Целью протокола является сравнение различных условий покрытия внеклеточного матрикса (ECM) для оценки того, как дифференциальное покрытие влияет на скорость роста индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPSCs). В частности, мы стремимся создать условия для получения оптимального роста культур iPSC.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измерение слияния иПСК с помощью автоматизированной системы визуализации.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Это исследование фокусируется на понимании того, как выращивание IPSC на различных подложках покрытия ECM может повлиять на слияние клеток. Протокол для оценки слияния iPSC в режиме реального времени был создан без необходимости подсчета клеток в одноклеточной суспензии, чтобы избежать любого возмущения роста. Система анализа изображений с высоким содержанием использовалась для автоматизированной оценки слияния iPCS на 4 различных ECM с течением времени. Для оценки слияния клеток адгезивных ИПСК использовались различные параметры анализа, и наблюдалась лишь небольшая разница (через 24 и 48 часов с ламинином), независимо от того, применялась ли маска 60, 80 или 100%. Мы также показываем, что ламинин приводит к лучшему слиянию по сравнению с Матригелем, витронектином и фибронектином.
Введение
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) получают из соматических клеток и могут быть дифференцированы в различные типы клеток. Они часто используются в качестве системы для моделирования патогенеза заболеваний или проведения скрининга лекарств, а также предлагают потенциал для использования в контексте персонализированной медицины. Поскольку iPSC обладают большим потенциалом, важно полностью охарактеризовать их для использования в качестве надежной модельной системы. Ранее мы показали важность выращивания иПСК в гипоксической среде, поскольку эти клетки полагаются на гликолиз, а аэробная среда может вызвать окислительно-восстановительный дисбаланс
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Покрытие 96 плит скважин
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные покрытия были испытаны в одной и той же пластине, но в отдельных скважинах (см. Дополнительный файл).
- Разбавить Матригель 1:100 в ДМЭМ. Добавьте 100 мкл на лунку к плитам 96 лунок и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого удалите раствор и дважды промывайте колодцы со 100 мкл DMEM.
- Разбавляют ламинин (20 мкг/мл, LN-521) в PBS (с кальцием и магнием). Добавьте в лунку 100 мкл и инкубируйте при 4 °C в течение ночи. На следующий день выполните две промывки с DMEM перед посевом клеток.
- Разбавляют витронектин (10 мкг/мл) в буф....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этом исследовании мы исследовали слияние iPSCs при выращивании на разных условиях покрытия. Используя цитометр, мы смогли получить легко информативные результаты в трех экземплярах за 5 дней. Поскольку иПСК почти не прикрепляются к пластиковым сосудам, а покрытие необходимо для поддержки их пролиферации, мы решили контролировать слияние человеческих ИПСК, поскольку это свидетельствует о здоровье клеточной культуры и может отражаться на их дифференцировочном потенциале. После расширения in vitro мы засеяли иПСК на разли.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Использование ИПСК для моделирования заболеваний и будущего скрининга лекарств вместе с их возможным применением в прецизионной медицине делает ее технологией большой актуальности, и по этой причине мы считаем, что необходимо четко понимать условия культивирования in vitro, которые лучше напоминают физиологическую ситуацию эмбриональных стволовых клеток. В этом контексте мы протестировали различные покрытия ECM с использованием IPSC дикого типа, чтобы понять условия, которые позволяют клеткам оставаться в здоровом и неди.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Исследование было поддержано грантами Фонда Бамбино Джезу и Ricerca Corrente (Министерство здравоохранения Италии) C.C. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Энрико Бертини (Отделение неврологии, Отделение нервно-мышечных и нейродегенеративных заболеваний, Лаборатория молекулярной медицины, Детская исследовательская больница Бамбино Джезу), д-ра Стефанию Петрини (Конфокальная микроскопическая основная установка, Исследовательские лаборатории, Детская исследовательская больница Bambino Gesù), Джулию Периколи (Отделение онкогематологии, генной и клеточной терапии, Детская исследовательская больница Bambino Gesù) и Роберта Ферре....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10 мл полосатые серологические пипетки, полистирол, индивидуально бумажные/пластиковые в упаковке, стерильные | Corning | 4488 | Tool |
| 15 мл высокопрозрачные полипропиленовые (ПП) конические центрифужные трубки | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (с Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (без Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 мл полосатых серологических пипеток, полистирол, в индивидуальной бумажной/пластиковой упаковке, стерильный | клеточной | Corning | 4487 |
| 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell Culture plate, 6 лунок | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Реагент |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Реагент |
| FAST - READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool Фетальная |
| бычья сыворотка (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Фибронектин | Merck | FC010 | Покрытие |
| глицерин | Sigma | G5516 | Реагент |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Реагент |
| Laminin 521 | Технологии стволовых клеток | 77003 | Покрытие |
| L-глутамин (200 мМ) | Gibco | LS25030081 | Реагент |
| Matrigel | Corning Матригель hESC-квалифицированное матричное | покрытие 354277 | |
| мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) | Life Technologies | A24903 | Покрытие |
| MTESR1 Технологии средних | стволовых клеток | 85851 | Среднее |
| дополнение MTESR1 Технологии | стволовых клеток | 85852 | Средний |
| пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл) | Реагент Gibco | 15140122 | |
| фаллоидин | Sigma | P1951 | Реагент |
| Витронектин | Технологии стволовых клеток | 7180 | Покрытие |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Реагент |
Ссылки
- Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated hu....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
