Методическая статья

Подготовка сетчатой формы инженерных сердечных тканей, полученных из человеческих клеток iPS для ремонта миокарда In Vivo

DOI:

10.3791/61246

⸱

9 июня 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Translational Research Program, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, 2Department of Cardiovascular Surgery, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 3Laboratory of Stem Cell and Neuro-Vascular Biology, Cell and Developmental Biology Center, National Institutes of Health, 4Kosair Charities Pediatric Heart Research Program, Cardiovascular Innovation Institute, University of Louisville, 5Department of Pediatrics, School of Medicine, University of Louisville, 6Department of Cardiovascular Surgery, Mitsubishi Kyoto Hospital, 7Cincinnati Children's Heart Institute

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол генерирует сетчатой формы инженерии сердечных тканей, содержащих сердечно-сосудистые клетки, полученные из человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, чтобы исследование клеточной имплантации терапии сердечных заболеваний.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Текущий протокол описывает методы для создания масштабируемых, сетчатой формы инженерии сердечных тканей (ECTs), состоящий из сердечно-сосудистых клеток, полученных из человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), которые разработаны в направлении цели клинического использования. HiPSC полученных кардиомиоцитов, эндотелиальных клеток и сосудистых клеток фрески смешиваются с гель матрицы, а затем вылил в полидиметилсилоксана (PDMS) ткани формы с прямоугольными внутренними шахматной должностей. По культуре день 14 ECTs созревают в 1,5 см х 1,5 см сетки структуры с 0,5 мм диаметром миофибер расслоения. Кардиомиоциты выравниваются к длинной оси каждого пучка и спонтанно бьют синхронно. Этот подход может быть увеличен до большего (3,0 см х 3,0 см) сетки ЭСТ при сохранении созревания конструкции и функции. Таким образом, сетчатые ЭКТы, генерируемые из сердечных клеток, полученных из hiPSC, могут быть осуществимы для парадигм регенерации сердца.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многочисленные доклинические исследования и клинические испытания подтвердили эффективность клеточной сердечной регенеративной терапии для отказасердца 1,2,3. Среди различных типов клеток, человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) являются перспективными источниками клеток в силу их пролиферативной способности,потенциал для создания различных сердечно-сосудистых линий 4,5, и алогенности. Кроме того, технологии тканевой инженерии сделали возможным перенос миллионов клеток на поврежденное сердце

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Поддержание HIPSCs и сердечно-сосудистой дифференциации

  1. Расширить и поддерживать hiPSCs на тонком пальто подвале мембранной матрицы (фактор роста уменьшается, 1:60 разбавления) в кондиционированной среде извлечены из мыши эмбриональных фибробластов (MEF-CM) с основным фактором роста фибробластов человека (hbFGF)4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали hiPSCs (4-фактор (Oct3/4, Sox2, Klf4 и c-Myc) линия: 201B6). Добавьте hbFGF при соответствующей концентрации для каждой клеточной линии. Фрагмент Laminin-511 также может быть использован для покрытия культуры блюдо вместо мембранной матрицы подвала. Коммерчески доступная среда, предназначенн....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1A,B показаны схемы протокола CM-EC и MC. После индуцирования CMs и ECs из протокола CM-EC и MCs из протокола MC, клетки смешиваются, регулируя окончательные концентрации MC, чтобы представлять от 10 до 20% от общего количества ячеек. Форма ткани шириной 2 см изготовлена по чертежу из листа PDMS толщиной 0,5 мм(рисунок 2A,B). Шесть миллионов клеток CM-EC-MC сочетаются с коллагеном I и матрицей и выливаются на форму тк.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После завершения нашего исследования линейного формата, hiPSC производных ЭСТ5, мы адаптировали протокол для смешивания hiPSC полученных CMs, ECs, и MCs для облегчения в пробирке расширение сосудистых клеток в РАМКАХ ИТС и последующего в виво сосудистой связи между ECTs и получателя миокарда.

Для облегчения генерации больших, имплантируемых геометрий сетки ЭСТ мы использовали тонкие листы PDMS для разработки 3D-форм с погрузочными столбами, выстроенными в шахматном поло.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет финансовых или научных конфликтов для раскрытия.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была финансово поддержана Kosair Благотворительные педиатрические исследования сердца программы в Университете Луисвилла и органоидный проект в RIKEN Центр биосистемных исследований динамики. HiPSCs, используемые в наших опубликованных протоколах, были предоставлены Центром исследований и применения клеток iPS, Киотский университет, Киото, Япония.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<прочные>материалы
Тарелки для клеточных культур 100x20 мм стильFalcon/ Thomas scientific9380C51
Многолуночные планшеты для клеточных культур 6well 50/CSFalcon / Thomas scientific6902A01
Sylgard 184 Набор силиконовых эластомеровDow Corning761036
<сильно>Реагенты
AccumaxInnovative Cell TechnologiesAM-105
BMP4, рекомбинантные (10&микро; g)R& DRSD-314-BP-010
Коллаген, раствор типа I из крысиного хвостаSigmaC3867
Уменьшенный фактор роста MatrigelCorning356231
человека VEGF (165) IS, премиум классMiltenyi130-109-385
Pluronic F-127, 0,2 &; m фильтрованный (10% раствор в воде)Молекулярные зондыP-6866
Рекомбинантный человеческий bFGFWAKO060-04543
Рекомбинантный человек/мышь/крыса ActivinA (50&микро; g)R& D338-AC-050
rh Wnt-3a (10&микро; g)R& D5036-WN
Versene растворGibco15040066
Питательная среда и добавки
10xMEM Invitrogen11430
2 Mercaptro EthanolSIGMAM6250
B27 добавка минус инсулинGibco
DMEM,Gibco11965084
сыворотка для плода крупного рогатого скота (500 мл)Любая
сыворотка для крупного рогатого скота (500 мл)Любая
L-глутаминGibco25030081
NaHCO3Any
PBS 1xGibco10010-031
Пенициллин-стрептомицин (5000 ЕД/мл)Gibco15070-063
RPMI1640 среднийGibco21870092
&альфа; MEMInvitrogen11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, клон: TRA-1-60, BD BiosciencesBD / Fisher560380
антитропонин T, сердечная изоформа Ab-1, клон: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision FisherMS-295-P0
BD FACS Clean РешениеBD340345
BD FACSБоболочная жидкость с низким содержаниемоболочки BD342003
BD FACSРинс РастворBD340346
EDTAЛюбая
пробирка Falcon с колпачком для клеточного фильтра (Кейс из 500 штук)Corning352235
сыворотка для плода крупного рогатого скота (500 мл)Любой
LIVE/DEAD Исправляемый набор для окрашивания мертвых клеток Aqua, длямолекулярных зондовL34957
PDGFRb; анти-CD140b, R-PE, клон: 28D4, BD BiosciencesBD / Fisher558821
сапонинSigma-Aldrich47306-50G-F
VEcad-FITC; анти-CD144, FITC, клон: 55-7H1, BD BiosciencesBD / Fisher560411
Zenon Alexa Fluor 488 мышь IgG1 Набор для маркировкимолекулярных зондовZ25002
A1895601 возбуждения 405 нм

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
  2. Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

407

Похожие статьи