Методическая статья

Технологическая платформа с открытым исходным кодом для производства 3D-моделей культур на основе гидрогеля автоматизированным и стандартизированным способом

DOI:

10.3791/61261

⸱

31 марта 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre in Regenerative Medicine, Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, 2School of Mechanical, Medical and Process Engineering, Science and Engineering Faculty, Queensland University of Technology, 3School of Biomedical Sciences, Faculty of Health, Queensland University of Technology, 4Australian Prostate Cancer Research Centre, Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, 5Translational Research Institute, Queensland University of Technology, 6ARC ITTC in Additive Biomanufacturing, Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол служит всеобъемлющим учебным пособием для стандартизированного и воспроизводимого смешивания вязких материалов с новой технологией автоматизации с открытым исходным кодом. Приведены подробные инструкции по эксплуатации недавно разработанной рабочей станции с открытым исходным кодом, использованию конструктора протоколов с открытым исходным кодом, а также валидации и верификации для выявления воспроизводимых смесей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Текущие этапы смешивания вязких материалов зависят от повторяющихся и трудоемких задач, которые выполняются в основном вручную в режиме низкой пропускной способности. Эти проблемы представляют собой недостатки в рабочих процессах, которые в конечном итоге могут привести к невоспроизводимости результатов исследований. Рабочие процессы, основанные на вручную, еще больше ограничивают развитие и широкое распространение вязких материалов, таких как гидрогели, используемые для биомедицинских применений. Эти проблемы могут быть преодолены путем использования автоматизированных рабочих процессов со стандартизированными процессами смешивания для повышения воспроизводимости. В этом исследовании мы представляем пошаговые инструкции по использованию конструктора протоколов с открытым исходным кодом, работе с рабочей станцией с открытым исходным кодом и идентификации воспроизводимых смесей. В частности, конструктор протоколов с открытым исходным кодом направляет пользователя через экспериментальный выбор параметров и генерирует готовый к использованию код протокола для работы с рабочей станцией. Эта рабочая станция оптимизирована для дозирования вязких материалов, что обеспечивает автоматизированную и высоконадежную обработку за счет интеграции температурных доков для термочувствительных материалов, пипеток с положительным смещением для вязких материалов и дополнительной сенсорной док-станции для удаления лишнего материала из наконечника пипетки. Валидация и верификация смесей выполняются быстрым и недорогим измерением поглощения Orange G. В этом протоколе представлены результаты получения 80% (v/v) глицериновых смесей, серии разбавления для желатина метакрилоила (GelMA) и гидрогелей с двойной сетью 5% (мас./об.) GelMA и 2% (мас./об.) альгината. Включено руководство по устранению неполадок для поддержки пользователей с принятием протокола. Описанный рабочий процесс может быть широко применен к ряду вязких материалов для автоматического создания определяемых пользователем концентраций.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Воспроизводимость и воспроизводимость имеют первостепенное значение в научной работе1,2,3,4. Тем не менее, последние данные выявили значительные проблемы в повторении высокоэффективных биомедицинских исследований в фундаментальной науке, а также трансляционных исследований4,5,6,7. Факторы, способствующие невоспроизводимым результатам, сложны и многообразны, такие как плохая или предвзятая структура исследования6,8, недостаточная статистическая мощность3,9, несоблюдение стандартов отчетности7,10,11, давление на публикацию6 или недоступные методы или программный код6,9 . Среди них тонкие изменения в протоколе и человеческие ошибки при выполнении экспериментов были идентифицированы как дополнительные элементы, объясняющие невоспроизводимость4. Например, задачи ручного пипетирования вводят внутри- и межиндивидуальную неточность12,13 и увеличивают вероятность человеческих ошибок14. В то время как коммерческие роботы для обработки жидкостей способны преодолеть эти недостатки и продемонстрировали повышенную надежность для жидкостей15,16,17, автоматизированная обработка материалов со значительными вязкими свойствами по-прежнему является сложной задачей.

Коммерческие роботы для обработки жидкостей обычно используют пипетки на воздушной подушке, также известные как воздушный поршень или пипетки для вытеснения воздуха. Реагент и поршень разделены воздушной подушкой, которая сжимается во время этапов дозирования и расширяется во время стадий аспирации. Используя пипетки на воздушной подушке, вязкие материалы «текут» только медленно в и из наконечника, и раннее извлечение пипетки из резервуара может привести к аспирации пузырьков воздуха. Во время дозирующих задач вязкий материал оставляет пленку на стенке внутреннего наконечника, которая «течет» медленно или вообще не течет при выталкивании воздухом. Чтобы преодолеть эти проблемы, были введены пипетки с положительным смещением, чтобы активно выдавливать вязкий материал из наконечника с использованием твердого поршня. Хотя эти пипетки с положительным смещением обеспечивают точную и надежную обработку вязких материалов, автоматизированные решения с пипетками с положительным смещением по-прежнему слишком дороги для академических лабораторных условий, и, следовательно, большинство рабочих процессов с вязкими материалами полагаются исключительно на ручные задачи дозирования18.

В общем, вязкость определяется как сопротивление жидкости текучести, а вязкие материалы далее определяются как материалы с большей вязкостью воды (0,89 мПа·с при 25 °C). В области биомедицинских применений экспериментальные установки часто содержат несколько материалов с большей вязкостью, чем вода, такие как диметилсульфоксид (DMSO; 1,99 мПа·с при 25 °C), глицерин (208,1 мПа·с при 25 °C для 90% глицерина [v/v]), тритон X-100 (240 мПа·с при 25 °C) и набухшие в воде полимеры, называемые гидрогелями19, 20. Гидрогели представляют собой гидрофильные полимерные сети, расположенные в физическом и/или химическом режиме, используемом для различных применений, включая инкапсуляцию клеток, доставку лекарств и мягкие приводы19,20,21,22. Вязкость гидрогелей зависит от концентрации полимера и молекулярной массы19. Обычно используемые гидрогели для биомедицинских применений демонстрируют значения вязкости от 1 до 1000 мПа·с, в то время как конкретные гидрогелевые системы были зарегистрированы со значениями до 6 x 107 мПа·с19,23,24. Однако измерения вязкости гидрогелей не стандартизированы с точки зрения протокола измерений и пробоподготовки, и, следовательно, значения вязкости между различными исследованиями трудно сравнивать.

Поскольку коммерчески доступные автоматизированные решения, специально разработанные для гидрогелей, либо отсутствуют, либо слишком дороги, текущие рабочие процессы для гидрогеля зависят от ручного обращения18. Чтобы понять ограничения текущего ручного рабочего процесса для пипетирования гидрогелей, важно понять основные задачи обработки18. Например, после синтезации нового гидрогелевого материала генерируется желаемая концентрация или серия разбавления с изменяющимися концентрациями для определения надежных протоколов синтеза и характеристик сшивания с последующим анализом механических свойств25,26,27,28 . В общем, запасной раствор готовят или покупают, а затем смешивают с разбавителем и/или другими реагентами для получения смеси. Задачи смешивания в основном не выполняются непосредственно в пластине скважины (или любом выходном формате), а скорее выполняются в отдельной реакционной трубке, которую обычно называют мастер-миксом. Во время этих подготовительных задач требуются различные этапы аспирации и дозирования для переноса вязкого материала (материалов), смешивания реагентов и переноса смеси в выходной формат (например, пластину из 96 скважин). Эти задачи требуют большого количества человеческого труда18, долгих экспериментальных часов и увеличивают вероятность человеческих ошибок, которые потенциально могут проявиться как неточные результаты. Кроме того, ручная обработка предотвращает эффективную подготовку высоких номеров образцов для скрининга различных комбинаций параметров для детальной характеристики. Ручная обработка также препятствует использованию гидрогелей для высокопроизводительного скрининга, такого как идентификация перспективных соединений во время разработки лекарств. Нынешние этапы подготовки на основе вручную невозможны для проверки библиотек лекарств, состоящих из тысяч лекарств. По этим причинам автоматизированные решения необходимы для обеспечения эффективного процесса разработки и обеспечения успешной трансляции гидрогелей для скрининга лекарств.

Чтобы перейти от ручных рабочих процессов к автоматизированным процессам, мы оптимизировали коммерческий робот для пипетки с открытым исходным кодом для обработки вязких материалов путем интеграции температурных доков для термочувствительных материалов, использования готовых пипеток с положительным смещением с использованием капиллярных наконечников поршня и дополнительной сенсорной док-станции для очистки наконечников пипеток. Этот робот-пипетка был дополнительно интегрирован в качестве модуля пипетки в недавно разработанную рабочую станцию с открытым исходным кодом, которая состоит из готовых к установке и настраиваемых модулей18,29. Подробные инструкции по сборке разработанной рабочей станции, включая аппаратные и программные файлы, находятся в свободном доступе из GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) и репозитория Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). В дополнение к разработке аппаратного обеспечения было запрограммировано и выпущено приложение для проектирования протоколов с открытым исходным кодом, чтобы направлять пользователя через процесс выбора параметров и генерировать готовый к использованию код протокола (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp). Этот код работает на коммерческом роботе-пипетке с открытым исходным кодом, а также на разработанной рабочей станции с открытым исходным кодом.

Здесь представлено подробное руководство по эксплуатации рабочей станции с открытым исходным кодом для автоматизации задач смешивания вязких материалов (рисунок 1). Этапы протокола, специфичные для учебника, могут быть выполнены с помощью разработанной рабочей станции с открытым исходным кодом, а также коммерческого робота-пипетки с открытым исходным кодом. При поддержке разработанного собственными силами приложения для проектирования протокола с открытым исходным кодом продемонстрировано автоматизированное смешивание и получение необходимых концентраций для глицерина, желатина метакрилоила (GelMA) и альгината. Глицерин был выбран в этом учебнике, поскольку он хорошо охарактеризован30,31, он недорог и легко доступен, и, следовательно, он обычно используется в качестве вязкого эталонного материала для автоматизированных задач дозирования. В качестве примеров для гидрогелей, используемых в биомедицинских применениях, растворы-предшественники GelMA и альгинатного гидрогеля были применены для автоматизированных экспериментов по смешиванию. GelMA представляет собой один из наиболее часто используемых гидрогелей для исследований клеточной инкапсуляции32,33, и альгинат был выбран в этом исследовании, чтобы продемонстрировать способность производить гидрогели с двойной сетью34,35. Используя Orange G в качестве красителя, была реализована быстрая и недорогая процедура для проверки и проверки результатов смешивания с помощью спектрофотометра16.

Коммерческий робот для пипетирования с открытым исходным кодом был интегрирован в качестве модуля пипетки в разработанную рабочую станцию с открытым исходным кодом (рисунок 2a), и поэтому название «модуль пипетки» далее используется для описания робота-пипетки. Подробное описание установленного оборудования выходит за рамки этого протокола и доступно через предоставленные репозитории, которые также включают пошаговые инструкции для общей сборки платформы с открытым исходным кодом. Модуль дозирования может быть оснащен двумя пипетками (одно- или 8-канальная пипетка), которые установлены на оси A (справа) и оси B (слева) (рисунок 2b). Модуль дозирования предлагает 10-палубную емкость в соответствии со стандартами Американского национального института стандартов / Общества по автоматизации и скринингу лабораторий (ANSI / SLAS), и на палубе определены следующие позиции местоположения: A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2 (рисунок 2c). Для инициирования фотоиндуцированной полимеризации растворов гидрогеля требуется отдельный сшивающий модуль, который был добавлен к рабочей станции. Сшивающий модуль оснащен светодиодами с длиной волны 400 нм и, следовательно, вещества, возбуждающие на длине волны видимого света, могут быть использованы с современными системами, такими как фенил-2,4,6 триметилбензоилфосфинат (LAP)36,37. Интенсивность (в мВт/см2) светодиодов может быть рассмотрена пользователем в приложении проектирования протокола для изучения поведения сшивки38. Рабочая станция включает в себя также модуль хранения данных, позволяющий проводить исследования с увеличенной пропускной способностью; однако этот модуль не используется в рамках данного исследования и, следовательно, далее не описывается. Как правило, рекомендуется эксплуатировать модуль дозирования в шкафу биологической безопасности, чтобы избежать загрязнения образца. Основной силовой схемой для работы модуля пипетки является цепь 12 В, которая рассматривается как низковольтное приложение в большинстве стран. Все электрические компоненты расположены в специальном блоке управления, предотвращающем контакт пользователей с источником электрической опасности.

Следуя этим стандартизированным протоколам смешивания, исследователи могут получить надежные смеси для вязких, а также невязких материалов автоматическим способом. Подход с открытым исходным кодом позволяет пользователям оптимизировать последовательности смешивания и делиться недавно разработанными протоколами с сообществом. В конечном счете, этот подход облегчит скрининг нескольких комбинаций параметров для исследования взаимозависимостей между различными факторами и, тем самым, ускорит надежное применение и разработку вязких материалов для биомедицинских применений.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол начинается с введения в (1) программное обеспечение и (2) настройку оборудования для ознакомления пользователя с необходимыми установками и рабочей станцией. После раздела, посвященного (3) подготовке материала и (4) использованию приложения конструктора протоколов, (5) подробно освещается калибровка модуля дозирования и (6) выполнение автоматизированного протокола. Наконец, (7) описаны процедуры валидации и верификации, включая считывание поглощения и анализ данных. Общий рабочий процесс протокола с отдельными задачами показан на рисунке 1.

1. Настройка программного обеспечения

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел содержит подробную инструкцию по установке интерфейса прикладного программирования (API), а также необходимого приложения конструктора протоколов и калибровочного терминала. Следующие инструкции написаны для одноплатного компьютера Raspberry Pi (RPi); однако также Windows 8, 10 и macOS 10.13+ успешно используются с API и приложениями.

  1. Настройте компьютерную среду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ознакомьтесь с основами Python39, как настроить и использовать Raspberry Pi40,41 и как подключиться к интернету42. Следующие шаги учебника посвящены шагам, относящимся к протоколу, а дополнительная информация об использовании Raspberry Pi доступна в Интернете40.
    1. Откройте окно терминала из панели задач или меню приложения.
    2. Обновите список пакетов системы:
      sudo apt-get update
    3. Обновите все установленные пакеты:
      sudo apt-get dist-upgrade
    4. Перезапустите Raspberry Pi:
      перезагрузка sudo
    5. Проверьте установленную версию Python:
      python3 --version
      Убедитесь, что установлен хотя бы Python 3.5; если нет, установите последнюю версию43.
    6. Установите python pip, который публикует пакеты Python с индексом пакетов Python44:
      sudo apt-get install python3-pip
    7. Установка зависимостей:
      pip установить numpy
      pip install python-resize-image
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы используете Windows, вам нужно установить пакет windows-curses через: python -m pip установить windows-curses
  2. Установите интерфейс прикладного программирования (API).
    ПРИМЕЧАНИЕ: API предоставляет простой фреймворк Python, предназначенный для написания сценариев экспериментальных протоколов и управления рабочей станцией. Для успешного выполнения созданного кода протокола необходимы следующие два API.
    1. Установите API рабочей станции:
      pip установить ажурную станцию
    2. Установите Opentrons API для работы модуля пипетки:
      pip установить opentrons ==2.5.2
    3. Проверьте, успешно ли установлен API:
      python3
      >>> импорт ажурных станций
      >>> импорта опентронов
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер API и приложения для разработки протокола составляет 2,2 МБ и 1,2 МБ соответственно. Во время установки не возникало никаких проблем при использовании с ограниченным дисковым пространством (200 МБ). Однако требования к дисковому пространству зависят от операционной системы.
  3. Выберите каталог для загрузки файла (калибровочный терминал, приложение для проектирования протоколов и т.д.).
    ПРИМЕЧАНИЕ: После этого файлы могут быть скопированы и вставлены в другое место.
  4. Клонирование файлов из репозитория GitHub:
    https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation клонирования git
    ПРИМЕЧАНИЕ: Команда 'git clone' клонирует и впоследствии сохраняет все файлы в каталог, который в данный момент открыт в терминале. Поскольку репозиторий также включает в себя аппаратные файлы для сборки, для выполнения представленных протоколов требуется не весь репозиторий. Все необходимые файлы для репликации экспериментов доступны в виде дополнительного файла и в репозитории GitHub в разделе "/examples/publication-JoVE".
  5. Откройте загруженную папку. Если был загружен весь репозиторий, перейдите в папку 'publication-JoVE' через
    cd ажурная станция/примеры/публикация-JoVE
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта папка содержит файлы, необходимые для работы рабочей станции и использования приложения конструктора протоколов и калибровочного терминала.

2. Настройка оборудования

  1. Поместите рабочее место в шкаф биологической безопасности, чтобы избежать загрязнения образца.
  2. Установите пипетки на рабочую станцию.
    1. Выберите размер пипетки в зависимости от экспериментальной установки. В общем, возьмите размер пипетки, объем которой должен быть аспирирован, находится на верхнем конце диапазона. Если для конкретной установки требуется смешивание с объемами более 1 мл (например, аспирация/дозирование 2 мл), выберите M1000E с максимальным объемом аспирации/дозирования 1000 мкл для минимизации этапов дозирования и экономии времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная инструкция по использованию пипеток для воздушного вытеснения доступна онлайн45. Разработанный пипеточный модуль способен интегрировать следующие готовые пипетки с положительным смещением: M10E (1–10 мкл), M25E (3–25 мкл), M50E (20–50 мкл), M100E (10–100 мкл), M250E (50–250 мкл), M1000E (100–1000 мкл).
    2. Используйте ключ M4 Allen, чтобы ослабить и затянуть винты.
    3. Прикрепите две пластины фиксации пипетки (белые акриловые пластины) к алюминиевой рейке и свободно затяните винты M5.
    4. Вставьте пипетку в две пластины фиксации пипетки и убедитесь, что эргономичный хвост пипетки опирается на противоположную сторону акриловой монтажной пластины.
    5. Крепко затяните четыре винта двух пластин фиксации пипетки.
    6. Сдвиньте две квадратные крепежные гайки, которые прикреплены к акриловой монтажной пластине, в экструзионную щель оси Z и затяните винты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плотно застегните пипетку, чтобы избежать движения во время работы.

3. Подготовка материала

ПРИМЕЧАНИЕ: Вязкие материалы (глицерин, гельМА, альгинат) используются для экспериментов, представленных в данном исследовании, и, следовательно, подготовленные объемы и задачи обработки (например, добавление 5 мл исходного раствора в реакционные трубки объемом 5 мл) предназначены специально для этой экспериментальной установки.

  1. Желатин метакрилоил (GelMA)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Функционализация, диализ и лиофилизация GelMA не входят в сферу охвата данной статьи, и пошаговый протокол доступен в Loessner et al.33. Протокол начинает использовать лиофилизированный GelMA, который может быть приготовлен собственными силами или приобретен в коммерческих целях.
    1. Рассчитайте требуемую массу GelMA (mGelMA) на основе желаемой конечной концентрации запаса (cGelMA) и объема (VGelMA), используя уравнение:
      mGelMA = cGelMA x VGelMA
      ПРИМЕЧАНИЕ: VGelMA зависит от экспериментальной установки и рекомендуется готовить 20−30% избыточного материала. Представленные протоколы начинаются с 5 мл 20% (мас./об.) GelMA в качестве стандартного раствора.
    2. Взвесьте необходимое количество лиофилизированного GelMA, добавьте его в реакционную трубку объемом 50 мл и добавьте необходимое количество фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
    3. Смешайте GelMA либо путем замачивания в растворителе при 4 °C на ночь, либо путем нагревания до 60 °C в течение 6 ч на водяной бане.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильные растворы GelMA можно хранить защищенными от света при температуре 4 °C в течение не менее шести месяцев.
    4. Заполните 5 мл GelMA в реакционные трубки по 5 мл.
  2. Фотоинициатор: Литий фенил-2,4,6-триметилбензоилфосфинат (LAP)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте дополнительного воздействия света в помещении, так как LAP чувствителен к свету.
    1. Рассчитайте требуемую массу LAP (mLAP) на основе желаемой конечной концентрации запаса (cLAP) и требуемого объема (VLAP), используя уравнение:
      mLAP = cLAP x VLAP
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется готовить 3% (мас./об.) раствор для запасов.
    2. Взвесьте необходимое количество LAP, добавьте его в реакционную трубку объемом 15 мл и добавьте PBS.
    3. Оберните трубку в алюминиевую фольгу, чтобы предотвратить фотоиндуцированное разложение.
    4. Растворяют LAP, помещая реакционную трубку на водяную баню при 37 °C в течение 2 ч или до полного растворения.
    5. Заполните 1 мл раствора LAP в пробирках по 5 мл.
  3. Альгинат
    1. Рассчитайте необходимое количество альгината (малгината) на основе желаемой конечной концентрации запаса (калгинат) и объема (вальгинат), используя уравнение:
      malginate = calginate x Valginate
      ПРИМЕЧАНИЕ: Валгинат зависит от экспериментальной установки и рекомендуется получать 20−30% избыточного материала. Представленные протоколы начинают с 5 мл 4% (мас./об.) альгината в качестве исходного раствора.
    2. Взвесьте необходимую массу альгината, добавьте его в реакционные трубки объемом 50 мл и добавьте PBS.
    3. Поместите альгинатную смесь на водяную баню при 37 °C в течение 4 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование вихревого смесителя ускорит процесс растворения, а также создаст пузырьки воздуха. Растворенный альгинат можно хранить при 4 °C в течение не менее шести месяцев.
    4. Заполните 5 мл альгината в реакционные трубки по 5 мл.
  4. Заполните 5 мл глицерина в реакционных пробирках по 5 мл.
  5. Раствор оранжевого G
    1. Приготовьте стоковый раствор Orange G 10 мг/мл в реакционной трубке объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем зависит от количества экспериментов. В зависимости от типа разбавителя, приготовьте бульонный раствор либо в сверхчистой воде, PBS, либо в подходящем реагенте разбавителя. В представленных экспериментах ультрачистую воду использовали для разбавления глицерина и PBS для разбавления GelMA и альгината. PBS использовался в качестве разбавителя для GelMA и альгината и может быть либо приготовлен с использованием таблеток, либо приобретен в готовом виде.
    2. Перемешивать в течение 10 с путем вихря.
    3. Оберните трубку в алюминиевую фольгу, чтобы предотвратить фотоиндуцированное разложение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стоковый раствор можно использовать через 24 ч для обеспечения надлежащего растворения Orange G.
    4. Разбавить исходный раствор до 1 мг/мл рабочего раствора в реакционной трубке 50 мл.
    5. Перенесите рабочий раствор на соответствующие колбы/трубки для экспериментальной установки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для представленных экспериментов рабочий раствор заполняли в пробирки по 5 мл. Запас Orange G и рабочий раствор можно хранить при 4 °C и использовать в течение трех месяцев после приготовления.
    6. Заполните 5 мл рабочего раствора Orange G 1 мг/мл в реакционных пробирках по 5 мл.

4. Создание кода протокола с помощью приложения конструктора протоколов

ПРИМЕЧАНИЕ: Указанные параметры на этапах 4.2−4.7 одинаковы для всех проведенных экспериментов, за исключением концентрации запаса материала и конечной выходной концентрации. Эти параметры обобщены в таблице 1 , а в нижеследующих параметрах используются для получения гидрогелей двойной сети с 5% (мас./об.) GelMA, 2% (мас./об.) альгинатом, 0,15% (мас./об.) LAP и PBS в качестве разбавителя.

  1. Откройте приложение конструктора протоколов, запустив команду 'ProtocolDesignApp.html'.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приложение "ProtocolDesignApp.html" направляет пользователя через процесс выбора параметров и автоматически генерирует готовый к использованию протокол для работы рабочей станции. Пользовательский интерфейс работает на всех часто используемых интернет-браузерах (например, Chrome, Firefox, Safari, edge, Internet Explorer).
  2. Введите имя протокола (например, гидрогели с двойной сетью) на странице настройки.
  3. Нажмите «Продолжить», чтобы подтвердить имя протокола и перейти к следующему шагу.
  4. Определите входной лоток, выбрав '3x4 Нагревательный блок' из раскрывающегося меню и следующие входные параметры:
    1. Выберите «Гель 1» из выпадающего меню, введите название «GelMA», введите концентрацию запасов «20%», установите «Количество образцов» на «3», чтобы заполнить один столбец. Нажмите «+добавить», чтобы сохранить записи.
    2. Выберите «Гель 2» из выпадающего меню, введите название: «Альгинат», введите концентрацию запаса «4%», установите «Количество образцов» на «3», чтобы заполнить один столбец. Нажмите «+добавить», чтобы сохранить записи.
    3. Выберите «Фотоинициатор» в раскрывающемся меню, введите имя: «LAP», введите концентрацию запасов «3%», установите «Количество образцов» на «3», чтобы заполнить один столбец. Нажмите «+добавить», чтобы сохранить записи.
    4. Выберите «Разбавитель 1» в раскрывающемся меню, введите имя: «PBS», установите для параметра «Количество образцов» значение «3», чтобы заполнить один столбец. Нажмите «+добавить», чтобы сохранить записи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация входного лотка автоматически обновляется после нажатия кнопки «+добавить». Если будет добавлено больше входных данных, чем емкость лотка, пользователю будет показано предупреждение «Слишком много образцов для этого лотка».
  5. Определите параметры сшивки, проверив «Сшивание фотографий» и введя время в секундах, «30» и интенсивность Вт/м2 с «2».
  6. Завершите настройку ввода, нажав кнопку «ПРОДОЛЖИТЬ».
  7. Определите настройку выходного лотка, выбрав «Пластина скважины 96» в раскрывающемся меню для типа плиты скважины.
  8. Нажмите на 'Group1', чтобы определить выходные данные, создав группу образцов.
    1. Укажите выходной состав, введя желаемые концентрации и объем образца в поля для каждого входа: GelMA = '5', Alginate = '2', LAP = '0.15', Total Volume = '60'.
    2. Установите флажок, чтобы применить расширенный протокол смешивания.
  9. Укажите количество образцов, введя количество образцов в поле 'Количество образцов': '96'.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация панели задач автоматически обновляется после нажатия кнопки "+добавить группу". Если будет добавлено больше образцов, чем емкость лотка, пользователю будет показано предупреждение «Слишком много образцов для этого лотка».
  10. Завершите настройку вывода, нажав кнопку «ПРОДОЛЖИТЬ».
    1. Выберите положение лотка на палубе и подготовьте платформу соответствующим образом:
    2. Установите галочку в поле 'SLOT A1' и выберите 'Empty_Cell' из выпадающего меню.
    3. Поставьте галочку в поле 'SLOT A2' и выберите 'Trash_Cell' из выпадающего меню.
    4. Поставьте галочку в поле 'SLOT B1' и выберите 'Tips_Cell_100 мкл' из выпадающего меню.
    5. Установите флажок в поле 'SLOT B2' и выберите 'Tips_Cell_1000 мкл' из выпадающего меню.
    6. Установите флажок в поле 'SLOT C1' и выберите 'Input_Cell' из выпадающего меню.
    7. Установите флажок в поле 'SLOT C2' и выберите 'Empty_Cell' из выпадающего меню.
    8. Установите флажок в поле 'SLOT D1' и выберите 'Mixing_Cell' из выпадающего меню.
    9. Установите флажок в поле 'SLOT D2' и выберите 'Output_Cell' из выпадающего меню.
    10. Определите тип и характеристики первой пипетки (M100E), установив флажок 'Pipette Left', выбрав '10-100μL положительное смещение' из выпадающего меню и установив скорость аспирации = '600', скорость дозирования = '800'.
    11. Определите тип и характеристики второй пипетки (M1000E), установив флажок 'Pipette Right', выбрав 'Положительное смещение 100-1000мкл' из выпадающего меню и установив скорость аспирации = '800', скорость дозирования = '1200'.
  11. Нажмите «СОЗДАТЬ ПРОТОКОЛ», чтобы подтвердить настройку и сгенерировать сценарий протокола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разработанное приложение конструктора протоколов автоматически генерирует новую папку при создании нового протокола. Все файлы, необходимые для этого эксперимента и для работы рабочей станции, сохраняются в этой папке, которая названа в честь имени протокола. Папка может быть скопирована в разные каталоги, не вызывая проблем.
  12. Не закрывайте интерфейс, так как он будет использоваться для выполнения протокола (см. шаг 6.6.).

5. Калибровка модуля дозирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Контейнеры (например, плиты колодцев, подставка для наконечников, мусор) и пипетки (например, M1000E) должны быть откалиброваны изначально. Если контейнер и/или положение пипетки модифицированы/изменены, новое положение должно быть откалибровано.

  1. Перейдите в папку протокола и откройте калибровочный терминал, выполнив файл 'calibrate.py' в терминале windox (см. шаг 1.1.1):
    phython.calibrate.py
    ПРИМЕЧАНИЕ: Интерфейс 'calibrate.py' направляет пользователя через калибровку установки колоды и пипеток. Убедитесь, что файл находится в той же папке, что и файл протокола и файлы модуля. Он генерируется автоматически на шаге 4.10.
  2. Выберите приращения перемещения для плунжеркса, y, z с помощью цифровой клавиатуры (1−8): '1' для 0,1 мм, '2' для 0,5 мм, '3' для 1 мм, '4' для 5 мм, '5' для 10, '6' для 20 мм, '7' для 40 мм и '8' для 80 мм.
  3. Откалибруйте пипетку.
    1. Нажмите сочетание клавиш P , чтобы выбрать размер пипетки.
    2. Нажмите сочетание клавиш V , чтобы войти в режим калибровки плунжера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется начинать с небольших приращений (2, 5 и 10 мм), чтобы ознакомиться с размером приращения и действием движения головки пипетки.
    3. Откалибруйте следующие положения плунжера для пипетки с положительным смещением: T–Top = положение покоя; B–Дно = плунжер толкается до тех пор, пока не будет достигнуто сопротивление; P–Pick-up = плунжер толкается в положение, в котором может быть прикреплен наконечник поршня; E–Eject = плунжер толкается до тех пор, пока не будет выброшен прикрепленный наконечник. Изменяйте положение плунжера с помощью стрелок вверх и вниз на клавиатуре и сохраняйте конечное положение с помощью S на клавиатуре.
    4. Выйдите из режима калибровки плунжера пипетки, нажав клавишу V.
  4. Откалибруйте положение контейнера относительно наконечника пипетки.
    1. Нажмите сочетание клавиш P , чтобы выбрать тип пипетки. Убедитесь, что наконечник подключен к выбранному пипетированному.
    2. Нажмите сочетание клавиш C , чтобы выбрать тип контейнера.
    3. Выберите соответствующий шаг движения и переместите наконечник пипетки в следующие положения. Для плит скважин откалибруйте в соответствии с положением скважины «A1» в нижней части; Для стойки наконечников откалибруйте в положение 'A1'; Для корзины выберите позицию (определенную как точка), где наконечник может быть выброшен в корзину.
    4. Нажмите сочетание клавиш S , чтобы сохранить положение.
    5. Повторите шаги 5.3.1-5.3.3 для всех контейнеров, перечисленных в разделе "С" для выбранного типа пипетки.
    6. Повторите пункты 5.3.1−5.3.5 для второго типа пипетки.
    7. Закройте сценарий калибровки.

6. Выполнение протокола с рабочей станцией

ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы протокола доступны через репозиторий, а также доступны в виде дополнительного файла.

  1. Разместите контейнер для мусора, стойки для наконечников, входной лоток, смесительный лоток и выход на палубу (определено в шаге 4.3).
  2. Калибруйте пипетки и приборы, как определено в разделе 5.
  3. При необходимости включите температурный док-станцию и выберите температуру для входного и смесительного лотка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты в этом учебнике проводились без контроля температуры и при 40 °C для глицерина и 37 °C для GelMA и пипетирования альгината.
  4. Расположите трубы с входными реагентами в алюминиевых блоках на температурных доках в соответствии с выбранной установкой.
  5. Дождитесь, пока входные реагенты достигнут нужной температуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения правильного распределения температуры рекомендуется время инкубации 30 мин для GelMA и альгината.
  6. Запустите файл протокола, нажав на кнопку 'RUN PYTHON SCRIPT'
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранный протокол теперь выполняется рабочей станцией. В сопроводительном видео освещается автоматизированное смешивание GelMA и распределение 60 мкл в пластину из 96 скважин.
  7. Запуск завершен, когда отображается 'Готово'.

7. Процесс валидации и верификации

  1. Извлеките плиту скважины с рабочего места и транспортируйте пластину скважины с образцами на спектрофотометр.
  2. Считывание поглощения с помощью спектрофотометра при 450 нм. Прочитайте каждую пластину 2x, чтобы сравнить результаты и обеспечить согласованность результатов.
  3. Экспортируйте и сохраняйте показания поглощения.
  4. Анализ данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальные данные могут быть обработаны по отдельности или скопированы и вставлены в предоставленный шаблон для оценки среднего значения, стандартного отклонения и коэффициента дисперсии (CV) с использованием программного обеспечения для работы с электронными таблицами.
    1. Откройте дополнительный файл 'supplementary_template-analysis.xlsx", который также доступен в репозитории GitHub в разделе 'openworkstation/examples/publication-JoVE.
    2. Скопируйте показания поглощения в лист «необработанные данные», убедитесь, что все ссылки на ячейки правильно определены во всех таблицах, и нажмите на лист «анализ» для получения информации о средних значениях, стандартном отклонении и коэффициенте дисперсии (CV).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от распределения проб на пластине скважины с шаблоном доступны следующие предустановленные типы оценки: тип «Однородный» используется, когда все образцы имеют одинаковый состав, тип «По строкам» используется, когда образцы в разных рядах имеют разный состав, тип «По столбцам» используется, когда образцы в разных столбцах имеют разный состав, и тип 'Customized' используется, когда выборочные позиции зависят от пользователя.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом учебнике представлены результаты экспериментов с глицерином (рисунок 3) и GelMA с LAP и альгинатом (рисунок 4).

Генерацию 80% (v/v) раствора глицерина исследовали либо без контроля температуры (комнатная температура, 22 °C) и без касания наконечником (определяется как установка 1), с контролем температуры (40 °C) и без сенсорного ввода (установка 2), либо с контролем температуры (40 °C) и с помощью сенсорного ввода (установка 3) (рисунок 3a-i). Эти две температурные установки были выбраны для оценки разницы в обработке, поскольку вязкость глицерина уменьшается почти в 3 раза при нагревании с 22 °C (139,5 мПа·с) до 40 °C (46,6 мПа·с)30. 85% (v/v) раствор глицерина разбавляли до конечной концентрации 80% и равномерно распределяли в 96-луночную пластину (n = 96 на установку). Экспериментальное время, которое включает в себя дозирование каждого материала в смесинную трубку, соответствующие задачи смешивания и распределение пробы в 96-луночную пластину, составило 30 мин 42 с. Чтобы выявить различия между разбавляющими смесями, сверхчистую воду в качестве разбавителя для глицерина готовили с 1 мг/ мл Orange G. Показания абсорбции показывают, что интеграция контроля температуры и касания наконечника значительно влияет на смеси (p < 0,0001). В дополнение к выполненному двустороннему анализу дисперсии (ANOVA), значения CV были рассчитаны для оценки относительного стандартного отклонения. Коэффициент вариации описывает стандартизированный показатель для определения степени отклонения по отношению к среднему значению и выражается в процентах. Если средства отбора проб представляют не особый интерес, а вариабельность в рамках измерений, коэффициент вариации дает дополнительную информацию для идентификации воспроизводимых смесей46. В рамках этого эксперимента с тремя различными установками значения поглощения показали снижение значений CV с 5,6%, 4,2% до 2,0% для установки 1, установки 2 и установки 3 соответственно, демонстрируя значительное влияние температурной док-станции и функции касания наконечника на получение надежных результатов (рисунок 3a-ii). Построение значений поглощения образца для установки 3 (номера образцов от No 1 до No 96 в пластине скважины 96) не дает увеличения или уменьшения значений на протяжении всего эксперимента и, следовательно, не указывает на влияние положения образца на значения поглощения (рисунок 3a-iii). Визуализация данных для каждой измеряемой пластины скважины с тепловыми картами дает дополнительную информацию для выявления неоднородностей для конкретной строки или столбца или изменяющихся значений поглощения во время задач дозирования. Визуализированные тепловые карты для трех установок отображают уменьшенные неоднородности по всей плите скважины от установки 1 до установки 3 (рисунок 3b). Наконец, воспроизводимость проведенного смешивания оценивалась в течение восьми независимых прогонов (рисунок 3c-i,ii), где каждый прогон занимал 6 мин 57 с. Одиночные прогоны смешивания показали низкие значения CV от 1,1% до 2,6%, что указывает на очень надежные задачи смешивания и дозирования для отдельных прогонов. Значения поглощения всех восьми прогонов дали значение CV 3,3% и продемонстрировали воспроизводимость установленного протокола смешивания.

Серию разбавления GelMA получали путем разбавления 20% (мас./об.) раствора С ПБС до 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 и 0% (мас./об.) и добавления ЛАП до постоянной концентрации 0,15% (мас./об.) (рис. 4a-i), что заняло в общей сложности 55 мин 12 с. Как указано в сценарии экспериментального протокола, гидрогель сшивался в течение 30 с с интенсивностью 2,0 мВт/см2 при 400 нм. Чтобы оценить различия между смесями, PBS в качестве разбавителя для GelMA и альгината был приготовлен с 1 мг / мл Orange G. Следовательно, разница в поглощении между образцами в одной смеси, а также между последовательными разведениями идентифицируется с помощью спектрофотометра. Измеренные значения поглощения каждой стадии концентрации значительно различаются (p < 0,0001) и имеют очень низкие значения CV от 1,2% до 3,4% на всех стадиях концентрации (n = 12 на стадию концентрации). Линейная регрессия продемонстрировала высокое соответствие со значением R² 0,9869 (рисунок 4a-ii), а тепловая карта подтвердила однородное распределение для каждой концентрации и разницу между концентрациями (рисунок 4a-iii). Автоматизированное смешивание четырех реагентов проводилось для генерации 5% (мас./об.) GelMA, 2% (мас./об.) альгината, 0,15% (мас./об.) LAP и PBS в качестве разбавителя без (установка 2) и с (установка 3) сенсорным наконечником (n = 96 для каждой установки) с одинаковыми параметрами сшивания (30 с, 2,0 мВт/см2, 400 нм). Дозирование четырех материалов, смешивание и распределение в плиту из 96 скважин заняло 32 мин 22 с. Все эксперименты с GelMA и альгинатом проводились при 37 °C для предотвращения термического гелеобразования, которое предотвращает пипетирование GelMA. С помощью сенсорной опции наконечника значение CV было уменьшено с 5,2% до 3,4% и, особенно, выбросы в нижней области были предотвращены путем удаления лишнего материала из наконечника (рисунок 4b-i). Хотя средние значения 1,927 и 1,944 для установки 2 и установки 3 очень близки, коэффициент вариации подчеркивает уменьшающееся отклонение по отношению к среднему значению. Отдельные ряды плиты 96 скважин можно сравнить друг с другом с помощью визуализации тепловой карты для обнаружения различий строк и/или столбцов (рисунок 4b-ii).

figure-results-1
Рисунок 1: Рабочий процесс протокола с отдельными задачами. Описанный рабочий процесс разделен на семь задач, которые разделены на настройку, подготовку, выполнение и анализ. В начале необходимо настроить программное обеспечение (задача 1), а также аппаратное обеспечение (задача 2). После подготовки материалов (задача 3) и генерации протокольного скрипта (задача 4) модуль дозирования калибруют путем определения положения пипетки и контейнера (задача 5). Далее на рабочей станции выполняется протокольный сценарий (задача 6) и проводится валидация и верификация (задача 7) смесей для оценки смесей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Рабочая станция с открытым исходным кодом и настройка палубы модуля дозирования. а) Разработанная рабочая станция основана на подходе сборочной линии, при котором образцы транспортируются через различные модули, и состоит из следующих модулей: пипетного, сшивочного, складского, транспортного и вычислительного модуля. b) палуба модуля дозирования устанавливается в зависимости от экспериментальной компоновки (например, типа плиты скважины, объема трубы и т.д. Для представленных экспериментов использовалась показанная палубная установка, состоящая из пипеток с положительным смещением в диапазоне от 10−100 мкл (M100E) и 100−1000 мкл (M1000E), наконечников с капиллярными поршнями (CP) на 100 мкл (CP1000) и 1000 мкл (CP1000), контейнера для мусора, смесительного лотка и входного лотка для входных реагентов. c) Имеющиеся позиции палубы определяются с помощью отображаемых номеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Результаты автоматизированного пипетирования глицериновых смесей. a) гибкая конструкция рабочей станции позволяет оценить три различные установки i) для определения оптимальных параметров для воспроизводимых результатов. ii) Добавление наконечника и нагрев материала привели к снижению значения коэффициента дисперсии (CV) и высоковоспроизводимым смесям для установки 3. Каждый эксперимент проводился с 96 образцами. iii) построение графиков значений одной выборки не оказало никакого влияния на последовательность пипетирования. b) Экспериментальные результаты каждой установки были визуализированы с помощью тепловых карт для определения влияния на необработанные/колонные различия, ребра или основную смесь. (c) Воспроизводимость установки 3 была проанализирована в течение восьми независимых прогонов с использованием (i) медианы, стандартного отклонения, значения CV и (ii) тепловых карт. Данные на панелях a-ii (n = 96) и b-i (n = 12) представлены со средними и едиными точками данных. Статистическая значимость была определена как ****p < 0,0001 с использованием двустороннего дисперсионного анализа (ANOVA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Результаты смешивания задач с гидрогелями. а) Из раствора желатина метакрилоила (GelMA) 20% (мас./об.) в течение одного экспериментального запуска с использованием 96-луночной пластины (n = 12 на концентрацию) было получено последовательное разбавление 14, 12, 8, 6, 4, 2 и 0% (мас./об.). i) коэффициент дисперсии (CV) варьировался от 1,2% до 3,4% по всем подготовленным концентрациям, и ii) линейная регрессия показала высокое соответствие при значении R² 0,9869. iii) однородные разбавления были подтверждены визуально с помощью сгенерированной тепловой карты. b) Гидрогели двойной сети были получены с 5% (мас./об.) GelMA, 2% (мас./об.) альгината и 0,15% (мас./об.) LAP (i) с касанием наконечника и без него (n = 96 для каждой установки) и сшиты в течение 30 с интенсивностью 2,0 мВт/см2 при 400 нм. Интеграция сенсорного наконечника привела к снижению значений CV с 5,2% до 3,4%. (ii,iii) Тепловые карты подтверждают меньшее количество отклонений при использовании наконечника для удаления лишнего материала из наконечника. Данные в панелях a-i и b-i представлены средствами и едиными точками данных. Статистическая значимость определялась как *p < 0,05, ***p < 0,001 и ****p < 0,0001 с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: Краткое изложение различий в типах пипеток и проблем с вязкими биоматериалами. а) Реагент и поршень разделены воздушной подушкой, которая сжимается на этапах дозирования и расширяется на этапах аспирации. При аспирации и дозировании вязких материалов медленный «поток» создает такие проблемы, как пузырьки воздуха и нерегулярное поведение пипетки. b) Пипетки с принудительным смещением обеспечивают надежное аспирирование и дозирование вязкого материала с помощью поршня внутри наконечника. c) Пипетка высоковязких материалов (например, 4% (мас./об.) альгината) может привести к накоплению избыточного материала на наконечнике, что приводит к неточности на протяжении всех экспериментов. d) Использование простого сенсорного лотка наконечника позволяет удалить лишний материал на наконечнике и приводит к точному аспирации и дозированию объемов. Это достигается с помощью внутренней стороны крышки пластины скважины, помещенной на контейнер для стойки наконечников. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Материал No1 (концентрация запасов)Конечная концентрация материала No1Материал No2 (концентрация запасов)Конечная концентрация материала No2Материалы No3 (концентрация запасов)Конечная концентрация материала No3Разбавитель (рабочий раствор Orange G)Конечная концентрация апельсина G в смесиПоказано на рисунке
Глицерин (85% (мас./об.))80% (об/д)вода (1 мг/мл orange G)0,059 мг/млРисунок 3a−c
GelMA (20% (мас./об.))0% (с об.)LAP (3% (с об/об))0,15% (масс./об.)PBS (1 мг/мл orange G)1 мг/млРисунок 4a
GelMA (20% (мас./об.))2% (мас./об.)LAP (3% (с об/об))0,15% (масс./об.)PBS (1 мг/мл orange G)0,85 мг/млРисунок 4a
GelMA (20% (мас./об.))4% (мас./об.)LAP (3% (с об/об))0,15% (масс./об.)PBS (1 мг/мл orange G)0,75 мг/млРисунок 4a
GelMA (20% (мас./об.))6% (мас./об.)LAP (3% (с об/об))0,15% (масс./об.)PBS (1 мг/мл orange G)0,65 мг/млРисунок 4a
GelMA (20% (мас./об.))8% (об/д)LAP (3% (с об/об))0,15% (масс./об.)PBS (1 мг/мл orange G)0,55 мг/млРисунок 4a
GelMA (20% (мас./об.))10% (с об.)LAP (3% (с об/об))0,15% (масс./об.)PBS (1 мг/мл orange G)0,45 мг/млРисунок 4a
GelMA (20% (мас./об.))12% (с об.)LAP (3% (с об/об))0,15% (масс./об.)PBS (1 мг/мл orange G)0,35 мг/млРисунок 4a
GelMA (20% (мас./об.))14% (об/д)LAP (3% (с об/об))0,15% (масс./об.)PBS (1 мг/мл orange G)0,25 мг/млРисунок 4a
GelMA (20% (мас./об.))5% (с об.)Альгинат (4% (мас./об.))2% (мас./об.)LAP (3% (с об/об))0,15% (масс./об.)PBS (1 мг/мл orange G)0,2 мг/млРисунок 4b

Таблица 1: Обзор параметров для проведенных экспериментов.

Шаг протоколаПроблемаВозможная причинаРешение
1.1Не удается установить или обновить программное обеспечениеНа SD-карте не хватает места на дискеПроверьте дисковое пространство на SD-карте. При необходимости удалите ненужные предметы, опустошите корзину или используйте SD-карту соответствующего размера
1.2Не удается установить APIВозможности пользователей по установке ограничены (нет прав пользователя root)Используйте команду 'sudo' перед указанными командами, чтобы получить права администратора. В Linux этот вид доступа известен как суперпользователь.
3.1Проблемы с GelMAФункционализация, диализ или лиофилизацияПодробный пошаговый протокол, включая список устранения неполадок, доступен в Loessner et al.33.
5.1 и 6.2Рабочая станция не реагирует на командыПроблемы с подключениемПоверните все и выключите компьютер. Выключите блок питания на 10 с. Снова включите компьютер и рабочую станцию.
5.1 и 6.2Рабочая станция не реагирует на командыПроблемы с подключениемПроверьте, распознает ли компьютер USB-соединение и правильно ли определен USB-порт. Убедитесь, что брандмауэр не препятствует процессу подключения (см. ссылку ниже таблицы 2).
5.1 и 6.2Не удается открыть файлНеправильный каталогПроверьте директор (путь к папке), чтобы убедиться, что используется правильный путь. Если файл (например, interface.py) не может быть найден, вполне вероятно, что используется неправильный путь.
6.6.2Наконечник неправильно прикреплен или падает во время движенияПроблема калибровкиПовторите шаги калибровки для пипетки и убедитесь, что капиллярный поршень правильно соединен с пипеткой.
6.6.2Наконечник неправильно прикреплен или падает во время движенияПроблема с вложениемПипетка неправильно соединена с осью пипетки и движется во время шагов движения. Затяните винты, чтобы предотвратить это.
6.6.2Наконечник аспирируется над материаломПроблема калибровкиПовторите калибровку этого типа лотка, чтобы правильно определить высоту.
6.6.2Наконечник аспирируется над материаломПроблема калибровкиПроверьте громкость в трубке и убедитесь, что объем равен объему, определенному в приложении конструктора протоколов.
6.6.2Материал опускается во время движенияСлишком много лишнего материала на наконечникеДобавить опцию сенсорной док-станции; опционально, также может быть увеличено время для прикосновения наконечника.
6.6.2Материал твердый или слишком вязкий для пипеткиТермочувствительное поведение материалаПроверьте термочувствительную характеристику материала и отрегулируйте температуру нагрева / охлаждения температуры док-станции соответственно.
https://support.opentrons.com/en/articles/2687601-c-having-trouble-connecting-try-this-basic-troubleshooting

Таблица 2: Таблица устранения неполадок с выявленными проблемами, возможными причинами, а также решениями для решения проблем.

Дополнительный файл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пипетка вязких материалов, особенно гидрогелей для биомедицинских применений19,20,21,33,47, является рутинной задачей во многих исследовательских лабораториях для подготовки определяемой пользователем концентрации или серии разбавления с различными концентрациями. Хотя он повторяется и выполнение довольно простое, в основном оно выполняется вручную с низкой пропускной способностью выборки18. В этом учебнике представлена работа рабочей станции с открытым исходным кодом, которая была специально разработана для вязких материалов, чтобы обеспечить автоматизированное смешивание вязких материалов для воспроизводимой генерации желаемых концентраций. Эта рабочая станция оптимизирована для дозирования гидрогелей, что обеспечивает автоматизированную и высоконадежную обработку за счет интеграции температурных доков для термочувствительных материалов, пипеток с положительным смещением для вязких материалов и дополнительной сенсорной док-станции для удаления лишнего материала из наконечника. Модуль дозирования был специально оптимизирован для обеспечения стандартизированной и автоматизированной обработки вязкого материала. По сравнению с пипетками на воздушной подушке (рисунок 5a), пипетки с положительным смещением (рисунок 5b) дозируют вязкие материалы, не оставляя остаточного материала в наконечнике, что приводит к точным объемам аспирации и дозирования. Дополнительная сенсорная док-станция наконечника удаляет из наконечника лишний образец материала (рисунок 5c,d), что полезно для клеевых материалов (например, 4% (мас./об.) альгината).

Протокол конструктора был специально запрограммирован для гидрогелей и позволяет разбавлять до четырех реагентов с различными концентрациями и до двух разбавителей. Риск ошибок при расчете конечных разбавлений предотвращается в этом приложении, поскольку пользователи выбирают только желаемую концентрацию или последовательные стадии разбавления. Необходимые объемы аспирации и дозирования рассчитываются автоматически, сохраняются в отдельном текстовом файле документации, а затем заполняются в скрипт протокола. Это приложение для проектирования протокола дает пользователю полный контроль над всеми экспериментальными параметрами (например, скоростью дозирования) и обеспечивает внутреннюю документацию важных параметров. Приложение для проектирования протокола учитывает уровень заполнения резервуара (например, скважины) и изменяет высоту аспирации / дозирования, чтобы предотвратить ненужное погружение в вязкие материалы. Эта встроенная функция позволяет избежать накопления материала на внешней стенке наконечника и, тем самым, обеспечивает надежные задачи аспирации и дозирования на протяжении всего протокола. Хотя протокол конструктора был разработан для стадий разбавления гидрогеля, он также может быть использован для разбавления невязких жидкостей, таких как красители Orange G. Приложение конструктора протоколов, которое доступно через репозиторий в разделе '/examples/publication-JoVE', является версией, которая объясняется в разделе протокола и выделяется в видео. Эта версия не будет обновляться. Однако обновленная версия приложения конструктора протоколов доступна на главной странице репозитория. Калибровочный терминал был первоначально разработан Sanderson48 и был оптимизирован для калибровки пипеток с положительным смещением.

Как описано в разделе 4 протокола, пипетки, а также контейнеры должны быть откалиброваны изначально. Этот процесс калибровки имеет решающее значение для определения и сохранения позиций, которые затем используются для расчета приращений движения. Таким образом, успешное выполнение протокола зависит от четко определенных положений калибровки, так как неправильные точки калибровки могут привести к столкновению наконечника в контейнер. Поскольку положения плунжеров пипеток должны быть откалиброваны вручную, точность и точность дозирования в значительной степени зависят от выполняемой калибровки. Эти процедуры калибровки в значительной степени зависят от пользовательского опыта работы с модулем дозирования, и поэтому в начале рекомендуется обучение с опытным персоналом для обеспечения надлежащих процедур калибровки. В дополнение к ручной калибровке на модуле дозирования, сама пипетка должна быть откалибрована для обеспечения точного пипетки. Рекомендуется калибровать пипетки не реже одного раза в 12 месяцев, чтобы они соответствовали критериям приемлемости, указанным в ISO 8655. Для внутренней оценки калибровки пипетки доступны валидация и верификация, как описано в Stangegaard et al.16.

Для генерации достоверного набора данных крайне важно начать с реагентов высокого качества. Это особенно важно для задач по переработке гидрогеля, так как вариации от партии к партии могут повлиять на полученные результаты в рамках этого протокола. В дополнение к вариациям от партии к партии, тонкие изменения в приготовлении небольших объемов также могут способствовать различиям в свойствах. Чтобы этого не допустить, рекомендуется подготовка больших объемов, которые можно использовать для всех экспериментов.

Процедуры валидации и верификации основаны на использовании красителя для идентификации надежных смесей. Представленный протокол описывает применение Orange G, но общий протокол и рабочий процесс анализа также могут быть адаптированы к флуоресцентным красителям49,50. Использование Orange G снижает технические требования к спектрофотометру и устраняет меры предосторожности, принятые для предотвращения отбеливания флуоресцентных красителей после воздействия света. Проблемы в растворении или образовании кластера красителя не наблюдались с представленными материалами во время экспериментов, но могли появляться с другими материалами. Потенциальное образование кластера и, следовательно, взаимодействие между красителем и материалом могут быть легко обнаружены с помощью микроскопа.

Процедуры и методы, представленные в этом учебнике, добавляют возможности автоматизации к текущим рабочим процессам для вязких материалов для достижения высоконадежных задач с минимальным человеческим трудоемким трудом. Предоставленная таблица устранения неполадок (таблица 2) включает выявленные проблемы и представляет возможные причины, а также решения для решения проблем. Представленная рабочая станция успешно применяется к натуральным (желатин, геллановая камедь, матригель) и синтетическим (например, поли(этиленгликоль) [PEG], Pluronic F127, Lutrol F127) полимерным материалам для автоматизированных задач пипетки. В частности, сочетание рабочей станции с открытым исходным кодом и приложения для разработки протокола с открытым исходным кодом, предназначенного для вязких материалов, будет очень полезно для исследователей, работающих в области биомедицинской инженерии, материаловедения и микробиологии.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CM и DWH являются учредителями и акционерами Gelomics Pty Ltd. CM также является директором Gelomics Pty Ltd. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, имеющего отношение к предмету данной статьи. Авторы не имеют никаких других соответствующих связей или финансового участия с какой-либо организацией или органом, имеющим финансовый интерес или финансовый конфликт с предметом или материалами, обсуждаемыми в статье, кроме тех, которые раскрыты.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают признательность сотрудникам Центра регенеративной медицины при QUT, в частности, Антонии Хорст и Павлу Мешчанеку за их полезные предложения и отзывы. Эта работа была поддержана премией QUT за последипломные исследования для SE и Австралийским исследовательским советом (ARC) в рамках грантового соглашения IC160100026 (УЧЕБНЫЙ ЦЕНТР промышленной трансформации ARC в аддитивном биопроизводстве). NB был поддержан Национальным советом по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC) Peter Doherty Early Career Research Fellowship (APP1091734).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
15 реакционных пробирокFisher Scientific, Inc. (США)14-959-53A
пробирки 5 млPacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Австралия)Размер SCT-5MLзависит от протокола эксперимента; также можно использовать пробирки Eppies (0,5, 1, 1,5 мл) или Falcon (15, 50 мл); продукт производится компанией Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name
50 мл реакционные пробиркиFisher Scientific, Inc. (США)14-432-22
70% w/w этанолLabChem, Inc. (США)aja726-5Lpl
96-луночный планшетThermo Fisher Scientific, Inc. (США)https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055
АльгинатNovaMatrix4200001https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/
Деминерализованный или сверхчистый (MilliQ) водный
желатин метакрилоил (GelMA)Синтезированный подробный протокол собственной разработки(включая материалы и ссылки) доступен в Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037
Фенил-литий-2,4,6-триметилбензоилфосфинат (LAP)Sigma-Aldrich, Inc. (США)900889
M4 и M5 Allen keyOpenBuilds, inc. (США)179, 190также доступны в каждом хозяйственном магазине. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/
OrangeGFisher Scientific (США)O267-25https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Thermo Fisher Scientific, Inc. (США)14190-144альтернативно: таблетки PBS: 18912014 (Thermo Fisher Scientific)
Equipment
Алюминиевые блоки для температурного докаRatek Instruments Pty. Ltd. (Австралия)SB16для различных размеров пробирок. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html
Аналитические весыSartorius AG (Германия)ED224S
Робот для работы с жидкостями с открытым исходным кодом: коммерческий продуктOpentrons Laboratories, Inc. (США)OT-One S Prohttps://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro
Робот для работы с жидкостями с открытым исходным кодом: открыть Исходное оборудованиеСобрано собственными силами в соответствии с подходомФайлы аппаратного и программного обеспечения находятся в свободном доступе на GitHub и Zenodo (ссылки предоставлены); инструкции по сборке предоставлены. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24
Пипетка прямого вытеснения: MicromanEGilson, Inc. (США)FD10006зависит от требуемого размера. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html
СпектрофотометрBMG LABTECH GmbH (Германия)CLARIOstar
Советы: капиллярные поршниGilson, Inc. (США)F148180в зависимости от требуемого размера. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191
Доступны блоки с открытым исходным кодом

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jarvis, M. F., Williams, M. Irreproducibility in Preclinical Biomedical Research: Perceptions, Uncertainties, and Knowledge Gaps. Trends in Pharmacological Sciences. 37 (4), 290-302 (2016).
  2. Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505 (7485), 612-613 (2014).
  3. Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The economics of reproducibility in preclinical research. PLoS Biology. 13 (6), 1-9 (2015).
  4. Niepel, M., et al. A Multi-center Study on the Reproducibility of Drug-Response Assays in Mammalian Cell Lines. Cell Systems. 9 (1), 35-48 (2019).
  5. Prinz, F., Schlange, T., Asadullah, K. Believe it or not: how much can we rely on published data on potential drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (9), 712(2011).
  6. Baker, M. 1,500 scientists lift the lid on reproducibility. Nature. 533 (7604), 452-454 (2016).
  7. Begley, C. G., Ellis, L. M. Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).
  8. Sena, E. S., van der Worp, H. B., Bath, P. M. W., Howells, D. W., Macleod, M. R. Publication Bias in Reports of Animal Stroke Studies Leads to Major Overstatement of Efficacy. PLoS Biology. 8 (3), 1000344(2010).
  9. Ioannidis, J. P. A., Kim, B. Y. S., Trounson, A. How to design preclinical studies in nanomedicine and cell therapy to maximize the prospects of clinical translation. Nature Biomedical Engineering. 2 (11), 797-809 (2018).
  10. Enserink, M. Sloppy reporting on animal studies proves hard to change. Science. 357 (6358), 1337-1338 (2017).
  11. Freedman, L. P., Inglese, J. The Increasing Urgency for Standards in Basic Biologic Research. Cancer Research. 74 (15), 4024-4029 (2014).
  12. Lippi, G., Lima-Oliveira, G., Brocco, G., Bassi, A., Salvagno, G. L. Estimating the intra- and inter-individual imprecision of manual pipetting. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 55 (7), 962-966 (2017).
  13. Hentz, N. G., Knaide, T. R. Effect of Liquid-Handling Accuracy on Assay Performance. Journal of Laboratory Automation. 19 (2), 153-162 (2014).
  14. Reason, J. Understanding adverse events: human factors. Quality and Safety in Health Care. 4 (2), 80-89 (1995).
  15. Schober, L., et al. Cell Dispensing in Low-Volume Range with the Immediate Drop-on-Demand Technology (I-DOT). Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 154-163 (2015).
  16. Stangegaard, M., Hansen, A. J., Frøslev, T. G., Morling, N. A Simple Method for Validation and Verification of Pipettes Mounted on Automated Liquid Handlers. Journal of Laboratory Automation. 16 (5), 381-386 (2011).
  17. Crombie, D. E., et al. Development of a Modular Automated System for Maintenance and Differentiation of Adherent Human Pluripotent Stem Cells. SLAS Discovery. 22 (8), 1016-1025 (2017).
  18. Eggert, S., Hutmacher, D. W. In vitro disease models 4.0 via automation and high-throughput processing. Biofabrication. 11 (4), 043002(2019).
  19. Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Advanced Materials. 25 (36), 5011-5028 (2013).
  20. Zhang, Y. S., Khademhosseini, A. Advances in engineering hydrogels. Science. 356 (6337), (2017).
  21. Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
  22. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  23. Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 1-11 (2014).
  24. Gao, G., Huang, Y., Schilling, A. F., Hubbell, K., Cui, X. Organ Bioprinting: Are We There Yet. Advanced Healthcare Materials. 7 (1), 1701018(2018).
  25. Schuurman, W., et al. Gelatin-Methacrylamide Hydrogels as Potential Biomaterials for Fabrication of Tissue-Engineered Cartilage Constructs. Macromolecular Bioscience. 13 (5), 551-561 (2013).
  26. Lim, K. S., et al. New Visible-Light Photoinitiating System for Improved Print Fidelity in Gelatin-Based Bioinks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1752-1762 (2016).
  27. Müller, M., et al. Development and thorough characterization of the processing steps of an ink for 3D printing for bone tissue engineering. Materials Science and Engineering C. 108, 110510(2020).
  28. Sewald, L., et al. Beyond the Modification Degree: Impact of Raw Material on Physicochemical Properties of Gelatin Type A and Type B Methacryloyls. Macromolecular Bioscience. 18 (12), 1-10 (2018).
  29. Eggert, S., Mieszczanek, P., Meinert, C., Hutmacher, D. W. A modular open source technology for automated in vitro workflows. Zenodo. , (2020).
  30. Volk, A., Kähler, C. J. Density model for aqueous glycerol solutions. Experiments in Fluids. 59 (5), 75(2018).
  31. Zhang, H., Grinstaff, M. W. Recent Advances in Glycerol Polymers: Chemistry and Biomedical Applications. Macromolecular Rapid Communications. 35 (22), 1906-1924 (2014).
  32. Klotz, B. J., Gawlitta, D., Rosenberg, A. J. W. P., Malda, J., Melchels, F. P. W. Gelatin-Methacryloyl Hydrogels: Towards Biofabrication-Based Tissue Repair. Trends in Biotechnology. 34 (5), 394-407 (2016).
  33. Loessner, D., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
  34. Ansari, S., et al. Regulation of the fate of dental-derived mesenchymal stem cells using engineered alginate-GelMA hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2957-2967 (2017).
  35. Axpe, E., Oyen, M. Applications of Alginate-Based Bioinks in 3D Bioprinting. International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 1976(2016).
  36. Ma, X., et al. 3D printed micro-scale force gauge arrays to improve human cardiac tissue maturation and enable high throughput drug testing. Acta Biomaterialia. 95, 319-327 (2019).
  37. Bas, O., et al. Rational design and fabrication of multiphasic soft network composites for tissue engineering articular cartilage: A numerical model-based approach. Chemical Engineering Journal. 340, 15-23 (2018).
  38. O'Connell, C. D., et al. Tailoring the mechanical properties of gelatin methacryloyl hydrogels through manipulation of the photocrosslinking conditions. Soft Matter. 14 (11), 2142-2151 (2018).
  39. LearnPython.org. , Available from: https://www.learnpython.org (2020).
  40. Raspberry Pi Foundation: Using your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-using (2020).
  41. Raspberry Pi Foundation: Setting up your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-setting-up/4 (2020).
  42. Raspberry Pi Foundation: Connect your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-setting-up/3 (2020).
  43. Python Software Foundation: python.org. , Available from: https://www.pthon.org (2020).
  44. Python Software Foundation: pypi.org. , Available from: https://pypi.org (2020).
  45. Opentrons Labworks, Inc: Installing pipettes. , Available from: https://support.opentrons.com/en/articles/689945-installing-pipettes (2020).
  46. Kang, C. W., Lee, M. S., Seong, Y. J., Hawkins, D. M. A Control Chart for the Coefficient of Variation. Journal of Quality Technology. 39 (2), 151-158 (2007).
  47. Annabi, N., et al. 25th Anniversary Article: Rational Design and Applications of Hydrogels in Regenerative Medicine. Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).
  48. Theo Sanderson: OpenTronsTerminalCalibration. , Available from: https://github.com/theosanderson/OpentronsTerminalCalibration (2020).
  49. Rhode, H., et al. An Improved Method for Checking HTS/uHTS Liquid-Handling Systems. Journal of Biomolecular Screening. 9 (8), 726-733 (2004).
  50. Taylor, P. B., et al. A Standard Operating Procedure for Assessing Liquid Handler Performance in High-Throughput Screening. Journal of Biomolecular Screening. 7 (6), 554-569 (2002).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3DGelMA

Похожие статьи