Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение слияния иПСК с помощью автоматизированной системы визуализации.

2.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61225

⸱

10 июня 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Genetics and Rare Diseases Research Division, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, IRCCS, 2Department of Science, University Roma Tre, 3Department of Onco-hematology, Gene and Cell Therapy, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, IRCCS

В этой статье

Краткое содержание

Целью протокола является сравнение различных условий покрытия внеклеточного матрикса (ECM) для оценки того, как дифференциальное покрытие влияет на скорость роста индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPSCs). В частности, мы стремимся создать условия для получения оптимального роста культур iPSC.

Аннотация

Это исследование фокусируется на понимании того, как выращивание IPSC на различных подложках покрытия ECM может повлиять на слияние клеток. Протокол для оценки слияния iPSC в режиме реального времени был создан без необходимости подсчета клеток в одноклеточной суспензии, чтобы избежать любого возмущения роста. Система анализа изображений с высоким содержанием использовалась для автоматизированной оценки слияния iPCS на 4 различных ECM с течением времени. Для оценки слияния клеток адгезивных ИПСК использовались различные параметры анализа, и наблюдалась лишь небольшая разница (через 24 и 48 часов с ламинином), независимо от того, применялась ли маска 60, 80 или 100%. Мы также показываем, что ламинин приводит к лучшему слиянию по сравнению с Матригелем, витронектином и фибронектином.

Введение

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) получают из соматических клеток и могут быть дифференцированы в различные типы клеток. Они часто используются в качестве системы для моделирования патогенеза заболеваний или проведения скрининга лекарств, а также предлагают потенциал для использования в контексте персонализированной медицины. Поскольку iPSC обладают большим потенциалом, важно полностью охарактеризовать их для использования в качестве надежной модельной системы. Ранее мы показали важность выращивания иПСК в гипоксической среде, поскольку эти клетки полагаются на гликолиз, а аэробная среда может вызвать окислительно-восстановительный дисбаланс1. ИПСК также уязвимы к другим условиям культивирования, особенно к внеклеточной среде. Оптимизация условий культуры является ключевым вопросом для поддержания их здоровья и распространения. Здоровая культура iPSC приведет к здоровым дифференцированным клеткам, которые обычно являются конечной точкой модели, используемой для понимания молекулярных, клеточных и функциональных особенностей конкретных расстройств человека или клеточных процессов.

В этом исследовании был использован простой протокол для проверки слияния иПСК с использованием различных условий покрытия в отдельных скважинах. IPSCs требуют питательного слоя мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) для правильного присоединения, но сосуществование iPSCs и MEF затрудняет выполнение анализа, такого как РНК или экстракция белка, поскольку присутствуют две популяции клеток. Чтобы избежать фидерного слоя, различные белки, принадлежащие к внеклеточному матриксу (ECM), были использованы для воссоздания естественной клеточной ниши и создания культуры iPSC без фидера. В частности, Матригель представляет собой солюбилизированный препарат базальной мембраны, извлеченный из саркомы мыши Энгельбрета-Холма-Роя (EHS), который обогащен белками внеклеточного матрикса (т.е. ламинином, коллагеном IV, протеогликанами сульфата гепарана, энтактином/нидогеном и факторами роста)2,3. Другими используемыми условиями покрытия вместо этого являются очищенные белки, имеющие известное значение при построении ECM: ламинин-521, как известно, секретируется человеческими плюрипотентными стволовыми клетками (hPSCs) во внутренней клеточной массе эмбриона, и это один из наиболее распространенных ламининов в организме после рождения 4,5,6,7,8,9, 10,11; витронектин представляет собой матрицу клеточной культуры без ксено, которая, как известно, поддерживает рост и дифференцировку hPSC 12,13,14,15,16; фибронектин является белком ECM, важным для развития позвоночных и прикрепления и поддержания эмбриональных стволовых клеток в плюрипотентном состоянии 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Поскольку доступны различные условия покрытия, мы сравниваем их с точки зрения их влияния на слияние иПСК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Покрытие 96 плит скважин

ПРИМЕЧАНИЕ: Различные покрытия были испытаны в одной и той же пластине, но в отдельных скважинах (см. Дополнительный файл).

  1. Разбавить Матригель 1:100 в ДМЭМ. Добавьте 100 мкл на лунку к плитам 96 лунок и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого удалите раствор и дважды промывайте колодцы со 100 мкл DMEM.
  2. Разбавляют ламинин (20 мкг/мл, LN-521) в PBS (с кальцием и магнием). Добавьте в лунку 100 мкл и инкубируйте при 4 °C в течение ночи. На следующий день выполните две промывки с DMEM перед посевом клеток.
  3. Разбавляют витронектин (10 мкг/мл) в буфере разбавления. Добавьте 100 мкл на лунку к плите из 96 лунок и инкубируйте в течение 1 часа при комнатной температуре. Промыть лунки PBS (без кальция и магния) перед обшивкой клеток.
  4. Разбавить HU-фибронектин (30 мкг/мл) в ddH2O. Добавить в лунки 100 мкл и инкубировать при комнатной температуре в течение 45 минут. После этого промывайте колодцы средой перед посевом клеток.

2. Поддержание ИПСК в культуре

ПРИМЕЧАНИЕ: IPSC были приобретены на коммерческой основе. ИПСК были получены из здоровых фибробластов человека и перепрограммированы с использованием эписомальной технологии.

  1. Из морозильной камеры или жидкого азота при температуре -80 °C разморозьте криоконсервированные иПСК на водяной бане с температурой 37 °C. Очистите флакон, содержащий клетки с 70% этанолом, прежде чем переместить его в шкаф биологической безопасности.
  2. Добавляют клеточную суспензию к 5 мл предварительно нагретой среды для клеточных культур (например, mTeSR1) по капле с пипеткой 1000 мкл в стерильной конической трубке объемом 15 мл.
  3. Центрифугирование ячеек при 304 х г в течение 5 мин при комнатной температуре (RT).
  4. Удалите среду и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 4 мл клеточной культуральной среды.
  5. Поместите клеточную суспензию в две лунки из 6 пластин скважины (105 iPSCs на чашку для культивирования клеток с 6 лунками), где ранее были покрыты эмбриональные фибробласты мыши (MEF). Семена MEF за два дня до нанесения iPSCs плотностью 2,4 х 104/см2 в DMEM (содержащие 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% L-глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина).
  6. После посева дополните клеточную среду 10 мкМ ингибитора ROCK Y-27632.
  7. Выращивайте iPSCs на MEF в течение первых 4-5 недель, а затем в состоянии без кормушки (MEF free condition), используя одно из интересующих покрытий (см. шаг 1 и таблицу 1) в mTeSR1.
  8. Когда ИПСК составляют 70-80% слива, проход 1:4 с использованием обработки ЭДТА 0,5 мМ в течение 3-5 мин при РТ. Добавьте 1 мл 0,5 мМ ЭДТА для плиты из 6 лунок (или пропорциональные величины для других типов пластин). Перекачивать в новые скважины в свободных от питателей условиях и инкубировать при 37 °C, 5% CO2, 20% O2.
  9. Меняйте среду свежим mTeSR1 каждый день и разделяйте клетки каждые 2 дня.

3. Характеристика слияния клеток

  1. Используйте 96 плит скважин для экспериментов.
  2. Посейте 10 000 клеток на скважину после по крайней мере 1 месяца культивирования в свободном от кормушки состоянии, чтобы быть уверенным, что MEF не были пройдены. Используйте одноразовые счетные слайды для подсчета клеток с помощью оптического микроскопа.
  3. Выполняйте эксперименты в трех экземплярах. Поэтому тестируйте каждое условие посева в трех скважинах.
  4. Выполняйте автоматическое получение изображений с 1-го дня после посева с помощью цитометра в режиме яркого поля. Выполняйте автоматическое получение изображений каждые 24 часа в течение 5 дней. Для получения подробной информации об экспериментальных параметрах обратитесь к Дополнительному файлу.
  5. Используйте автоконтрастность и автоэкспозицию для лучшей визуализации ячеек.
  6. Установите настройку анализа (см. Дополнительный файл) для анализа слияния, чтобы применить маску 60%, 80% и 100% на скважину, чтобы оценить изменения фокуса из-за преломления света на границе скважин. Используйте различные настройки анализа маски, упомянутые выше, чтобы проанализировать слияние клеток в каждой точке времени.

4. Статистический анализ

  1. Сообщайте количественные результаты как средство ± стандартной погрешности среднего значения (SEM).
  2. Для сравнения общих различий различных условий покрытия получите данные с использованием одних и тех же образцов и выполните t-тест студента в парном образце. Значения P менее 0,05 считаются статистически значимыми, и все сообщаемые p-значения являются двусторонними.

5. Характеристика микрофиламентов цитоскелета

  1. Зафиксируйте клетки с 4% параформальдегидом (4% PFA) в PBS в течение 10 мин при RT, после чего две промывки в PBS (всего 10 мин).
  2. Добавляют по 100 мкл блокирующего раствора (состоящего из 5% BSA, 0,1% тритона в PBS) в каждую лунку в течение 1 ч при RT.
  3. Удалите блокирующий раствор и дважды промойте образцы PBS в течение 10 минут.
  4. Добавляют 100 мкл фаллоидин-конъюгированного рабочего раствора на образец и инкубируют в течение 1 ч при РТ.
  5. Дважды промывайте ячейки PBS (10 мин при RT).
  6. Окрашивание ядер с Hoechst 33342 разбавляют 1:10000 в PBS в течение 10 мин при RT.
  7. Удалите раствор Hoechst и промывайте ячейки дважды PBS в течение 10 минут каждый раз.
  8. Вымойте образец сH2Oи дайте высохнуть под химическим капотом.
  9. Добавьте 100 мкл монтажной среды (т.е. PBS:глицерин, 1:1) для покрытия клеток и сохранения флуоресценции образцов.
  10. Наблюдайте за ячейкой при Ex/Em 493/517 нм на лазерно-сканирующем конфокальном микроскопе, оснащенном источником лазера белого света (WLL) и диодным лазером 405 нм. Получайте последовательные конфокальные изображения с помощью 40-кратного масляного объектива HC PLAPO. Используйте одинаковую мощность лазера, разветвители луча, настройки фильтра, диаметры точечных отверстий и режим сканирования для всех исследуемых образцов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом исследовании мы исследовали слияние iPSCs при выращивании на разных условиях покрытия. Используя цитометр, мы смогли получить легко информативные результаты в трех экземплярах за 5 дней. Поскольку иПСК почти не прикрепляются к пластиковым сосудам, а покрытие необходимо для поддержки их пролиферации, мы решили контролировать слияние человеческих ИПСК, поскольку это свидетельствует о здоровье клеточной культуры и может отражаться на их дифференцировочном потенциале. После расширения in vitro мы засеяли иПСК на разли...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Использование ИПСК для моделирования заболеваний и будущего скрининга лекарств вместе с их возможным применением в прецизионной медицине делает ее технологией большой актуальности, и по этой причине мы считаем, что необходимо четко понимать условия культивирования in vitro, которые лучше напоминают физиологическую ситуацию эмбриональных стволовых клеток. В этом контексте мы протестировали различные покрытия ECM с использованием IPSC дикого типа, чтобы понять условия, которые позволяют клеткам оставаться в здоровом и неди...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Исследование было поддержано грантами Фонда Бамбино Джезу и Ricerca Corrente (Министерство здравоохранения Италии) C.C.  Мы хотели бы поблагодарить д-ра Энрико Бертини (Отделение неврологии, Отделение нервно-мышечных и нейродегенеративных заболеваний, Лаборатория молекулярной медицины, Детская исследовательская больница Бамбино Джезу), д-ра Стефанию Петрини (Конфокальная микроскопическая основная установка, Исследовательские лаборатории, Детская исследовательская больница Bambino Gesù), Джулию Периколи (Отделение онкогематологии, генной и клеточной терапии, Детская исследовательская больница Bambino Gesù) и Роберта Ферретти (отделение онкогематологии, генной и клеточной терапии, Детская исследовательская больница Бамбино Джезу) для научных дискуссий и технической помощи. Мария Винчи является получателем стипендии «Дети с раком в Великобритании».

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10 мл полосатые серологические пипетки, полистирол, индивидуально бумажные/пластиковые в упаковке, стерильныеCorning4488Tool
15 мл высокопрозрачные полипропиленовые (ПП) конические центрифужные трубкиFalcon352097Tool
1x PBS (с Ca2+; Mg2+)Thermofisher14040133Medium
1x PBS (без Ca2+; Mg2+)EurocloneECB4004LMedium
5 мл полосатых серологических пипеток, полистирол, в индивидуальной бумажной/пластиковой упаковке, стерильныйклеточнойCorning4487
96 WELL, PS, F-BottomGreiner Bio One655090Support
Cell Culture plate, 6 лунокCostar3516Support
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose)SigmaD5671Medium
EDTASigmaED4SS-500gРеагент
Epi Episomal iPSC Reprogramming KitInvitrogenA15960Реагент
FAST - READ 102BiosigmaBVS100Tool Фетальная
бычья сыворотка (FBS)Gibco10270106Medium
ФибронектинMerckFC010Покрытие
глицеринSigmaG5516Реагент
H2OMILLIQ
HoechstThermofisher33342Реагент
Laminin 521Технологии стволовых клеток77003Покрытие
L-глутамин (200 мМ)GibcoLS25030081Реагент
MatrigelCorning Матригель hESC-квалифицированное матричноепокрытие 354277
мышиных эмбриональных фибробластов (MEF)Life TechnologiesA24903Покрытие
MTESR1 Технологии среднихстволовых клеток85851Среднее
дополнение MTESR1 Технологиистволовых клеток85852Средний
пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл)Реагент Gibco15140122
фаллоидинSigmaP1951Реагент
ВитронектинТехнологии стволовых клеток7180Покрытие
Y-27632SigmaY0503Реагент
микропланшет для культуры ,

Ссылки

  1. Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
  2. Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
  3. Kleinman, H. K., et al. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21 (24), 6188-6193 (1982).
  4. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195(2014).
  5. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  6. Laperle, A., et al. α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal. Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).
  7. Albalushi, H., et al. Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells. Stem Cell International. 2018, 7127042(2018).
  8. Zhang, D., et al. Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP. Science Signaling. 10 (493), (2017).
  9. Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).
  10. Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells. Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).
  11. Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).
  12. Braam, S. R., et al. Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
  13. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).
  14. Li, J., et al. Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells. Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).
  15. Prowse, A. B., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media. Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).
  16. Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).
  17. Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins. Biochemistry. 193 (1), 295-299 (1981).
  18. Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain. Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).
  19. Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system. Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).
  20. Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).
  21. Vaheri, A., Mosher, D. F. High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation. Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).
  22. Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).
  23. Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).
  24. Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).
  25. Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix. Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).
  26. Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).
  27. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  28. Vigilante, A., et al. Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors. Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

конфлюэнтность иПСКсубстраты с покрытием из ВКМвысокопроизводительный анализ изображенийпротокол культивирования клетокпокрытие ламининомматрикс базальной мембраныпокрытие витронектиномпокрытие фибронектиномконфокальная микроскопия
Измерение слияния иПСК с помощью автоматизированной системы визуализации.
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.