Loop-Опосредованное изотермальное усиление для скрининга сальмонеллы в пище животных и подтверждение сальмонеллы от культурной изоляции

Summary

Опосредованное петлей изотермальное усиление (LAMP) является изотермальным тестом на усиление нуклеиновой кислоты (iNAAT), который вызвал широкий интерес в области обнаружения патогенов. Здесь мы представляем мультилабораторно-проверенный протокол Salmonella LAMP как быстрый, надежный и надежный метод скрининга сальмонеллы в пище животных и подтверждения предполагаемой изоляции сальмонеллы от культурной изоляции.

Abstract

Опосредованное петлей изотермальное усиление (LAMP) стало мощным тестом на усиление нуклеиновой кислоты для быстрого обнаружения многочисленных бактериальных, грибковых, паразитарных и вирусных агентов. Сальмонеллы является бактериальным патогеном во всем мире проблемы безопасности пищевых продуктов, в том числе продуктов питания для животных. Представлено здесь является несколько лабораторных проверенных Salmonella LAMP протокол, который может быть использован для быстрого проверки животных пищи на наличие загрязнения сальмонеллой, а также может быть использован для подтверждения предполагаемого salmonella изолятов, восстановленных из всех категорий продуктов питания. Анализ LAMP специально нацелен на ген нашествия сальмонеллы(invA)и является быстрым, чувствительным и весьма специфическим. Шаблон ДНК готовятся из обогащения бульонов животной пищи или чистой культуры предполагаемых изолятов сальмонеллы. Смесь реагентов LAMP готовится путем объединения изотермальной смеси мастера, грунтовки, шаблона ДНК и воды. Анализ LAMP работает при постоянной температуре 65 градусов по Цельсию в течение 30 минут. Положительные результаты отслеживаются с помощью флуоресценции в режиме реального времени и могут быть обнаружены уже через 5 минут. Анализ LAMP демонстрирует высокую толерантность к ингибиторам в животных пищевых продуктов или культуры среды, выступающей в качестве быстрого, надежного, надежного, экономически эффективного и удобного метода для скрининга и подтверждения сальмонеллы. Метод LAMP недавно был включен в Бактериологическое аналитическое руководство Управления по пищевым продуктам и лекарственным продуктам США (BAM) Глава 5.

Introduction

Петля опосредованное изотермальное усиление (LAMP) является новым изотермальным тестом на усиление нуклеиновой кислоты (iNAAT), изобретенным в 2000 году группой японских^{ученых 1}. Путем формирования целевой структуры ДНК стволовой петли на начальных этапах, LAMP использует прядь-вытесняя полимеразу дна эффективно усилить этот стартовый материал квази-экспоненциально, в результате чего^{10 9} копий цели менее чем за 1 ч¹. По сравнению с полимеразной цепной реакцией (ПЦР), широко используемой NAAT, LAMP обладает рядом преимуществ. Во-первых, реакции LAMP проводятся в изотермальных условиях. Это устраняет необходимость в сложном тепловом велосипеде. Во-вторых, LAMP очень терпимо относится к культурным СМИ и биологическим^{веществам 2} с надежностью, продемонстрированой как для клинических, так^{и для пищевых применений 3,4.} Это упрощает подготовку образца и сводит к минимуму ложные отрицательные^{результаты 5.} В-третьих, LAMP является подложкой для нескольких платформ обнаружения, таких как мутность, колориметрия, биолюминесценция, флуоресценция, и^{микрофлюиды 6}. В-четвертых, LAMP является весьма конкретным, поскольку он использует четыре-шесть специально разработанных грунтовок для целевой шесть-восемь^{конкретных регионов 1,7}. В-пятых, LAMP является сверхчувствительным и многочисленные исследования сообщили о своей превосходной чувствительности к ПЦР или в режиме реального времени PCR⁸. Наконец, LAMP быстрее со многими анализами в настоящее время принятие 30 мин стандартного времени, в то время как ПЦР типа анализы обычно принимают 1'2 ч⁸.

Эти привлекательные особенности подпитывали применение LAMP в широких областях обнаружения патогенов, включая ^{диагностику в пробирке 9,диагностику болезней животных 10,}а также пищевые и экологические^{испытания 11}. Примечательно, что TB-LAMP (LAMP для микобактерий туберкулеза) был рекомендован ВОЗ в качестве действительного теста замены для микроскопии мокроты мазка для диагностики туберкулеза легких в периферических^{условиях 12}. Приложение LAMP также выходит за рамки микробной идентификации, чтобы включить обнаружение аллергенов, видов животных, лекарственной устойчивости, генетически модифицированных организмов и пестицидов¹³.

Нетифоидная сальмонелла является зоонозным патогеном существенной безопасности пищевых продуктов и общественного здравоохранения озабоченность во всем мире¹⁴. Он также был определен в качестве важной микробной опасности в пище для животных (т.е. животного^{питания) 15,16}. Для предотвращения болезней сальмонеллы / вспышек от загрязненной пищи человека и продуктов животного происхождения, крайне важно иметь быстрые, надежные и надежные методы для тестирования сальмонеллы в различных матриц. В последнее десятилетие, значительные усилия были предприняты на международном уровне по разработке и применению сальмонеллы LAMP анализы в широком спектре пищевых матриц, как недавно обобщены в обширном^{обзоре 8}. Несколько анализов Salmonella LAMP, в том числе один представленный здесь, успешно завершили много лабораторной проверки после устоявшихся международных^{руководящих принципов 17,18,19,20}.

Наша salmonella LAMP анализ конкретно цели salmonella вторжения гена invA (GenBank присоединения номер M90846)²¹ и является быстрым, надежным и надежным в нескольких матриц^{пищи 4,22,23,24,25,26}. Метод был проверен в шести матриц корма для животных в предварительном исследовании^{26 и в} сухой корм для собак в многолабораторном совместном исследовании¹⁹. В результате, метод Salmonella LAMP представленный здесь недавно был включен в Управление по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) Бактериологическое аналитическое руководство (BAM) Глава 5 Сальмонеллы²⁷ служить двум целям, один как метод быстрого скрининга на наличие сальмонеллы в животной пище и два в качестве надежного метода подтверждения предполагаемой сальмонеллы изолированы от всех продуктов питания.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Лампа реакции смесь содержит полимеразы ДНК, буфер, MgSO₄, dNTPs, грунтовки, шаблон ДНК, и вода. Первые четыре реагента содержатся в изотермальной смеси мастера(Таблица материалов). Праймеры предварительно смешиваются в доме, чтобы стать грунтовки смеси (10x). Шаблоны ДНК могут быть подготовлены из бульонов обогащения образцов животной пищи для скрининга или из культур предполагаемых изолятов сальмонеллы для целей подтверждения. Кроме того, положительный контроль (ДНК, извлеченная из любых справочных штаммов сальмонеллы, например, Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) и отсутствие шаблонного контроля (NTC; стерильная молекулярная вода) включены в каждый запуск LAMP.

1. Подготовка шаблонов ДНК

1. Чтобы подготовить шаблоны ДНК из обогащения пищи животных, следуйте этим шагам.
   1. Асептически весят 25 г образца корма для животных (например, сухой корм для кошек, сухой корм для собак, корма для крупного рогатого скота, корма для лошадей, корма для домашних птиц и корма для свиней) в стерильный фильтровальную сумку(Таблица материалов),или эквивалент. Поместите сумку в большой контейнер или стойку для поддержки во время инкубации.
   2. Добавьте 225 мл стерильной буферной пептоновой воды (BPW). Хорошо перемешать с закрученного и краткого ручного массажа. Дайте постоять при комнатной температуре 60 ± 5 мин.
   3. Хорошо перемешать, закрученных и определить рН с тестовой бумагой. Отрегулируйте рН, при необходимости, до 6,8 ± 0,2 со стерильным 1 N NaOH или 1 N HCl. Инкубация при 35 ± 2 КК для 24 ± 2 ч.
   4. Хорошо перемешать, закрученного мешок, содержащий бульоны обогащения животной пищи. Перенесите 1 мл с фильтрованной стороны сумки в трубку с микроцентрифугом. Вортекс кратко.
   5. Извлекайте ДНК с помощью реагента дляподготовки образца (Таблицаматериалов) следующим образом.
      1. Центрифуга на 900 х г в течение 1 мин, чтобы удалить крупные частицы и передачи супернатанта в новую трубку микроцентрифуг.
      2. Центрифуга на 16000 х г в течение 2 мин и отказаться от супернатанта.
      3. Приостановить гранулы в 100 мкл реагента подготовки образца и нагреть при температуре 100 ± 1 градус по Цельсию в течение 10 мин в сухом тепловом блоке.
      4. Охладить до комнатной температуры и хранить образцы экстрактов ДНК при температуре -20 градусов по Цельсию.
2. Чтобы подготовить шаблоны ДНК из предполагаемых культур сальмонеллы, следуйте этим шагам.
   1. Получить предполагаемый salmonella изолирует от культурной изоляции во всех продуктах питания после БАМ FDA Глава 5 Сальмонеллы раздел D: Изоляция сальмонеллы²⁷.
   2. Прививка предполагаемых изолятов сальмонеллы на неселективной агарной пластине (например, агар крови, питательный агар и триптихейный соевый агар) и инкубировать при 35 ± 2 градусов по Цельсию на 24 ± 2 ч.
   3. Перенесите несколько одиночных колоний в 5 мл соевого бульона триптикейс (TSB) или бульона для инфузии сердца головного мозга (BHI) и инкубировать при 35 ± 2 кк на 16 ± 2 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть необязательным, если предполагаемая культура сальмонеллы является чистой. В этом случае шаблоны ДНК можно подготовить, приостановив несколько одиночных колоний в 5 мл TSB и нагрев 500 МКЛ подвески при температуре 100 ± 1 градус по Цельсию в течение 10 минут в сухом тепловом блоке. Продолжить с шагом 5 ниже.
   4. Перенесите 500 МКЛ ночной культуры в трубку микроцентрифуга и нагрейте при температуре 100 ± 1 градус по Цельсию в течение 10 минут в сухом тепловом блоке.
   5. Охладить до комнатной температуры и хранить изолятные экстракты ДНК при температуре -20 градусов по Цельсию.
3. Чтобы подготовить положительный контроль ДНК, следуйте аналогичным шагам, как выше для подготовки шаблонов ДНК из предполагаемых культур сальмонеллы с одним дополнительным шагом разбавления.
   1. Прививка S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) или любые справочные штаммы сальмонеллы на неселективной агарной пластине (например, агар крови, питательный агар и триптикейк соевого агара) и инкубировать при 35 ± 2 КК в течение 24 ± 2 ч.
   2. Перенесите несколько одиночных колоний на 5 мл бульона TSB или BHI и инкубировать при 35 ± 2 кк для 16 ± 2 ч, чтобы достичь 10⁹ CFU/mL.
   3. Серийно разбавляют ночную культуру в 0,1% пептоновой воды, чтобы получить 10⁷ CFU/mL.
   4. Перенесите 500 МКЛ этого разбавления в трубку микроцентрифуга и нагрейте при температуре 100 ± 1 градус по Цельсию в течение 10 минут в сухом тепловом блоке.
   5. Охладить до комнатной температуры и хранить положительный контроль ДНК при температуре -20 градусов по Цельсию.

2. Подготовка грунтового микса (10x)

1. Получить коммерчески синтезированные праймеры LAMP (Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF и Sal4-LB) со стандартной очисткой опреснивания(таблица 1).

Название праймера	Описание	Последовательность (5'-3')	Длина (bp)
Sal4-F3	Вперед внешняя грунтовка	ГААКГТГТКГГАГТК	18
Sal4-B3	Обратная внешняя грунтовка	CGGCAATAGCGTCACCTT	18
Sal4-FIP	Вперед внутренний грунтовка	GCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG	38
Sal4-BIP	Обратная внутренняя грунтовка	GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC	38
Sal4-LF	Петля вперед грунтовка	TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG	25
Sal4-LB	Петля назад грунтовка	AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG	21

Таблица 1: LAMP грунтовки для скрининга сальмонеллы в животной пище и подтверждения сальмонеллы от культурной изоляции. Праймеры разработаны на основе последовательности Salmonella invA (GenBank присоединения номер M90846).

2. Подготовьте фондовые растворы каждой грунтовоща (100 МКМ) путем регидратации грунтовок с соответствующим количеством стерильной воды молекулярного класса. Хорошо смешайте вихрем в течение 10 с и хранить при -20 градусов по Цельсию (-80 градусов по Цельсию для долгосрочного хранения).
3. Подготовка грунтовка смесь (10x) в соответствии с листом (Таблица 2). Добавьте соответствующие объемы растворов грунтовки и стерильной воды молекулярного класса в микроцентрифугную трубку. Смешайте все реагенты хорошо вихрем в течение 10 с.

Компонент	Стоковая конт. (МКМ)	Праймер микс conc. (МК)	Объем (КЛ)
Праймер Sal4-F3	100	1	10
Праймер Sal4-B3	100	1	10
Праймер Sal4-FIP	100	18	180
Sal4-BIP грунтовка	100	18	180
Sal4-LF грунтовка	100	10	100
Праймер Sal4-LB	100	10	100
Вода молекулярного класса	N/A	N/A	420
Общая	N/A	N/A	1000

Таблица 2: Лист для подготовки смеси lamp грунтовка (10x). Праймеры перечислены в таблице 1.

4. Aliquot 10x грунтовка смесь до 500 мкл на микроцентрифуг трубки и хранить при -20 градусов по Цельсию.

3. Сборка реакции LAMP

ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения перекрестного загрязнения настоятельно рекомендуется физически отделить области, используемые для подготовки мастер-микс LAMP и добавления шаблонов ДНК. Рисунок 1 является диаграммой LAMP.

Рисунок 1: Схематическая диаграмма рабочего процесса Salmonella LAMP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

1. Подготовка и запуск установки
   1. Чистая скамейка с изопропанолом и ДНК- и DNase-унизительным раствором(Таблица материалов). Чистые пипетки и держатели трубчатых полос(Таблица материалов)с раствором ДНК- и деградирующего DNase.
   2. Оттепель изотермальной смеси мастер, грунтовка смесь (10x), молекулярного класса воды, положительный контроль ДНК, и ДНК шаблоны при комнатной температуре.
   3. Включите инструмент LAMP (Таблицаматериалов) и коснитесьэкрана открытия, чтобы получить доступ к домашнему экрану. Следуйте этим шагам, чтобы создать запуск.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одна модель инструмента LAMP имеет 2 блока (A и B) с 8 образцами в каждом блоке, а другая модель имеет один блок, который вмещает 8образцов (Таблица материалов).
      1. Нажмите LAMP-Anneal и выберите Редактировать, чтобы ввести образец информации.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Профиль запуска LAMP по умолчанию состоит из усиления при 65 градусов по Цельсию в течение 30 минут и аннеальной фазы от 98 градусов по Цельсию до 80 градусов по Цельсию с 0,05 градусов по Цельсию за секунду.
      2. Нажмите на каждую строку образца, чтобы активировать курсор и ввести соответствующую информацию образца, используя значок блока AB, чтобы переключаться между двумя блоками инструмента LAMP.
      3. Нажмите значок Check, когда вся информация образца была введена.
         ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию, настройка запуска (термин "Профиль", который содержит выборку информации вместе с профилем запуска LAMP по умолчанию) может быть сохранена для более длительного использования. Нажмите на значок Сохранить и дать профилю уникальное имя. При тестировании этого же набора образцов в следующий раз можно начать новый запуск с помощью сохраненного профиля. Нажмите на значок Folder в левом нижнем углу домашнего экрана и выберите профиль для загрузки сохраненных профилей.
2. Сборка реакции LAMP
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании обоих блоков приборов LAMP (A и B, в общей сложности 16 образцов), подготовить мастер-микс LAMP для 18 образцов. При использовании только одного блока приборов LAMP (всего 8 образцов) подготовьте мастер-микс LAMP для 10 образцов. Для других номеров выборки соответствующим образом отрегулируйте громкость с учетом потерь труб. Всегда включите положительный контроль и NTC в каждом запуске LAMP. Рекомендуется дублировать тестирование каждого образца в независимых пробегах LAMP.
   1. Подготовка мастер-микс LAMP в соответствии с листом(таблица 3). Добавить соответствующие объемы изотермальной смеси мастера, грунтовки смеси и молекулярного класса воды в микроцентрифуг трубки и вихрь мягко в течение 3 с. Центрифуга кратко.
   2. Поместите полосу трубки в держатель полосы и распределите 23 л смеси мастера LAMP для каждой хорошо.
   3. Vortex все шаблоны ДНК и центрифуги кратко. Добавьте 2 МКЛ шаблона ДНК к соответствующему хорошо и крышка плотно.
   4. Снимите полосу трубки с держателя и Флик запястье, чтобы убедиться, что все реагенты объединились в нижней части трубки.
   5. Загрузите полосу трубки в блок инструмента LAMP (ы), обеспечивая безопасность колпачков перед закрытием крышки.

Компонент	Рабочий конт.	Окончательная реакция конт.	Объем на образец (ОЛ)	Объем для 18 образцов (ОЛ)	Объем для 10 образцов (ОЛ)
ISO-001 изотермальная мастер-микс	1,67x	1x	15	270	150
Смесь праймера	10x	1x	2.5	45	25
Вода молекулярного класса	N/A	N/A	5.5	99	55
Мастер микс субтотал	N/A	N/A	23	414	230
Шаблон ДНК	N/A	N/A	2	N/A	N/A

Таблица 3: Лист для подготовки смеси реакции LAMP. Смесь грунтовки (10x) готовится в соответствии с таблицей 2 с использованием фондовых решений грунтовок, перечисленных в таблице 1.

4. ЛАМП Run

ПРИМЕЧАНИЕ: Во время запуска LAMP показания флуоресценции приобретаются с помощью канала FAM. Значения времени до пика(T_max;min) определяются автоматически инструментом для точки времени, когда соотношение флуоресценции достигает максимального значения кривой скорости усиления. Т _м (КК) — это температура плавления/анны конечного усиленного продукта.

1. Нажмите на значок Run в правом верхнем правом верхнем справа от экрана и выберите блок (ы), содержащий полосу трубки (ы), чтобы начать запуск LAMP.
2. Дополнительно, в то время как реакция продолжается, нажмите Температура, Усиление, и Аннеал вкладок, чтобы увидеть динамические изменения различных параметров во время запуска LAMP.
3. Как только запуск завершен, нажмите вкладки Amplification и Anneal, чтобы увидеть полное усиление и аннеальные кривые и коснитесь вкладки Результаты для просмотра результатов.
4. По желанию, для хранения записей, записывают номер запуска, расположенный в левом верхнем левом верхнем слева от экрана, используя формат "инструментальный серийный номер number_run", например, "GEN2-2209-0030".

5. Интерпретация результатов LAMP

ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты LAMP можно просматривать на панели приборов LAMP непосредственно и/или с помощью программного обеспечения LAMP(Таблица материалов).

1. Чтобы интерпретировать результаты LAMP на панели приборов, следуйте этим шагам.
   1. Нажмите значок Folder в левом нижнем углу домашнего экрана и выберите журнал, чтобы перейти к местоположению файла, чтобы загрузить lamp перспективе интереса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Lamp работает организованы по дате, начиная с года.
   2. Соблюдайте пять вкладок, связанных с каждым запуском: Профиль, Температура , Усиление, Аннеал, и результаты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вкладки профиля и температуры показывают запрограммированные и фактические температуры, соответственно, в образцах скважин по мере продолжения реакции LAMP. Вкладки Amplification и Anneal показывают показания флуоресценции и изменения флуоресценции во время усиления и аннеальных фаз, соответственно. Вкладка Результаты показывает табкулярное представление результатов LAMP.
   3. Нажмите на вкладку Результаты, чтобы наблюдать за результатами LAMP для каждой хорошо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Есть три колонки (Ну, усиление, и Аннеал). Столбец "Усиление" показывает значения времени до пика(T_max; min:sec) для каждого образца ("Ну") и столбец "Anneal" показывает температуру плавления/анны(T_m; C) для любого усиленного продукта в этом хорошо.
   4. Интерпретируйте результаты LAMP и сообщайте окончательные результаты LAMP следующим образом.
      1. Сначала изучите контрольные скважины. Ну NTC должен иметь чистый T_макс в то время как T_m может быть либо пустым (как модели инструмента LAMP) или LT; 83 C (только для модели инструмента LAMP с двумя блоками). Положительный контроль хорошо должен иметь T_макс между 5 и 10 мин и T_м около 90 градусов по Цельсию.
      2. Изучите пробные скважины. Все образцы с правильным Т_м (примерно 90 градусов по Цельсию) и T_max (от 5 до 30 мин) считаются положительными для сальмонеллы.
      3. Сообщите окончательные результаты LAMP на основе результатов дублирующихся запусков. Если дубликаты трасс имеют последовательные результаты, можно будет узнать окончательные результаты LAMP. Если дублирующиеся запуски несовместимы, повторите оба прогона самостоятельно. Если результаты по-прежнему несовместимы, образец следует считать предполагаемым положительным для сальмонеллы и должны пройти через подтверждение культуры.
2. Чтобы интерпретировать результаты LAMP с помощью программного обеспечения, следуйте этим шагам.
   1. Нажмите на значок компьютера на левой панели и перейдите к местоположению файла, чтобы загрузить работать LAMP интерес.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Компьютер с установленным программным обеспечением не должен быть подключен к инструменту LAMP для анализа результатов LAMP, т.е. доступен удаленный доступ. Пробеги LAMP организованы по дате.
   2. Соблюдайте семь вкладок, связанных с каждым запуском: Профиль ,Температура , Усиление , Скорость усиления, Аннеал, Аннеал производная, и результат.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подобно представлению панели приборов, вкладки Профиль и Температура показывают запрограммированные и фактические температуры, соответственно, в образцах скважин по мере продолжения реакции LAMP. Коэффициент усиления/усиления и вкладки Anneal/Anneal Derivative показывают показания флуоресценции или изменения флуоресценции во время фаз усиления и аннеальной фазы, соответственно. Вкладка Результаты показывает табличное представление результатов LAMP, которые немного отличаются от вида панели приборов.
   3. Нажмите на вкладку Amplification Rate, чтобы просмотреть графическое отображение соотношения флуоресценции по времени. Нажмите на значок Настройки в правом верхнем правом верхнем справа от экрана и отрегулируйте коэффициент порога обнаружения пика с 0,020 до 0,010.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Корректировка необходима для обеспечения того, чтобы все действительные пики были идентифицированы, а результаты, полученные с помощью программного обеспечения, совпадают с результатами, отображаемыми на панели приборов.
   4. Нажмите на вкладку Result, чтобы наблюдать за результатами LAMP для каждой колодец.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Есть четыре столбца (Имя графика, Ну номер, Ну имя, и пиковое значение). Верхняя часть столбца "Peak Value" показывает "Amp Time"(T_max; min:sec) для каждого образца ("Ну имя"), в то время как нижняя часть показывает "Anneal Derivative"(T_m; C) для любого усиленного продукта в том, что хорошо.
   5. Интерпретировать результаты LAMP и сообщить окончательные результаты LAMP следующие аналогичные шаги, как при использовании панели приборов с одним исключением, что NTC хорошо и другие отрицательные образцы должны иметь пустой T_м, как lamp настройки программного обеспечения устранить эти T_м Lt; 83 кк результаты. Аналогичным образом, все образцы с правильным Т_м (примерно 90 градусов по Цельсию) и T_макс (между 5'30 мин) считаются положительными для сальмонеллы.

Results

На рисунке 2 и рисунке 3 показаны репрезентативные графики/таблицы LAMP, отображаемые на обеих платформах. В этом запуске LAMP образцы S1 to S6 являются 10-кратными серийными разбавлениями S. enterica serovar Infantis ATCC 51741 в диапазоне от 1,1 х 10⁶ CFU до 11 CFU за реакцию. Положительный контроль S. enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) на 1,7 х 10⁴ CFU на реакцию и NTC молекулярного класса воды.

Как показано на рисунке 2E и рисунок 3G, как NTC и PC скважины являются действительными контроля. NTC хорошо имеет пустой T_макс в то время как T_м является lt; 83 КК на панели приборов LAMP и пустой в программном обеспечении LAMP, предлагая отрицательный результат. PC хорошо имеет T_макс 7 мин 45 сек и T_м из 90 градусов по Цельсию на обеих платформах, что свидетельствует о положительном результате. Образцы S1 до S6 имеют T_{макс между} 6 мин 30 сек и 12 мин 15 сек, все время Salmonella-положительный.

После дублирования проб одного и того же набора lamp для этих образцов сообщаются окончательные результаты LAMP. Этот репрезентативный запуск LAMP показывает, что LAMP успешно обнаруживает сальмонеллу с широким диапазоном концентраций в образцах.

Рисунок 2: Репрезентативные результаты LAMP отображаются на панели приборов LAMP. (A)Вкладка Профиль показывает запрограммированный температурный профиль. (B) Вкладка Температура показывает фактические температуры в образца скважин, как LAMP реакция продолжается. (C)Вкладка усиления показывает показания флуоресценции во время усиления LAMP. (D)Вкладка Anneal показывает изменения в флуоресценции (производной) во время аннеальной фазы. (E) Вкладка Результаты показывает табллярное представление результатов LAMP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Репрезентативные результаты LAMP, просмотренные в программном обеспечении LAMP. (A)Вкладка Профиль показывает запрограммированный температурный профиль. (B) Вкладка Температура показывает фактические температуры в образца скважин, как LAMP реакция продолжается. (C)Вкладка усиления показывает показания флуоресценции во время усиления LAMP. (D)Вкладка Скорость усиления показывает изменения в флуоресценции (коэффициент флуоресценции) во время усиления LAMP. (E) Вкладка Anneal показывает показания флуоресценции во время аннеальной фазы. (F)Вкладка Anneal Derivative показывает изменения в флуоресценции (производной) во время аннеальной фазы. (G) Вкладка Результат показывает табулированное представление результатов LAMP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Мы представили здесь простой, быстрый, конкретный и чувствительный метод LAMP для скрининга и подтверждения сальмонеллы в пище животных и чистой культуре, соответственно. С удобством изотермальной смеси мастер, который содержит четыре ключевых реагентов, и готовый к использованию, в доме подготовлен грунтовка смесь, сборка реакции LAMP требует лишь несколько шагов трубы (Рисунок 1). Общее время времени времени времени, включая усиление и аннеальные фазы, составляет менее 38 мин(рисунок 2A,B и рисунок 3A,B). Положительные результаты отслеживаются с помощью флуоресценциив режиме реального времени (рисунок 2C и рисунок 3C,D)и могут быть обнаружены уже в 5^{мин 26}. Аннеальная фаза служит дополнительным подтверждением специфичности LAMP, так как только образцы с правильным T_m (около 90 градусов по Цельсию) сообщаются как положительные(рисунок 2D,E и рисунок 3E'G). Чувствительность 1 клетка сальмонеллы в чистой культуре и Lt; 1 CFU/25 г в животной пище были зарегистрированы ранее²⁶.

Как LAMP является довольно эффективным и генерирует большое количество^{ДНК 1}, очень важно, чтобы лучшие лабораторные практики используются для предотвращения перекрестного загрязнения, которые могут включать в себя физическое разделение областей для подготовки LAMP мастер смеси и добавления шаблонов ДНК, избегая генерации аэрозолей, используя фильтр пипетки советы, изменение перчатки часто, и воздерживаться от открытия ЛАМП реакции труб после усиления.

Специфика этого метода Salmonella LAMP ранее была протестирована с использованием 300 бактериальных штаммов (247 сальмонеллы 185 серов и 53 не-сальмонеллы ) и продемонстрировала, что 100% конкретные²⁶. Примечательно, что значительные различия в T_max наблюдались между двумя видами сальмонеллы, S. enterica и Salmonella bongori, а также среди подвидов S. enterica, особенно subsp. arizonae (IIIa)²⁶. Тем не менее, они по-прежнему являются действительными положительными результатами по правилам интерпретации результатов LAMP. В нашем многолабораторном совместном исследовании в сухом корме для собак, в котором^{приняли участие 14 аналитиков 19}, образцы, имеющие несовместимые результаты в дублировать LAMP работает иногда наблюдается. Они обычно участвуют образцы с задержкой_{положительных результатов} (Tмакс йgt; 15 мин). Повторение обоих запусков самостоятельно обычно решает проблему. Реже мы наблюдали образцы с правильным T m,_но нет или нерегулярные значения T_max (lt; 5 мин). Обычно это было вызвано пузырьками воздуха в реакционной трубке.

На протяжении всего жизненного цикла разработки метода LAMP, оценки, преколлаборативного исследования и многолабораторной проверки, мы наблюдали высокую толерантность LAMP к ингибиторам в различных животных пищевых или пищевых^{матриц и культурных средств массовой}информации 4^,19,22,23,24, подчеркивая надежность метода и сотрудничая многочисленные другие исследования в глобальном^{масштабе 8}. Это выше по сравнению с ПЦР или ПЦР в режиме реального времени, что обычно требует внутреннего контроля усиления, чтобы гарантировать, что отрицательные результаты не из-за матричного^{ингибирования 28}. Кроме того, LAMP продемонстрировал аналогичную (или превосходящий) специфичность и чувствительность по сравнению с ПЦР или ПЦР в режиме реального времени в подавляющем большинстве^{исследований 8}. Стоимость реагентов LAMP составляет около $ 1 за реакцию. Инструменты LAMP, используемые в этом протоколе, являются небольшими, низким уровнем обслуживания и портативными. Они могут обрабатывать любой изотермальный метод усиления, который использует целевое обнаружение путем измерения флуоресценции, LAMP включены. Используя программное обеспечение LAMP, всеобъемлющие отчеты могут быть сгенерированы в нескольких форматах (pdf, текст и изображение).

Проверка метода является критическим шагом, прежде чем новый метод может быть принят для регулярного использования. Примечательно, что протокол LAMP, о котором сообщается здесь, успешно завершил многобораторную проверку^19. С недавним включением этого протокола LAMP в БАМ США Глава 5 Сальмонеллы²⁷, ожидается,что метод получит гораздо более широкое использование, как как метод быстрого скрининга в животной пище и в качестве надежного метода подтверждения для предполагаемого salmonella изолирует от всех категорий продуктов питания.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Бульон для инфузии сердца (BHI)	BD Diagnostic Systems, Sparks, MD	299070	Жидкая питательная среда, используемая при выращивании сальмонеллы.
Буферная пептонная вода (BPW)	BD Диагностические системы, Sparks, MD	218105	Среда для предварительного обогащения для восстановления сальмонеллы из образцов продуктов животного происхождения.
DNA AWAY	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	7010	Удаляет нежелательную ДНК и ДНКазу с лабораторных столов, стеклянной и пластиковой посуды, не влияя на последующие образцы ДНК.
Программное обеспечение Genie Explorer	OptiGene Ltd., Западный Сассекс, Великобритания	Версия 2.0.6.3	Поддерживает дистанционное управление приборами Genie, включая прогоны LAMP и анализ данных.
Genie II или Genie III (прибор LAMP)	OptiGene Ltd., Западный Сассекс, Великобритания	GEN2-02 или GEN3-02	Небольшой прибор, способный регулировать температуру до 100°; C с ± 0,1 ° C и одновременное обнаружение флуоресценции по каналу FAM. Genie II имеет 2 блока (A и B) по 8 сэмплов в каждом блоке. Genie III имеет один блок, который вмещает 8 образцов.
Genie strip	OptiGene Ltd., Западный Сассекс, Великобритания	OP-0008	8-луночные микротрубчатые полоски со встроенными стопорными колпачками и рабочим объемом от 10 до 150 мкс.
Держатель ленты Genie	OptiGene Ltd., Западный Сассекс, Великобритания	GBLOCK	Используемый для удержания полосок Genie при настройке реакции LAMP, алюминиевый держатель также можно использовать в качестве холодного блока.
Раствор соляной кислоты (HCl), 1 Н	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	SA48-500	Регулирует pH образцов корма для животных после добавления BPW и перед ночным обогащением.
Тепловой блок	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	88-860-022	Нагревает образцы при 100 & 1 oC для экстракции ДНК.
Инкубатор	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	3960	Стандартный лабораторный инкубатор.
ISO-001 изотермическая мастер-смесь	OptiGene Ltd., Западный Сассекс, Великобритания	ISO-001	Оптимизированная мастер-смесь для упрощения сборки LAMP-реакции, содержащая большой фрагмент ДНК-полимеразы GspSSD из Geobacillus spp., термостабильную неорганическую пирофосфатазу, реакционный буфер, MgSO4, dNTP и двухцепочечный ДНК-связывающий краситель (канал детектирования FAM).
Изопропанол	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	A416	Дезинфицирует рабочие поверхности.
Праймеры LAMP	Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA	Custom	LAMP праймеры с подробной информацией в таблице 1.
Микроцентрифуга	Eppendorf North America, Хауппаг, штат Нью-Йорк	22620207	персональная микроцентрифуга MiniSpin plus.
Микроцентрифужные пробирки	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	05-408-129	Стандартные микроцентрифужные пробирки.
Молекулярная вода	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	AM9938	Используется при изготовлении грунтовочных акций, грунтовочной смеси и реакционной смеси LAMP.
Раствор гидроксида натрия (NaOH), 1 Н	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	SS266-1	Регулирует pH образцов корма для животных после добавления BPW и перед ночным обогащением.
Неселективный агар (например, кровяной агар, питательный агар и триптиказный соевый агар)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	R01202	Твердая питательная среда, используемая при выращивании сальмонеллы.
Пептонная вода	BD Diagnostic Systems, Sparks, MD	218071	Разбавляет в течение ночи культуры сальмонеллы для получения положительной контрольной ДНК.
Пипетки и наконечники	Mettler-Toledo Rainin LLC, Окленд, Калифорния	Серия Pipet Lite LTS Стандартные	лабораторные пипетки и наконечники.
Реактив для подготовки образцов PrepMan Ultra	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	4318930	Простой набор, используемый для быстрой подготовки шаблонов ДНК для использования в реакции LAMP.
Референсный штамм сальмонеллы LT2	ATCC, Manassas, VA	700720	Референсный штамм сальмонеллы используется в качестве положительного контроля.
Триптиказ соевого бульона (TSB)	BD Диагностические системы, Sparks, MD	211768	Жидкая питательная среда, используемая при выращивании сальмонеллы.
Вихревой смеситель	Scientific Industries, Inc., Богемия, Нью-Йорк	SI-0236 Стандартный	лабораторный вихревой смеситель.
Фильтр-мешок Whirl-pak	Nasco Sampling Brand, Форт Аткинсон, WI	B01318	Фильтр-мешки для хранения образцов корма для животных для предварительного обогащения.