Фаг терапии Применение для противодействия Pseudomonas aeruginosa инфекции в муковисцидоз Зебрафиш Эмбрионы

Фаге терапии, использование естественных врагов бактерий для борьбы с бактериальными инфекциями, набирает новый интерес, как бактериальная устойчивость к антибиотикам^{становится широко распространенным 1,2}. Эта терапия, используемая в течение десятилетий в Восточной Европе, можно считать дополнительным лечением антибиотиков в лечении легочных инфекций у пациентов с CF и возможной терапевтической альтернативой для пациентов, инфицированных бактериями, которые устойчивы ко всем используемым в настоящее время^{антибиотикам 2,3}. Преимущества антибиотикотерапии в том, что бактериофагы размножаются на месте инфекции, в то время как антибиотики метаболизируются и^{выбывают из организма 4,,5.} Действительно, администрирование коктейлей вирулентных фагов, изолированных в различных лабораториях, оказалось эффективным в лечении инфекций Pseudomonas aeruginosa в животных моделях, таких как насекомые^{и млекопитающие 6,7,8}. Фаге терапии было также показано, чтобы быть в состоянии уменьшить бактериальную нагрузку в ожоговых ран, инфицированных P. aeruginosa и Escherichia coli в рандомизированных клинических^{испытаний 9}.

Зебрафиш(Danio rerio) недавно стала ценной моделью для изучения инфекций с несколькими патогенами, в том числе P. aeruginosa^10,11, Mycobacterium abscessus и Burkolderia cepacia^12,13. Путем микроинъекций бактерий сразу в^{циркуляцию крови зародыша 14} легко установить системную инфекцию которая противодействована зебрафиш врожденной иммунной системой, которая эволюционирована сохранена с нейтрофилами и поколением макрофагов подобно к людским двойнику. Кроме того, в течение первого месяца жизни эмбрионы зебры не имеют адаптивного иммунного ответа, что делает их идеальными моделями для изучения врожденного иммунитета, который является критическим защитным механизмом в легочных^{инфекциях человека 15}. Зебрафиш недавно появилась как мощная генетическая модель системы, чтобы лучше понять начало CF и разработать новые^{фармакологические методы лечения 10,,16,17}. CF зебрафиш модель cftr нокдаун генерируется с морфолино инъекции в зебрафиш представил смоченной реакции респираторного всплеска и снижение^{миграции нейтрофилов 10}, в то время как cftr нокаут приводит к нарушению внутреннего положения органа и разрушение экзокринной поджелудочной железы, фенотип, который^{отражает болезни человека 16,17}. Наибольший интерес представляет вывод о том, что бактериальная нагрузка P. aeruginosa была значительно выше в cftr-потеря-функции эмбрионов, чем в контроле на 8 часов после заражения (hpi), который параллели результаты, полученные с мышами и человека бронхиальных эпителиальных^{клеток 2,18}. cftr

В этой работе мы демонстрируем, что фаг-терапия эффективна против инфекций P. aeruginosa у эмбрионов зебры.

Взрослые зебры(Danio rerio) из штамма AB (Европейский ресурсный центр Зебрафиш E'RC) поддерживаются в соответствии с международными (Директива ЕС 2010/63/EU) и национальными руководящими принципами^{(итальянский указ от 4 марта} 2014 года, n. 26) о защите животных, используемых в научных целях. Стандартные условия устанавливаются на рыбном объекте с 14 ч темного цикла света/10 ч и температурой воды в резервуаре при температуре 28 градусов по Цельсию.

1. Подготовка решений и инструментов

1. Подготовье 50-х стокового раствора и 1x рабочих решений для среды эмбриона E3 для выращивания эмбрионов зебры (см. таблицу 1).
2. Сделать пигментации блокирующий раствор, чтобы блокировать пигментацию эмбриона от 24 часов после оплодотворения (24 л.с.) (см. таблицу 1).
3. Подготовка 25x акции и 1x рабочий трикан обезболивающее решение, как описано в таблице 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания раствора, который может повредить фондовый раствор, сделать aliquots 2 мл 25x tricaine и хранить их при -20 градусов по Цельсию.
4. Подготовка треков для микроинъекции эмбриона путем растворения 1 г агарозы в 100 мл дистиллированной H₂O в микроволновой колбе или бутылке. Микроволновая печь в течение 1-3 мин, пока агароза полностью не растворит.
5. Позиция зебры микроинъекции формы (см. Таблица материалов) перевернулся в чашке Петри (90 мм х 15 мм) и покрыть всю поверхность, наливая жидкий гель агарозы с шириной около 10 мм.
6. Удалите плесень после того, как агароза затвердевла. Заполните чашку Петри 1x E3 среды эмбриона. Это может храниться при 4 градусов по Цельсию в течение примерно одной недели. Перед использованием замените свежей средой E3, содержащей Tricaine.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Старые формы могут развиваться грибки или бактериальных загрязнений.
7. Используйте огонь полированной 10 см борозиликат капилляры для подготовки иглы для микроинъекции и закрепить их в micropipette шкив, затягивая ручки. Установите шкив со следующими настройками: тепло 500, скорость 100, время 150, тянуть 150.

2. P. aeruginosa (PAO1) инокулум препарат

1. Привить 1 колонию^GFPиP. aeruginosa штамм PAO1^{19 в 5} мл бульона LB (см. таблицу 1) и расти на ночь при 37 градусов по Цельсию со тряской (200 об/мин).
2. Разбавить выше ночной культуры до OD₆₀₀ и 0,1 в 10 мл бульона LB и расти до OD₆₀₀ и 0,5 при 37 градусов по Цельсию со тряской (200 об / мин).
3. Центрифуга 2 мл культуры в течение 2 мин при 4 градусов по Цельсию при 16100 х г и повторное разрешение клеточной гранулы на OD₆₀₀ и 1, что эквивалентно примерно 1 х 10⁹ cfu/mL, в 1 мл физиологического раствора (см. таблицу 1).
4. Разбавить клеточной суспензией примерно до 5 х^{10 7}кфу/мл в физиологическом растворе и хранить при 4 градусах Цельсия.

3. Подготовка запасов фаге

1. Прививка 1 колонии P. aeruginosa штамм PAO1 в 5 мл бульона LB и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию со тряской. Разбавить ночную культуру до_{OD 600} и 0,01 в 500 мл бульона LB и расти при 37 градусов по Цельсию со встряхивания до OD₆₀₀ и 0,05, что эквивалентно около 2,5 х 10⁷ cfu/mL.
2. К разбавленной культуре P. aeruginosa,добавить около 1,25 х^{10 7} фагов, чтобы получить множественность инфекции (M.O.I.) от 10^-3. Инкубировать при 37 градусов по Цельсию с встряхивания до OD_{600 падает} примерно до 0,1-0,3 (примерно в 3 до 5 ч, в зависимости от используемого фагома).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Четыре фага были отобраны для этого эксперимента, которые заражают штамм PAO1: Два Podoviridae, GenBank присоединения номера vB_PaeP_PYO2, MF490236, и vB_PaeP_DEV, MF490238, и два Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241, и vB_PaeM_E217, MF490240. Выполните следующие шаги для каждого фагов по отдельности.
3. Инкубировать лизат с 1 мг/мл DNase и RNase в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию. Центрифуга при 5000 х г в течение 30 мин при 4 градусов по Цельсию и тщательно восстановить супернатант (SN). Фильтр SN с фильтром, имеющих диаметр поры 0,8 мкм.
4. В SN добавьте 58 г/л NaCl и 105 г/л PEG6000. Растворите с перемешиванием на RT 20 мин, а затем держать его на ночь при 4 градусов по Цельсию. Центрифуга при 20 000 х г в течение 30 мин при 4 градусах цельсия для выпадения фагов. Удалите SN и тщательно растворите фаговую гранулу в 15 мл буфера TN (см. таблицу 1).
5. Очистить фагов градиентом плотности CsCl, как описано в шагах ниже.
   1. В полиалломерных ультрацентрифугных трубках для ротора SW41 подготовьтесь градиент плотности шага CsCl, расслоив 2 мл из четырех решений CsCl, описанных в таблице 1.  Добавьте 3,5 мл фаговой подвески в каждую из 4 трубок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: CsCl является токсичным, принять надлежащие процедуры безопасности для обработки и отказаться от него.
   2. Ввести трубки в ротор и убедитесь, что трубы сбалансированы (разница в весе между двумя облицовочных трубок должна быть ≤ 0,01 г).
   3. Центрифуга для 2 ч при 4 кк и 100 000 х г (25 000 об/мин для ротора SW41). После центрифугации медленно снимите трубки и тщательно обездвижйте их на опоре. Используя шприц с иглой 19 G, нарисуйте белую/опалесцентную полосу, которая обычно находится между областью плотности d'1.5 и d'1.4.
   4. Перенесите подвески из шприца в новые полиалломеры для ротора SW60 и используйте раствор d'1.4, чтобы точно сбалансировать трубки.
   5. Центрифуга подвески при 4 градусах Цельсия и 150 0000 х г (38 000 об/мин для ротора SW60) не менее 16 ч.
   6. Соберите видимую полосу, как указано выше (см. шаг 3.3.3) и перенесите их в диализные трубки с 6000 Da cut-off. Dialyze получил видимый диапазон 2x в течение 20 минут против 500 мл воды и на ночь против 500 мл буфера TN. Фильтр с фильтром поры 0,22 мкм и хранить при 4 градусов по Цельсию.

4. Приготовление коктейлей Фаге

1. Сделать смесь из четырех фагов, которые заражают штамм PAO1, ранее изолированных и характеризуется⁸. Перед смешиванием, оценить titer каждого фагового запаса по налету анализ²⁰.
2. Соберите фаг коктейль, с общим титр 5 × 10⁸ pfu/mL, в равной степени смешивания четырех фагов препаратов в том же pfu/mL непосредственно перед каждым экспериментом, чтобы обеспечить точный фаг титры.

5. Сбор и подготовка эмбрионов зебры для микроинъекции cftr morpholinos

ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите 1-2 клеточных эмбрионов из диких зебры типа для микроинъекции cftr morpholinos(cftr-MOs).

1. За два дня до бактериального эксперимента микроинъекции, создать размножения пар и собирать эмбрионы, как описано^{ранее 21}. Взрослые зебры(Danio rerio)штамма AB были приобретены у Европейского ресурсного центра Зебрафиш, E'RC.
2. На следующий день после этого, собирать эмбрионы сразу после оплодотворения с пластиковой пипеткой или с помощью тонкой сетки ситечко. Поместите собранные эмбрионы в чашку Петри, содержащую E3 эмбриона среды и тщательно удалить мусор с пластиковой пипетки, чтобы избежать загрязнения, которые могут повредить развитию эмбриона.
3. Приготовьте 5 мкл раствора для инъекций морфолино, разбавляя два раствора морфолино (1 мМ) в стерильной воде до конечной концентрации 0,25 пмоль/эмбрион ATG-MO - 0,25 пмоль/зародыш-МО. Чтобы проследить инъекцию эмбриона, добавьте 0,5 МКЛ фенола красного цвета в смесь раствора для инъекций морфолино.
4. Загрузите микроинъекцию иглы с приблизительно 5 йл раствора смеси морфолино с помощью микропипетта 20 йл с тонкой наконечником загрузки геля. Закрепите иглу к микроманипулятору, подключенному к стенду, и располите ее под стереомикроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не обязательно, что раствор достигает кончика иглы, как давление микроинъектор насос будет толкать его.
5. Отрежь кончик иглы, разрезав кончик иглы мелким стерильным пинцетом. Измерьте диаметр капли с помощью планки шкалы в глазу микроскопа. Кроме того, создать каплю минерального масла на микрометровый слайд и установить объем микроинъекции путем введения раствора в масляной капли для оценки размера капли. Используйте каплю диаметром 156 мкм, чтобы ввести объем 2 нл.
6. Установите микроинъектор, регулируя давление компенсации до 15 hPa, время впрыска до 0,5 с, и давление впрыска между 300 и 600 hPa, чтобы получить правильный объем впрыска в зависимости от используемой иглы.
7. С помощью пластиковой пипетки расположить эмбрионы от шага 5,2 на стекло, расположенное в 96 мм диаметром Петри блюдо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком много E3 среды предотвратит надлежащее проникновение микроинъекции иглы в хорион эмбрионов.
8. Проникнуть в хорион, а затем желток с иглой, чтобы ввести 2 nL в эмбрион, как описано^{ранее 22}.
9. Поместите вводимые эмбрионы в чашку Петри со средой E3 и поместите их в инкубатор при 28 градусов по Цельсию, чтобы они развивались до следующий день.

6. Микроинъекция эмбрионов зебры с бактериями и фагом коктейля

ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения системной инфекции, эмбрион должен иметь кровообращение, которое обычно начинается после 26 л.с.

1. После 26 л.с. (для стадий развития зебры относятся к Kimmel²¹) дехорионат эмбрионов с проназовым раствором, приготовленным путем растворения проназового порошка в среде E3 при концентрации 2 мг/мл. Аккуратно пипетки эмбрионов, чтобы сломать хорион. Откажитесь от проназе/E3 среды и промыть блюдо несколько раз со свежим E3, чтобы удалить все проназе.
2. Анестезировать эмбрионы зебры в E3 среде, содержащей Tricaine примерно за 5 минут до инъекций.
3. Пипетты обасыть эмбрионы в трек подготовлен в шаге 1. Используйте тонкий гель загрузки отзыв линии эмбрионов в боковом положении.
4. Загрузите микроинъекцию иглы примерно с 5 йл препарата P. aeruginosa, как описано в части 5.
5. Вставьте иглу dorsally к отправной точке протока Кювье, где он начинает распространяться по желтковому мешку. Ввимит объем 1-3 нл и убедитесь, что объем расширяется непосредственно внутри протока и попадает в циркуляцию.
6. Приблизительно после каждых 50 инъекций эмбриона, введать каплю бактерий в 1,5 мл центрифуги трубки с 100 йл стерильных PBS, чтобы проверить, если объем инъекции остается прежним. Плита инокулум на LB агар (см. таблицу 1) при 37 градусов по Цельсию ночь для оценки CFU.
7. Перенесите микроинъектированные эмбрионы в две чистые чашки Петри со свежимИ E3 средними и инкубировать их при 28 градусов по Цельсию.
8. В двух выбранных точках времени: 30 мин или 3 ч после бактериальной инъекции, вынюхить одну из чашек Петри с бактериальными инъекционными эмбрионами из инкубатора и выровнять их в треке, как описано в 6.3 для инъекции фагового коктейля.
9. Загрузите микроинъекцию иглы примерно с 5 мкл фагового коктейля (подготовленного в шаге 4) с тонкой наконечником загрузки геля и закрепите его на микроинжектор (см. шаг 5).
10. Ввимить фаг-коктейль в проток Кювье эмбрионов, ранее введенных с бактериями.
11. Перенесите микроинъектированные эмбрионы в две чистые чашки Петри со свежимИ E3 средними и инкубировать их при 28 градусов по Цельсию.

7. Оценка бактериального бремени эмбрионов, вводимых с помощью ПАО1 и фагов

1. На 8 л.с., пипетка 15 анестезировал эмбрионов от чашки Петри до 1,5 мл центрифуги трубки.
2. Замените обезболивающее решение на 300 МЛ 1% Triton X-100 в PBS (PBSTritonX) и гомогенизируйте эмбрионы, передав их по крайней мере 15x через инсулиновый шприц со стерильной иглой 27-G.
3. Подготовка серийных разбавлений гомогенатов в стерильных PBS путем передачи 100 йл разбавленного гомогената в 900 МЛ стерильных PBS.
4. Чтобы выбрать для естественно ампер-резистентного штамма PAO1, пластина 100 МКЛ разбавления на Агаре LB добавляется с ампициллином (100 мкг/мл), и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение ночи.
5. На следующий день, подсчитайте количество колоний, умножить на фактор разбавления, чтобы определить общее число CFU, и разделить на количество эмбрионов гомогенизированных для получения среднего числа CFU / инфицированных эмбрионов.

8. Оценка летальности эмбрионов, вводимых с помощью ПАО1 и фагов

1. Чтобы оценить летальность инфекции PAO1, оценка инъекционных эмбрионов на 20 л.с. под стереомикроскопом и рассчитывать на мертвых эмбрионов (белый / не прозрачный).
2. Рассчитайте половину максимальной смертельной концентрации 50 (LD50) дозы PAO1, которая определяет смерть 50% инъекционных эмбрионов при 20 л.с.

9. Подготовка эмбрионов к стереомикроскопу замедленной визуализации^{инфекции} GFP и PAO1

1. Препарировать форму для живого эмбриона изображения путем растворения 1,5% низкой плавления агарозы в 100 мл раствора E3.
2. Добавьте 1% Tricaine (см. таблицу 1) для обезболивать эмбрионы.
3. При 4 л.с. перенесите один эмбрион с пластиковой пипеткой в стеклянную нижнюю тарелку и добавьте теплый низкоплавильный раствор агарозы.
4. Распоить стеклянное дно блюда под стереомикроскопом и с кончиком положения эмбриона в нужной ориентации. Используйте пластиковую пипету, чтобы аккуратно добавить каплю агарозы на эмбрион.
5. Пусть агароза остыть в течение 5-10 минут и аккуратно заполнить стеклянное дно блюдо с E3, содержащий анестезии раствор, чтобы сохранить эмбрион влажным.
6. Поместите стеклянную нижнюю тарелку с эмбрионом под флуоресцентный стереомикроскоп с флуоресцентным фильтром (канал 488 нм) для^{бактерий} GFP. Не снимите чашку Петри до дальнейших приобретений с теми же параметрами на 9, 14 и 18 л.с.

10. Экспрессионистский анализ провоспалительных цитокинов

1. При 20 л.с. анестезирует эмбрионы раствором трикаина 1x и перенесите их из чашки Петри в центрифугу 1,5 мл.
2. Под дымовой капот снимите обезболивающее раствор и замените 200 МКЛ гидрохлоридного реагента гуанидия.
3. Гомогенизировать эмбрионы, трубя их повторно через 200 мкл пипетки, а затем по крайней мере 15x с инсулиновым шприцем со стерильной иглой 27 G.
4. Извлекайте полную РНК из гомогенизированных эмбрионов зебры с использованием коммерчески доступных гидрохлоридных реагентов гуанидия в соответствии с инструкциями производителя.
5. Лечить 1 мкг каждого образца РНК с 2 йл 1U / йл DNase I (RNase-бесплатно), следуя инструкциям производителя.
6. Используйте 1 мкг DNase я лечил РНК для обратной транскрипции реакции (RT) с использованием коммерчески доступного комплекта (см. Таблица материалов), в общем объеме 20 йл в соответствии с инструкциями производителя.
7. Выполните реакцию RT qPCR в общем объеме 10 ЗЛ, содержащую 1x SYBR Green mastermix с использованием 1,5 МЛ 1:6 разбавления реакции RT. Для целей нормализации используйте праймеры для хранения генов rpl8 и провоспалительных цитокинов, используйте праймеры для TNF-α и IL-1 (см. таблицу 2). qPCR протокол был: цикл 1 шаг 1: 95 КК, 2 мин, повторить один раз; цикл 2: шаг 1 95 градусов по Цельсию, 10 с, шаг 2 55 градусов по Цельсию, 30 с, повторите 40x; цикл 3: шаг 1 72 КК, 15 мин.

Результаты и цифры, представленные здесь, ссылаются на эмбрионы CF, генерируемые путем инъекции cftr morpholinos,как описано ранее 10 и в шаге 5. Для проверки фенотипа CF были рассмотрены нарушения положения внутренних органов, таких как сердце, печень иподжелудочная железа, как описано ранее17 (рисунок 1). Аналогичные результаты были получены в случае эмбрионов WT, как сообщалось в нашей предыдущейпубликации 19.

Бактериальное бремя было уменьшено фаг-терапией в эмбрионах CF, инфицированных PAO1. Кроме того, мы оценили бактериальную нагрузку на уровне 8 л.с. путем гомогенизации групп из 15 эмбрионов: среднее количество бактерий (cfu/embryo), присутствующих в зараженных эмбрионах PAO1, сократилось примерно до 20% после лечения фагом, тем самым подтвердив менее тяжелую инфекцию в присутствии фаговогококтейля (рисунок 2).

Летальность была снижена с помощью фаготерапии в эмбрионах CF, инфицированныхбактериями GFP и PAO1. CF эмбрионы зебры на 48 л.с. были введены с GFPи бактерии штамма PAO1 в дозе, которая вызвала 50% летальности после 20 л.с. (30 cfu/embryo, Рисунок 3A). Местом инъекции был желток или проток Кювье для создания системной инфекции. Фаг-терапия против инфекции ПАО1 была протестирована путем введения 2 nL одинаково смешанного фагового коктейля (300-500 pfu/embryo). Инъекция была выполнена в двух разных точках времени: 30 мин (ранний) и 7 часов (поздно) после бактериальной инъекции. В обоих случаях летальность была снижена на 20 л.с., что указывает на эффективность фаг-терапии(рисунок 3B).

С живой визуализации, используя флуоресцентный стереомикроскоп, мы также следили за прогрессированием инфекции в эмбрионах CF вводили сGFP PAO1 и показал эффективность фаготерапии в снижении распространения флуоресцентных бактерий над желтковый мешок. В верхней части рисунка 4показан инъекционный эмбрион CF-PAO1 с размножением бактерий GFP- на уровне 4, 9, 14 и 18 л.с., в то время как эмбрион CF-PAO1 с пониженной флуоресценцией из-за действия фага против бактерий показан внижней части (рисунок 4).

Фаг-терапия уменьшила воспалительный ответ, порожденный инфекцией PAO1 в эмбрионах CF. Мы также оценили иммунный ответ, генерируемый PAO1 и PAO1 и инъекцией фагов на 8 л.с. Как и ожидалось, экспрессия провоспалительных цитокинов TNF-a и IL-1, проанализированных методами qPCR, была значительно увеличена после инъекций PAO1 по сравнению с контролем, в то время как она была уменьшена с коинъемой фагового коктейля(рисунок 5A,B).

Рисунок 1: Поколение и проверка эмбрионов CF при инъекциях cftr morpholinos(cftr-MOs). (A)Нарушение положения и цикл сердца в CF вводили эмбрионы по сравнению с дикого типа (WT) эмбрионов. Сердце визуализируется с выражением cmlc2 с помощью метода гибридизации наместе. (B) Нарушение положения печени (стрелки) и поджелудочной железы в эмбрионах CF по сравнению с WT. Печень и поджелудочная железа визуализированы с выражением prox1a методами гибридизации на месте. Шкала баров указывает на 100 мкм. лив: печень; p: поджелудочная железа. Цифра перепечатывается с19 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Бактериальное бремя в эмбрионах CF, инфицированных PAO1 или PAO1-фагов.. Относительный процент cfu/embryo в PAO1'phages против эмбрионов PAO1 дается. Сообщается о среднем и SD трех независимых экспериментов. Цифра перепечатывается с19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Летальность эмбрионов CF зебры, инфицированных PAO1 и PAO1-фагов.  (A) Определение LD50 в 48 л.с. зебры эмбрионов microinjected с cftr-MOна 1-клеточной стадии (CF эмбрионов) и инфицированных на 48 л.с. с 2 nL культуры PAO1, содержащий все большее количество бактерий (cfu/embryo). Летальность эмбрионов наблюдалась на уровне 20 л.с. (B) Летальность на 20 л.с. эмбрионов CF инфицированных PAO1 на 48 л.с. и лечение фагом коктейль (PAO1 "Φ). Среднее и SD сообщили от шести и четырех экспериментов, соответственно, каждый с 25-40 эмбрионов. Угловая трансформация была применена к проценту летальности и одной стороны ANOVA следуют тест Дункан был использован. Цифра перепечатывается с19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Изображение эффективности фаг терапии у зебры. Прогрессирование инфекции в эмбрионах CF после инъекции PAO1 (верхний эмбрион) и эффективность фаг-терапии в PAO1-фагов вводили эмбрионы (нижний эмбрион) на 4, 9, 14 и 18 л.с. Шкала бар указывает 100 микрон. Цифра перепечатывается с19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Выражение пр- и противовоспалительных цитокинов после PAO1 и PAO-фаге администрации. Уровни экспрессии генов TNF-a (A) и IL-1, измеряемые RT-qPCR на уровне 8 л.с. в эмбрионах CF, вводимых с PAO1 и PAO1-Φ при 48 л.с. и нормализованных с использованием экспрессии rpl8. Сообщается о среднем и SD четырех экспериментов. Статистическая значимость была оценена ANOVA, а затем тест Дункана: для TNF- a (CF) против (CF-PAO1) р 0,015 евро; (CF) vs (CF-PAO1)Φ) р 0,019 евро; (CF-PAO1) vs (CF-PAO1) Φ) р 0,77 н.с.; для ИЛ-1 (CF) против (CF-PAO1) р 0,00014;; (CF) vs (CF-PAO1) Φ) р - 0,00068 "; (CF-PAO1) vs (CF-PAO1) Φ) р 0,031. Цифра перепечатывается с19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Таблица 1: Подготовка решений.

Таблица 2: Праймеры, используемые для RT-qPCR.

Авторов нечего раскрывать.