Методическая статья

Подготовка сетчатой формы инженерных сердечных тканей, полученных из человеческих клеток iPS для ремонта миокарда In Vivo

DOI:

10.3791/61246

⸱

9 июня 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Translational Research Program, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, 2Department of Cardiovascular Surgery, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 3Laboratory of Stem Cell and Neuro-Vascular Biology, Cell and Developmental Biology Center, National Institutes of Health, 4Kosair Charities Pediatric Heart Research Program, Cardiovascular Innovation Institute, University of Louisville, 5Department of Pediatrics, School of Medicine, University of Louisville, 6Department of Cardiovascular Surgery, Mitsubishi Kyoto Hospital, 7Cincinnati Children's Heart Institute

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол генерирует сетчатой формы инженерии сердечных тканей, содержащих сердечно-сосудистые клетки, полученные из человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, чтобы исследование клеточной имплантации терапии сердечных заболеваний.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Текущий протокол описывает методы для создания масштабируемых, сетчатой формы инженерии сердечных тканей (ECTs), состоящий из сердечно-сосудистых клеток, полученных из человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), которые разработаны в направлении цели клинического использования. HiPSC полученных кардиомиоцитов, эндотелиальных клеток и сосудистых клеток фрески смешиваются с гель матрицы, а затем вылил в полидиметилсилоксана (PDMS) ткани формы с прямоугольными внутренними шахматной должностей. По культуре день 14 ECTs созревают в 1,5 см х 1,5 см сетки структуры с 0,5 мм диаметром миофибер расслоения. Кардиомиоциты выравниваются к длинной оси каждого пучка и спонтанно бьют синхронно. Этот подход может быть увеличен до большего (3,0 см х 3,0 см) сетки ЭСТ при сохранении созревания конструкции и функции. Таким образом, сетчатые ЭКТы, генерируемые из сердечных клеток, полученных из hiPSC, могут быть осуществимы для парадигм регенерации сердца.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многочисленные доклинические исследования и клинические испытания подтвердили эффективность клеточной сердечной регенеративной терапии для отказасердца 1,2,3. Среди различных типов клеток, человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) являются перспективными источниками клеток в силу их пролиферативной способности,потенциал для создания различных сердечно-сосудистых линий 4,5, и алогенности. Кроме того, технологии тканевой инженерии сделали возможным перенос миллионов клеток на поврежденное сердце5,,6,,7,,8.

Ранее мы сообщали о генерации трехмерных (3D) линейных инженерных сердечных тканей (ЭКТ) из сердечно-сосудистых линий, полученных из hiPSC, с использованием коммерчески доступной системы культуры для 3D биоискусныхтканей 5,7. Мы обнаружили, что сосуществование сосудистых эндотелиальных клеток и фресок с кардиомиоцитами в рамках ЭСТ облегчает созревание структурных и электрофизиологических тканей. Кроме того, мы подтвердили терапевтический потенциал имплантированных hiPSC-ECTs в иммунной толерантной модели инфаркта крыс миокарда для улучшения сердечной функции, регенерации миокарда, и повышения ангиогенеза5. Тем не менее, линейные ЭКТ, построенные этим методом, были 1 мм на 10 мм цилиндрами и поэтому не подходили для имплантации в доклинических исследованиях с более крупными животными или клиническом использовании.

Основываясь на успешном использовании тканевых форм для генерации пористой инженерии формирования тканей с использованием крыс скелетныхмиобластов и кардиомиоцитов 9, человека ESC полученных кардиомиоцитов10 и мыши iPSCs11, мы разработали протокол для создания масштабируемых hiPSC полученных больших имплантируемых тканей с использованием полидиметилсилоксана (PDMS) формы. Мы оценили ряд геометрий плесени, чтобы определить наиболее эффективные характеристики плесени. Сетчатые ЭКТ с несколькими пучками и соединениями продемонстрировали отличные характеристики в жизнеспособности клеток, функции тканей и масштабируемости по сравнению с простым листом или линейными форматами, в которых отсутствовали поры или соединения. Мы имплантировали СЕТ в форме сетки в модель инфаркта миокарда крысы и подтвердили его терапевтические эффекты, похожие на имплантированные цилиндрическиеЭКТ 12. Здесь мы описываем протокол для создания СЕТ в форме сетки, полученной от hiPSC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Поддержание HIPSCs и сердечно-сосудистой дифференциации

  1. Расширить и поддерживать hiPSCs на тонком пальто подвале мембранной матрицы (фактор роста уменьшается, 1:60 разбавления) в кондиционированной среде извлечены из мыши эмбриональных фибробластов (MEF-CM) с основным фактором роста фибробластов человека (hbFGF)4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали hiPSCs (4-фактор (Oct3/4, Sox2, Klf4 и c-Myc) линия: 201B6). Добавьте hbFGF при соответствующей концентрации для каждой клеточной линии. Фрагмент Laminin-511 также может быть использован для покрытия культуры блюдо вместо мембранной матрицы подвала. Коммерчески доступная среда, предназначенная для культуры HIPSCs, свободной от фидеры, может быть использована в качестве замены MEF-CM.
  2. Используйте versene (0.48 mM этилендиаминетачелтетраатетическая кислота (EDTA) раствор), чтобы отделить и разъединить клетки, когда слияние клеток достигает 90-u2012100%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие коммерчески доступные продукты для диссоциации клеток также могут быть использованы.
  3. Клетки плиты при плотности 10 000 клеток/мм2 на матричных пластинах клеточной культуры в MEF-CM с hbFGF и культурой в течение двух-трех дней.
  4. Когда культура становится полностью слияние, покрыть клетки с матрицей (1:60 разбавления с MEF-CM) в течение одного дня.
  5. Замените MEF-CM на RPMI 1640 и B27 среды. Добавьте 100 нг/мл Activin A и 100 нг/мл Wnt3A в среду в течение одного дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это день 0 дифференциации. Для перерегистрации канонической сигнализации Wnt вместо Wnt3A можно также использовать ингибиторы GSK3.
  6. На первый день дифференциации измените средний на новый RPMI 1640 и B27 с 10 нг/мл BMP4 и 10 нг/мл hbFGF. Культурные ячейки в течение двух (протокол MC) или четырех (протокол CM-EC) дней без среднего изменения5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол СМЗЕК оптимизирован для одновременного индуцирования кардиомиоцитов (СМ) и сосудистых эндотелиальных клеток (ЭК). Протокол MC оптимизирован, чтобы преимущественно индуцировать сосудистые клетки фрески (MCs).
  7. Протокол CM-EC для индукции CMs и ECs(рисунок 1A).
    1. Замените носитель на 5-й день дифференциации с RPMI 1640 и B27, дополненной 50 нг/мл VEGF165.
    2. Изменение среды культуры каждые 48 ч до дня 13-u201215 дифференциации.
  8. Протокол MC для индукции сосудистых клеток фрески(рисунок 1B)
    1. Замените среду с RPMI1640 и 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) в день 3 дифференциации.
    2. Изменение среды культуры каждые 48 ч до дня 13-u201215 дифференциации.

2. Сотовый сбор и анализ линии в день дифференциации 13-u201215

  1. Вымойтеклетки с Ca2 "и Mg 2" бесплатно фосфат-буферный солевой раствор (PBS).
  2. Добавить раствор диссоциации клеток (содержащий протеазы, коллагеназы и ДНК) в блюдо клеточной культуры, чтобы покрыть пластину. Инкубировать тарелку в течение 5 минут при 37 градусов по Цельсию.
  3. Соберите и отмежевать клетки с культурой среды с помощью пипетки после инкубации.
  4. Выделите 1 x 106 клеток для анализа линии с цитометрией потока. Для устранения мертвых клеток, пятно клеток с починимой жизнеспособности красителя.
  5. Пятно клеток с мембранными маркерами поверхности в PBS с 5% FBS. Используйте следующие разбавления антител в флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) окрашивание буфера: анти-PDGFR (1:100), анти-VE кадерин (1:100), анти-TRA-1-60 (1:20).
  6. Для внутриклеточных белков, resuspend и исправить клетки с 4% параформальдегида (PFA) в PBS.
  7. Пятно клеток с анти-сердечной изоформы Troponin T (cTnT) в PBS с 5% FBS и 0,75% Сапонин, а затем этикетки антитела cTnT с 488 мыши IgG1 (разбавление 1:50).
  8. Resuspend окрашенных клеток в PBS с 5% FBS и положить их в facS трубки с напряжением клеток.
  9. Проанализируйте клеточный состав окрашенных клеток из каждого протокола дифференциации с цитометрией потока, чтобы облегчить генерацию клеточных суспензий с определенными распределениями линий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении этой процедуры, оставшаяся подвеска ячейки для ECTs сохраняется в холодильнике 4 градусов по Цельсию.

3. Изготовление формы ткани PDMS

  1. Бросьте 0,5 мм толщиной и более 30 мм х 30 мм слой полидиметилсилоксана (PDMS) путем смешивания преполимера и перекрестного связывания раствора в соотношении 10:1, а затем вылечить при 80 градусов по Цельсию в течение 3 ч.
  2. Вырезать лист PDMS и склеить его с силиконовым клеем, чтобы изготовить 21 мм х 20,5 мм прямоугольный лоток с 7 мм в длину, 0,5 мм в ширину, и 2,5 мм высотой прямоугольные столбы в шахматном положении. Горизонтальное расстояние между двумя линиями столбов составляет 2,5 мм(рисунок 2B).
  3. Автоклав лоток при 120 градусов по Цельсию в течение 20 мин.
  4. Пальто лоток с 1% poloxamer 407 в PBS для 1 ч. Промыть poloxamer 407 и промыть плесень с PBS достаточно до использования.

4. Строительство ЭСТ

  1. После анализа клеточной линии объедините клетки из протоколов CM-EC и MC так, чтобы окончательная концентрация MCs составила от 10 до 20% в общем количестве клеток в шесть миллионов клеток наконструкцию 5.
  2. Приостановить смешанные шесть миллионов клеток в среде культуры ЭСТ (альфа-минимум существенной среды дополняется 10% FBS, 50 ЗМ 2-меркаптоэтанол и 100 U/mL пенициллин-стрептомицин).
  3. Подготовка матричного раствора
    1. Смешайте 133 л растворимого кислотой растворимого крысиного хвоста коллагена типа I (2 мг/мл, рН 3) с 17 л 10-х минимальной необходимой среды (MEM). Затем смешайте раствор с 17 ЗЛ щелочного буфера (0,2 М НаХКО3,0,2 М HEPES и 0,1 М НаОХ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коллаген должен храниться на льду (4 градусов по Цельсию). Проверьте цвет буфера, и если среда не станет розоватой, когда все решения смешиваются, добавьте дополнительный щелочный буфер к среде. Смешивание шаги должны быть смешать коллагена I и 10x MEM, а затем добавить щелочный буфер. НЕ меняй этот порядок. НЕ генерировать пузырьки в смеси.
    2. Добавьте 67 мкл мембранной матрицы подвала в нейтрализованный коллагеновый раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смешанный раствор должен храниться на льду (4 градусов по Цельсию).
  4. Центрифуга подготовленной клеточной суспензии, содержащей шесть миллионов клеток при 1100 об/мин (240 х г)в течение 5 мин и повторного перерасхода клеток с 167 йл высоко глюкозы DMEM 20% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин (100x).
  5. Смешайте подвеску клетки и матричное решение. Общий объем клеточной/матричной смеси для одной конструкции составляет 400 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь клетки/матрицы должна быть невязкой и розоватым цветом на этом этапе. Держите его на льду, как гель будет затвердевать при комнатной температуре. Окончательная концентрация коллагена типа I составляет 0,67 мг/мл.
  6. Налейте клеточной / матричной смеси равномерно над poloxamer 407 покрытием PDMS ткани плесени, которая помещается в шесть хорошо культурыпластины 12.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Налейте смесь тщательно, чтобы избежать генерации пузырьков, с тем чтобы предотвратить заполнение дефектов в налил гель.
  7. Инкубировать клеточной/матричной смеси в стандартном инкубаторе CO2 (37C, 5% CO2) в течение 60 мин.
  8. После того, как ткань формируется, замочите плесень ткани с 4 мл ЭСТ культуры среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что ячейка/матрица пересекается за 60 минут, конструкция все еще очень хрупкая. Добавить средний осторожно, чтобы избежать повреждения его.
  9. Культура ткани в течение 14 дней со средним изменением каждый день.
  10. Перед имплантацией ЭСТ аккуратно удалите ЭСТ с погрузочных столбов с помощью стерилизованных тонких типсов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные размеры ЭСТ после удаления из формы меньше, чем оригинальная плесень. Форма 2,1 см x 2,05 см генерирует выпущенную ЭСТ примерно 1,5 см х 1,5 см. Больше 3,9 см х 4,05 см плесень генерирует ЭСТ примерно 3 см х 3 см. Разгруженная ЭСТ показывает внутреннее спонтанное избиение в теплой среде культуры. Хотя первоначально он поддерживает структуру сетки, выгруженный ЭСТ сжимается и конденсируется с течением времени. Можно держать ткань мягко с тонкой типсов, а затем использовать 7-0 шелковый шов, чтобы прикрепить ЭСТ к эпикардии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1A,B показаны схемы протокола CM-EC и MC. После индуцирования CMs и ECs из протокола CM-EC и MCs из протокола MC, клетки смешиваются, регулируя окончательные концентрации MC, чтобы представлять от 10 до 20% от общего количества ячеек. Форма ткани шириной 2 см изготовлена по чертежу из листа PDMS толщиной 0,5 мм(рисунок 2A,B). Шесть миллионов клеток CM-EC-MC сочетаются с коллагеном I и матрицей и выливаются на форму тк...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После завершения нашего исследования линейного формата, hiPSC производных ЭСТ5, мы адаптировали протокол для смешивания hiPSC полученных CMs, ECs, и MCs для облегчения в пробирке расширение сосудистых клеток в РАМКАХ ИТС и последующего в виво сосудистой связи между ECTs и получателя миокарда.

Для облегчения генерации больших, имплантируемых геометрий сетки ЭСТ мы использовали тонкие листы PDMS для разработки 3D-форм с погрузочными столбами, выстроенными в шахматном поло...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет финансовых или научных конфликтов для раскрытия.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была финансово поддержана Kosair Благотворительные педиатрические исследования сердца программы в Университете Луисвилла и органоидный проект в RIKEN Центр биосистемных исследований динамики. HiPSCs, используемые в наших опубликованных протоколах, были предоставлены Центром исследований и применения клеток iPS, Киотский университет, Киото, Япония.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<прочные>материалы
Тарелки для клеточных культур 100x20 мм стильFalcon/ Thomas scientific9380C51
Многолуночные планшеты для клеточных культур 6well 50/CSFalcon / Thomas scientific6902A01
Sylgard 184 Набор силиконовых эластомеровDow Corning761036
<сильно>Реагенты
AccumaxInnovative Cell TechnologiesAM-105
BMP4, рекомбинантные (10&микро; g)R& DRSD-314-BP-010
Коллаген, раствор типа I из крысиного хвостаSigmaC3867
Уменьшенный фактор роста MatrigelCorning356231
человека VEGF (165) IS, премиум классMiltenyi130-109-385
Pluronic F-127, 0,2 &; m фильтрованный (10% раствор в воде)Молекулярные зондыP-6866
Рекомбинантный человеческий bFGFWAKO060-04543
Рекомбинантный человек/мышь/крыса ActivinA (50&микро; g)R& D338-AC-050
rh Wnt-3a (10&микро; g)R& D5036-WN
Versene растворGibco15040066
Питательная среда и добавки
10xMEM Invitrogen11430
2 Mercaptro EthanolSIGMAM6250
B27 добавка минус инсулинGibco
DMEM,Gibco11965084
сыворотка для плода крупного рогатого скота (500 мл)Любая
сыворотка для крупного рогатого скота (500 мл)Любая
L-глутаминGibco25030081
NaHCO3Any
PBS 1xGibco10010-031
Пенициллин-стрептомицин (5000 ЕД/мл)Gibco15070-063
RPMI1640 среднийGibco21870092
&альфа; MEMInvitrogen11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, клон: TRA-1-60, BD BiosciencesBD / Fisher560380
антитропонин T, сердечная изоформа Ab-1, клон: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision FisherMS-295-P0
BD FACS Clean РешениеBD340345
BD FACSБоболочная жидкость с низким содержаниемоболочки BD342003
BD FACSРинс РастворBD340346
EDTAЛюбая
пробирка Falcon с колпачком для клеточного фильтра (Кейс из 500 штук)Corning352235
сыворотка для плода крупного рогатого скота (500 мл)Любой
LIVE/DEAD Исправляемый набор для окрашивания мертвых клеток Aqua, длямолекулярных зондовL34957
PDGFRb; анти-CD140b, R-PE, клон: 28D4, BD BiosciencesBD / Fisher558821
сапонинSigma-Aldrich47306-50G-F
VEcad-FITC; анти-CD144, FITC, клон: 55-7H1, BD BiosciencesBD / Fisher560411
Zenon Alexa Fluor 488 мышь IgG1 Набор для маркировкимолекулярных зондовZ25002
A1895601 возбуждения 405 нм

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
  2. Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure. Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).
  3. Menasché, P., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1. European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).
  4. Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Scientific Reports. 4, 6716(2014).
  5. Masumoto, H., et al. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Scientific Reports. 6, 29933(2016).
  6. Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).
  7. Fujimoto, K. L., et al. Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function. Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).
  8. Lancaster, J. J., et al. Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue. Vessel Plus. 2019, (2019).
  9. Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues. Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).
  10. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
  11. Christoforou, N., et al. Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues. PloS one. 8, 65963(2013).
  12. Nakane, T., et al. Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue. Scientific Reports. 7, 45641(2017).
  13. Kowalski, W. J., et al. Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue. Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

407

Похожие статьи