспозона из hyPBase- должно быть больше выживших колоний, чем GFP-трансфектированных клеток. Помимо ПЦР-анализа транспозонного иссечения, для подтверждения точности иссечения требуется прямое секвенирование модифицированной области.

Основываясь на стратегии вектора нацеливания 9,10 Yusa на основе транспозонов PiggyBac, процедуры, описанные выше, были сосредоточены на улучшении нуклеофекции hPSCs и эффективности клонирования одной клетки. Плотность посева клеток была оптимизирована для снижения вероятности образования гетерогенных колоний. Мы также использовали 10-12-дневную культуру под 10% CO2 для повышения производства колоний для скрининга генотипов. По нашему опыту, из каждой плиты из 96 скважин можно получить около 20 колоний. Хотя этот шаг может занять больше времени, чем другие методы, он надежен и очень эффективен.

Исходя из необходимости, целевые векторы могут быть разработаны для введения или коррекции точечных мутаций, для создания репортерных клеточных линий, а также для экспрессии нокаутирующих генов. В заключение, сочетание системы CRISPR/Cas9(n) и целевого вектора является эффективным способом доставки различных типов генетически модифицированных HPSC.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.C.H является соучредителем, акционером и директором Stemnovate Limited.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Косукэ Юсу за то, что он поделился плазмидами pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK и pCMV-hyPBase. Мы благодарим Цзя-Инь Яна и Карамджита Сингха-Долта за полезные дискуссии о редактировании генома. Лаборатория D.C.H. поддерживается наградой от Главного научного офиса (TC/16/37) и Платформы регенеративной медицины Великобритании (MR/L022974/1). Y.W. был поддержан стипендией PhD, финансируемой Китайским советом по стипендиям и Эдинбургским университетом.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Античеловеческий SSEA4 PEeBioscience12-8843-42
Античеловеческий TRA-1-60 PEeBioscience11-0159-42
DPBSThermo Fisher Scientific14190144
DPBS с кальцием и магниемThermo Fisher Scientific14040133
FIAUMoravekM251
Gentle cell диссоциативный реагентStem Cell Technologies07174
H9 человеческие эмбриональные стволовые клеткиWiCellWA09
человеческое антитело NANOGR& D systemsAF1997
Антитело к OCT4 человекаAbcamAB19857
Стволовая клетка человека Набор нуклеофекторов 1LonzaVPH-5012
Мышь IgG3 контроль изотипа PEeBioscience12-4742-41
mTeSR1 средаТехнологии стволовых клеток85850
Nucleofector 2b deviceLonzaAAB-1001
pCMV-hyPBaseWellcome Trust Sanger InstituteN/A
pMCS-AAT_PBPGKpuroTKWellcome Trust Sanger InstituteN/A
pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462)AddgenePX462
Puromycin dihydrochlorideThermo Fisher ScientificA11138-03
QIAprep spin maxiprep kitQiagen12162
QIAprep spin miniprep kitQiagen27106
Рекомбинантный ламинин 521BioLaminaLN521
Трипановый синий раствор, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250061
Y-27632 (Дигидрохлорид)MilliporeSCM075

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rashidi, H., et al. 3D human liver tissue from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo. Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).
  2. Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
  3. Porteus, M. H., Baltimore, D. Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells. Science. 300 (5620), 763(2003).
  4. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  5. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-822 (2012).
  6. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  7. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-824 (2013).
  8. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  9. Yusa, K., et al. Targeted gene correction of α1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells. Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).
  10. Yusa, K. Seamless genome editing in human pluripotent stem cells using custom endonuclease-based gene targeting and the piggyBac transposon. Nature Protocols. 8 (10), 2061-2078 (2013).
  11. Wang, Y., et al. Multiomics Analyses of HNF4α Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation. iScience. 16, 206-217 (2019).
  12. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (121), 1-8 (2017).
  14. Eggenschwiler, R., et al. Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in patient-derived iPSC by Cas9 nickase. Scientific Reports. 6, 1-14 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem CellsCRISPR Cas9 NickaseSeamless Genome EditingHNF4A LocusPiggyBac Donor PlasmidTwo Step Genetic SelectionNucleofection ProcedurePuromycin SelectionROCK Inhibitor SupplementSanger Sequencing Confirmation

Related Articles