Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Блокирование лимфатического потока путем засовывания афферентных лимфатических сосудов у мышей

6.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61178

⸱

14 мая 2020 г.

 ,  , 
1Department of General Surgery, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin Medical University, 2Inflammation Research Network, Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Snyder Institute for Chronic Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

В этой статье

Краткое содержание

Представлен протокол блокирования лимфатического потока хирургическим завозом афферентных лимфатических сосудов.

Аннотация

Лимфатические сосуды имеют решающее значение для поддержания баланса тканевой жидкости и оптимизации иммунной защиты путем транспортировки антигенов, цитокинов и клеток для слива лимфатических узлов (LNs). Прерывание лимфатического потока является важным методом при изучении функции лимфатических сосудов. Афферентные лимфатические сосуды от муринной подножки до поплитальных лимфатических узлов (pLNs) четко определены как единственные маршруты для лимфатического дренажа в pLNs. Засасывания этих афферентных лимфатических сосудов может избирательно предотвратить лимфатический поток в PLNs. Этот метод позволяет помехи в лимфатическом потоке с минимальным ущербом для лимфатических эндотелиальных клеток в дренажных ЛЬН, афферентных лимфатических сосудов, а также других лимфатических сосудов вокруг области. Этот метод был использован для изучения того, как лимфатические воздействия высоких эндотелиальных вен (HEV) и хемокин выражение в ЛН, и как лимфатические потоки через жировой ткани, окружающие ЛН в отсутствие функциональных лимфатических сосудов. С растущим признанием важности лимфатической функции, этот метод будет иметь более широкое применение для дальнейшего распутывания функции лимфатических сосудов в регулировании микроокноронности LN и иммунных реакций.

Введение

Пространственная организация лимфатической системы обеспечивает структурную и функциональную поддержку для эффективного удаления внеклеточной жидкости и транспортировки антигенов и антигеносующих клеток (БТР) в дренажные LNs. Первоначальные лимфатические сосуды (также называемые лимфатическими капиллярами) очень проницаемы из-за их прерывистых межклеточных соединений, которые облегчают эффективный сбор жидкостей, клеток и других материалов из окружающих внеклеточныхпространств 1. Первоначальные лимфатические сосуды сливаются в сбор лимфатических сосудов, которые имеют жесткие межклеточные соединения, непрерывную мембрану подвала, и лимфатического покрытия мышц. Сбор лимфатических сосудов несут ответственность за транспортировку собранных лимфатических в дренажных LNs и в конечном итоге возвращение лимфыв кровообращение 2,3. Собирающ лимфатические сосуды которые двигают лимфу в стекая LN будут afferent лимфатическими сосудами4,5,6,7. Препятствие афферентных лимфатических сосудов может блокировать поток лимфы в ЛП, что является полезным методом при изучении функции лимфатического потока.

Предыдущие исследования показали, что лимфатический поток играет значительную роль в транспортировке антигенов и БТР, а также поддержания ЛН гомеостаза. Хорошо известно, что ткани полученных БТР, как правило, активированных мигрирующих дендритных клеток (DCs), путешествия через афферентные лимфатические сосуды в ЛН, чтобы активироватьТ-клетки 8. Идея о том, что антигены свободной формы, такие как микробы или растворимые антигены, пассивно текут с лимфой в ЛН для активации БТР-резидентов ЛН, набираетпризнание в последнее десятилетие 9,10,11,12. Свободной формы антигенов путешествия с лимфой занять несколько минут после заражения, чтобы поехать в ЛН, и LN-резидентов активации клеток может произойти в течение 20 минут после стимуляции. Это гораздо быстрее, чем активация мигрирующих DCs, которая занимает более 8 ч, чтобы войти в дренаж LN9. Помимо транспортировки антигенов для инициирования иммунной защиты, лимфа также несет цитокины и ДК в ЛН для поддержания его микроокнижения, а также для поддержки гомеостазаиммунных клеток 13,14. Ранее, блокирование лимфатического потока, зашивая афферентных лимфатических сосудовпоказали,что лимфатические требуется для поддержания фенотипа HEV, необходимых для поддержки гомеостатической Т-клеток и B-клеток самонаведения в LN15,16,17. CCL21 является критическим хемокин, который направляет DC и Т-клеток позиционирования в LN8,18. Блокирование лимфатического потока прерывает выражение CCL21 в LN и потенциально прерывает позиционирование DC и Т-клеток и/или взаимодействие в LN19. Таким образом, блокирование лимфатического потока может прямо или косвенно отогреть антиген / DC доступ к дренажной ЛН, нарушая микроокноронику LN, которая регулирует иммунные реакции в ЛН. Чтобы лучше исследовать функцию лимфатического потока, представлен экспериментальный протокол(рисунок 1), чтобы блокировать лимфатический поток у мышей, засовывав афферентные лимфатические сосуды от подножки до pLN. Этот метод может быть важным методом для будущих исследований по лимфатической функции в здоровых и больных условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Вся работа с животными должна быть одобрена комитетом по институциональной и правительственной этике и обращению с животными.  Это операция, не связанная с выживанием.

1. Подготовка материалов

  1. Приготовьте 100 мл 70% этанола, смешивая 70 мл 100% этанола с 30 мл стерильной воды. Автоклав все хирургические инструменты до операции и сохранить инструменты в 70% этанола до и во время операции для поддержания стерилизации.
  2. Подготовь инъекционный аппарат.
    1. Вырезать 30 см полиэтиленовых труб (0,28 мм в диаметре). Соедините кончик иглы 30 G x 1/2 (игла А) с одним концом полиэтиленовой трубки. Аккуратно выбить еще 30 G х 1/2 иглы (игла B) и подключить сломанную сторону к другому концу полиэтиленовой трубки.
    2. Прикрепите иглу А к шприцу 1 мл туберкулина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого полиэтилена трубки, 1,6 см жидкости в трубке соответствует 1йл 20.
  3. Приготовьте смесь 10:1 кетамина/ксилазина (10 мг/мл кетамина и 1 мг/мл ксилазина) в солевом растворе (бактериостатический 0,9% хлорида натрия). Приготовьте раствор перед использованием.

2. Подготовка животного к операции

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте мышей в возрасте от 6 до 10 недель. Можно использовать как самок, так и самок мышей. В этом исследовании, 6'10-недельный, C57BL/6 самок мышей были использованы. Этот метод может быть адаптирован для других штаммов мышей.

  1. Анестезировать мышь путем введения 250 йл кетамина / ксилазина смеси инстраперитонически. Подождите, пока мышь полностью спит. Убедитесь, что мышь не реагирует на щепотку ноша, чтобы обнаружить полную анестезию.
  2. Бритье меха вокруг ног с ножницами для волос.
  3. Нанесите крем на ногу и подождите 5 минут. Протрите остаточный мех и крем для депиляатора влажной тканью и очистите ногу стерильной водой. Спрей 70% этанола вокруг ноги, чтобы стерилизовать операционную площадь. Этанол ограничивается местом разреза.

3. Хирургическое занасывания афферентных лимфатических сосудов

ПРИМЕЧАНИЕ: Правая нога засасывали, а левая нога используется в качестве фиктивного контроля. Протокол лимфатического шва (шаги 3,1–3,8) занимает 20–30 минут.

  1. Держите мышь в положении, подверженном и исправить его с хирургической лентой, чтобы разоблачить область операции на правой ноге.
  2. Внутридермально вводят 5 МКЛ из 1% Эванс синий краситель или 9 см жидкости инъекционного аппарата трубки в подножку. Аккуратно массируйте подножье, чтобы помочь Эванс синий войти лимфатических сосудов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инсулин шприц не легко контролировать для небольших инъекций объема. Объем можно контролировать более точно с помощью инъекционного аппарата. Лимфатические сосуды визуализированы синим красителем под кожей. С обширной подготовки, как афферентные лимфатические сосуды можно увидеть невооруженным глазом, как прозрачные сосуды в жировой ткани, параллельно saphenous артерии. При обширной подготовке, можно шва сосудов без инъекций Эванс Голубой краситель в тех случаях, когда Есть опасения потенциальных нарушений со стороны красителя.
  3. Под рассеченным микроскопом выберите участок разреза в 5 мм от нижней кромки поплитальной ямки. Сделайте небольшой разрез (5 мм) в коже ножницами. Используя миппы тонкой операции, растянуть разрез, и подвергать сбора лимфатических сосудов(рисунок 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости, небольшой фрагмент кожи может быть удален, чтобы разоблачить лимфатические сосуды.
  4. Определите оба афферентных лимфатических сосудов, ведущих к pLNs под рассекающий микроскоп(рисунок 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Есть два афферентных лимфатических сосудов от подножки до pLN. Оба должны быть захвасы, чтобы блокировать лимфатический поток полностью.
  5. Используя держатель иглы, осторожно вставьте шовную иглу (0,7 метрики или меньше) между афферентным лимфатическим сосудом и сафенозной артерией и аккуратно вытащите иглу вокруг афферентного лимфатического сосуда. Аккуратно потяните шовную веревку и оставьте позади около 2 см шовной струны. Используйте держатель иглы, чтобы помочь связать строку плотно, чтобы шв один лимфатический сосуд с узлом хирурга(рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань под разрезом может высохнуть при длительном воздействии воздуха. Сделать разрез как можно меньше и выставить шов быстро (т.е. в течение 5 минут) предотвратит высыхание ткани. Поддерживайте влажность ткани, применяя небольшой объем солевого раствора с ватным тампоном.
  6. Аккуратно массируйте подножку, чтобы убедиться, что краситель Evans Blue не проходит мимо места шва, а затем вырежьте лишнюю веревку ножницами.
  7. Выполните те же шаги шва (т.е. шаги 3,5 и 3,6) на другом шипухом лимфатическом сосуде(рисунок 1D). Закройте разрез кожи тем же швом, который использовался для шва сосудов в шаге 3.5(рисунок 1E).
  8. Для фиктивного контроля, внутридермально вводить 5 йл 1% Эванс синий краситель на левой ноге и массаж подножка для визуализации лимфатических сосудов. Откройте кожу с иссечением, а затем закрыть рану, не зашив сосуд(рисунок 1F).
  9. По желанию, контролировать управляемых мышей в течение 2'4 ч. Швовая сторона ноги должна показать отек с Эванс Синий распространился на бедро, в то время как контрольная нога покажет ограниченный Эванс синий краситель в ноге. Если мыши пробудятся, дополнительная смесь кетамина/ксилазина будет введена, чтобы сохранить анестезию до эвтаназии.

4. Отслеживание лимфатического потока

  1. Сразу после операции, внутридермально вводить 10 йл 2% фторсхейна изотиоцианата (FITC) в подножку как контроля, так и лимфатической зашиной ноги.
  2. Усыплять мышей с 400 йл кетамина / ксилазина смеси и выполнять вывих шейки матки, когда мыши полностью анестезированы.
  3. Соберите pLNs из popliteal fossa и тщательно удалите перинодальную жировую ткань вокруг pLNs под микроскопом вскрытия на 2, 6 и 12 ч после инъекции FITC.
  4. Вставлять pLNs с медуллярной области пазухи, обращенной в сторону криомольда в оптимальной температуре резки (OCT) соединения (Рисунок 1G,H).
  5. Подготовь 20 замороженных секций с помощью криотома.
  6. Изображение криосакций под конфокальцным микроскопом для определения распределения FITC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Лимфатический сосуд шов был использован впредыдущих исследованиях 15,16,17,19, где он служил важным инструментом для изучения функции лимфатического потока, прежде чем молекулярная биология лимфатических сосудов была лучше понята. Блокирование лимфатического потока прерывает LN гомеостаз, что приводит к HEVs потери критической экспрессии генов, необходимых для оптимального самонаведения лимфоци...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Блокирование лимфатического потока будет иметь широкое применение в манипулировании доставкой антигена в ЛН в здоровых и больных условиях. Можно использовать этот метод для контроля сроков доставки антигена для того, чтобы изучить, как непрерывный поток лимфы регулирует иммунный ответ при сливе LNs. Этот метод прерывания лимфатических потоков также может быть использован для изучения того, как лимфа влияет на разобщенизацию клеток, активацию клеток, миграцию клеток и клеточные взаимодействия в ЛН.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, чтобы раскрыть.

Благодарности

Авторы благодарят Аву Зардынежад за корректорирование рукописи. Эта работа поддерживается Канадским институтом исследований в области здравоохранения (CIHR, PJT-156035) и Канадским фондом инноваций для SL (32930), а также Национальным фондом естественных наук Китая для Yujia Lin (81901576).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильное>0,9% натрия хлорид солевого раствораBaxterJB1323
<сильное>100% этанолГринфилд Глобальныйуниверситет Калгари услуги по распределению UN1170.
Depilatory creamNair NairSensitive Formula Hair Removal Crè me с маслом сладкого миндаля и детским маслом, 200 мл. Или аналогичного товара.
Evans Blue dyeSigma Life ScienceE2129-10GНа 1 мл синего красителя Evans добавьте 0,1 г синего Evans к 10 мл PBS. Раствор Evens Blue будет отфильтрован через фильтры 0,22 мм и сохранен в стерильном виде в аликвотах объемом 1 мл.
Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)Sigma Life ScienceF7250-1G
Щипцы Dumont #3WPI500337
Щипцы Dumont #5WPI500233
Inject apparatusПодсоедините один конец полиэтиленовой трубки к 30G × ½ игла. Прикрепите к игле шприц TB объемом 1 мл. Выбить стержень иглы из другого 30G & раз; ½ игла. Вставьте тупой конец 30G × ½ Вставьте игольчатый вал в другой конец трубки. Внутренний диаметр этой трубки составляет 0,28 мм. Таким образом, 1,6 см жидкости в трубке – это 1 л.
Инсулиновый шприцBecton Dickinson and Company (BD)329461
IRIS Щипцы прямойWPI15914
IRIS ножницыWPI14218-G
KetamineNarketanDIN 02374994Поставщики кетамина и ксилазина обычно находятся под институциональным и государственным регулированием.
Needles (26Gx3/8)Becton Dickinson and Company (BD)305110
Иглы (30Gx1/2)Becton Dickinson and Company (BD)305106
Paton ИглодержательROBOZRS6403прямой, без замка; Зубчатый
<сильно>фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)Sigma Life ScienceP4417-100TAB
прочный>Полиэтиленовая трубкаBecton Dickinson and Company (BD)427401
<прочный>Хирургическая лента (1,25 см x 9,1 м)Транспор1527-0
<сильный>Хирургическая лента (2,5 см x 9,1 м)Transpore1527-1
шовDavis and Geck CYANAMID Canada11/040,7 метрическая мононить полипропилен
<прочный>шприц (1мл)Becton Dickinson and Company (BD)309659
VANNAS ножницыWorld Precision Instruments (WPI)14122-G
<сильно>КсилазинРомпунDIN02169606Поставщики кетамина и ксилазина обычно находятся под институциональным и государственным регулированием.
Equipment
Препарирующий микроскопOlympusOlympus Olympus S261 (522-STS OH141791) с источником света: Olympus Highlight 3100
Конфокальный микроскопLeicaSP8
<

Ссылки

  1. Pflicke, H., Sixt, M. Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).
  2. Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).
  3. Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle. Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).
  4. Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph. The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).
  5. Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels. Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).
  6. Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct. Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).
  7. Breslin, J. W., et al. Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).
  8. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).
  9. Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
  10. Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
  11. Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread. Cell. 150, 1235-1248 (2012).
  12. Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens. Immunity. 42, 172-185 (2015).
  13. Moussion, C., Girard, J. P. Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules. Nature. 479, 542-546 (2011).
  14. Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).
  15. Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone. Immunology. 71, 423-427 (1990).
  16. Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression. Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).
  17. Mebius, R. E., et al. Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow. Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).
  18. Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis. Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).
  19. Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment. Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).
  20. Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice. Journal of Biological Methods. 1, 6(2014).
  21. Lin, Y., et al. Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route. Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).
  22. Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095(2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FITC
Блокирование лимфатического потока путем засовывания афферентных лимфатических сосудов у мышей
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.