Разработан метод прямого скрининга жидкостных культур (ДЛК), который значительно сокращает время, необходимое для опосредованного полиэтиленгликолем (ПЭГ) протопласта нитчатого гриба Aspergillus oryzae при использовании для оценки секреторной продукции гетерологичных белков. Этот метод значительно увеличивает пропускную способность протокола оценки.
Методическая статья
Прямой скрининг жидкостных культур для оценки продукции гетерологичных белков с использованием ауксотрофного мутанта Aspergillus oryzae
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Aspergillus oryzae, нитчатый гриб, является одним из наиболее широко используемых хозяев для промышленного применения, включая крупномасштабное производство белков. Метод трансформации протопластов, опосредованный полиэтиленгликолем (ПЭГ), обычно используется для введения гетерологичных генов в A. oryzae. Традиционный метод обычно требует трех недель для скрининга благоприятных трансформаторов. Здесь представлен новый метод, метод прямого скрининга с использованием жидкостных культур (DLC), который сокращает время скрининга до шести дней в формате 200 мл или до 10 дней в формате 24 лунок на микропланшетах. Метод скрининга DLC обеспечивает получение положительных трансформантов и оценку секреторной продукции гетерологичных белков за один этап, в отличие от традиционного метода скрининга, где для одного и того же требуются два отдельных этапа. Описан протокол ПЭГ-опосредованного преобразования протопластов A. oryzae , который состоит из пяти этапов: приготовление свежей споровой суспензии, прекультура, подготовка протопластов, введение ДНК и DLC-скрининг. Для получения успешных результатов при скрининге DLC крайне важно использовать богатую питательными веществами среду с оптимизированным осмотическим давлением. Протокол должен еще больше популяризировать использование A. oryzae в качестве предпочтительного хозяина в промышленном производстве белков.
Введение
Aspergillus oryzae — важный микроорганизм в японской пищевой промышленности, который уже более 1 000 лет используется в производстве ферментированных продуктов, таких как саке (рисовое вино), сёю (соевый соус) и мисо (соевая паста)1,2. Он обладает способностью выделять большое количество белков, таких как протеазы и амилазы3. Также доступна информация о последовательности генома A. oryzae 4. Более того, для этого гриба были созданы мощные и практически полезные методы генной инженерии
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Приготовление свежей споровой суспензии
- Инокулируйте 20 мкл суспензии спор (1 x 107 спор/мл) в центр культурального планшета, содержащего среду Чапек-Докса (CD), 20 мМ уридина (автоклавированного при 121 °C в течение 20 мин, табл. 1).
- Инкубировать при 30 °C в течение 7 дней, чтобы способствовать образованию спор.
- Добавьте 1,5 мл 0,01 % раствора Tween 20 (автоклавированного при 121 °C в течение 20 мин) в культуральную пластину, содержащую споры, и суспензируйте споры путем соскабливания с помощью распространителя клеток.
- Соберите споровую суспензию в стерильную ми....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Ниже описаны результаты введения кассеты экспрессии ДНК, кодирующей целлобиогидролазу Talaromyces cellulolyticus cellobiohydrolase (CBH: GenBank Accession Number E39854), в уридиновый ауксотроф штамма A. oryzae HO422 и скрининга на секреторную продукцию гетерологичного белка.
Приготовление свежей споровой суспензии
Конечный выход споровой суспензии с одной агаровой пластины составил 1 мл (1 х 107 .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы разработали систему, которая позволяет проводить скрининг трансформантов A. oryzae быстрее, чем традиционным методом, путем проведения жидкой культуры протопластов. Наиболее важным аспектом этого метода является осмотическое давление жидкой среды. Осмотическое давление, пригодное для жидкой культуры, оптимизировали с помощью сорбита. Рост штамма A. oryzae HO4 был наиболее активным в присутствии 0,8 М сорбита (рис. 3А). При традиционном с.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы выражают благодарность Ринкею Окано за помощь в проведении экспериментов. Авторы благодарят профессора Кацуя Гоми из Университета Тохоку и профессора Масаюки Матиду из Технологического института Канадзавы за ценные дискуссии. Эта работа была профинансирована Honda Research Institute Japan Co., Ltd.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1 М NaOH | NACALAI TESQUE, INC. | 37421-05 | |
| 1 м трис-HCl (pH 7,5) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 318-90225 | |
| 1 M Tris-HCl (pH 6,8) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 2106-100 | |
| 1,5-мл микроцентрифужная трубка | AS ONE Corporation | 1-1600-03 | |
| 15-мл коническая центрифужная трубка | Becton, Dickinson and Company | 352196 | |
| 2- меркаптоэтанол | Bio-Rad Laboratories, Inc. | ||
| 24-луночный микропланшет | AGC TECHNO GLASS CO., LTD. | 3820-024 | |
| Коническая центрифужная трубка 50 мл | Becton, Dickinson and Company | 352070 | |
| 70-&микро; m Сетчатый фильтр | Becton, Dickinson and Company | 352350 | |
| Агар | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 010-15815 | |
| Автоклав | TOMY SEIKO CO., LTD. | LSX-700 | |
| Бромфенол синий | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 021-02911 | |
| CaCl2 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 038-24985 | |
| Казаминокислота | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 393-02145 | |
| Целлюлаза R-10 | Cosmo Bio Co., Ltd. | 16419 | |
| Гидрат декстрина | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 044-00585 | |
| D-сорбит | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 191-14735 | |
| e-PAGEL | ATTO CORPORATION | E-T/R1020L | Используется для сборного геля в |
| устройстве для электрофореза | ATTO CORPORATION | WSE-1150 | Используется для SDS-PAGE |
| FeSO4· 7H2O | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 098-01085 | |
| Стеклянный фильтр 17G3 | Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd. | ||
| Глицерин | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 070-04941 | |
| Гемоцитометр | Funakoshi Co., Ltd. | 521-10 | |
| Высокоскоростная рефрижераторная центрифуга | KUBOTA CORPORATION | 7780 | Используется для центрифугирования образцов в конических центрифужных пробирках объемом 50 мл |
| Инкубатор | TAITEC CORPORATION. | G· BR-200 | Используется для культивирования жидких колб и приготовления протопластов |
| в инкубаторе | TAITEC CORPORATION. | BR-43FL | Используется для жидкостной культуры микропланшетов и планшетной культуры |
| KCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | |
| KH2PO4 | NACALAI TESQUE, INC. | 28721-55 | |
| Лизирующий фермент | Sigma-Aldrich | L1412-10G | |
| MgSO4· 7H2O | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 131-00405 | |
| Микроцентрифуга для охлаждения | KUBOTA CORPORATION | 3740 | Используется для центрифугирования образцов в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл |
| Микроскоп | Leica Microsystems | DMI6000 B | |
| NaCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 190-13921 | |
| 2PO4· 2H2O | NACALAI TESQUE, INC. | 31718-15 | |
| NaNO3 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 195-02545 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-996 | |
| Набор для очистки ПЦР | QIAGEN K.K | 28104 | |
| Чашка Петри | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-11900 | Используется в качестве культивальной пластины |
| полиэтиленгликоль | Sigma-Aldrich | P3640-500G | |
| Полипептонный пептон | Becton, Dickinson and Company | 211910 | |
| Белковые лестницы | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 161-0377 | Используется в качестве маркера молекулярной массы в SDS-PAGE |
| Sodium dodecyl sulfate | Bio-Rad Laboratories, Inc. | ||
| Стерильный фильтр | Merck KGaA | SLGP033RB | |
| сахарозы | NACALAI TESQUE, INC. | 30404-45 | |
| Твин 20 | Токио Кемикал Индастри Ко., Лтд. | T0543 | |
| Уридин | Сигма-Олдрич | U3750-25G | |
| Яталасе | Такара Био Инк. | Т017 |
Ссылки
- Tsuboi, H., et al. Improvement of the Aspergillus oryzae enolase promoter (P-enoA) by the introduction of cis-element repeats. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 69, 206-208 (2005).
- Nemoto, T., Maruyama, J. -I., Kitamoto, K.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешениеТеги
