Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка гибели клеток с использованием бесклеточного супернатанта пробиотиков в трехмерных сфероидных культурах колоректальных раковых клеток

6.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61285

⸱

13 июня 2020 г.

 ,  ,  ,  , 
1Microbiological Analysis Team, Group for Biometrology, Korea Research Institute of Standards and Science (KRISS), 2College of Pharmacy, Chungnam National University (CNU), 3Stem Cell Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), 4Convergent Research Center for Emerging Virus Infection, Korea Research Institute of Chemical Technology (KRICT), 5Department of Bio-Analysis Science, University of Science & Technology (UST)

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлены методы для понимания противораковых эффектов lactobacillus бесклеточного супернатанта (LCFS). Линии клеток колоректального рака показывают гибель клеток при лечении LCFS в 3D-культурах. Процесс генерации сфероидов может быть оптимизирован в зависимости от каркаса, а представленные методы анализа полезны для оценки задействованных сигнальных путей.

Аннотация

В этой рукописи описан протокол оценки гибели раковых клеток в трехмерных (3D) сфероидах многоклеточных типов раковых клеток с использованием супернатантов из клеточной культуры Lactobacillus fermentum, рассматриваемой как культуры пробиотиков. Использование 3D-культур для тестирования безклеточного супернатанта Lactobacillus (LCFS) является лучшим вариантом, чем тестирование в 2D-монослоях, тем более что L. fermentum может производить противораковые эффекты в кишечнике. Было выявлено, что супернатант L. fermentum обладает повышенными антипролиферативными эффектами против нескольких клеток колоректального рака (CRC) в условиях 3D-культуры. Интересно, что эти эффекты были тесно связаны с моделью культуры, демонстрируя заметную способность L. fermentum индуцировать гибель раковых клеток. Стабильные сфероиды были получены из различных КРЦ (колоректальных раковых клеток) с использованием протокола, представленного ниже. Этот протокол генерации 3D-сфероида экономит время и экономична. Эта система была разработана для легкого исследования противораковых эффектов LCFS в нескольких типах сфероидов CRC. Как и ожидалось, сфероиды CRC, обработанные LCFS, сильно индуцировали гибель клеток во время эксперимента и экспрессировали специфические молекулярные маркеры апоптоза, проанализированные qRT-PCR, западным блоттингом и анализом FACS. Поэтому этот метод ценен для изучения жизнеспособности клеток и оценки эффективности противораковых препаратов.

Введение

Пробиотики являются наиболее выгодными микроорганизмами в кишечнике, которые улучшают иммунный гомеостаз и энергетический обмен хозяина1. Пробиотики из Lactobacillus и Bifidobacterium являются самыми передовыми в своем роде, обнаруженными в кишечнике2,3. Предыдущие исследования показали, что Lactobacillus оказывает ингибирующее и антипролиферативное действие на несколько видов рака, включая колоректальный рак4. Кроме того, пробиотики предотвращают воспалительные заболевания кишечника, болезнь Крона и язвенный колит5,6. Однако большинство исследований с пробиотиками проводились в двухмерных (2D) монослоях, которые выращиваются на твердых поверхностях.

Системы искусственных культур не имеют особенностей окружающей среды, что не является естественным для раковых клеток. Для преодоления этого ограничения были разработаны трехмерные (3D) системы культур7,8. Раковые клетки в 3D показывают улучшения с точки зрения основных биологических механизмов, таких как жизнеспособность клеток, пролиферация, морфология, клеточно-клеточная связь, чувствительность к лекарственным средствам и актуальность in vivo9,10. Кроме того, сфероиды производятся из многоклеточных типов колоректального рака и зависят от клеточно-клеточных взаимодействий и внеклеточного матрикса (ECM)11. Наше предыдущее исследование показало, что пробиотический бесклеточный супернатант (CFS), полученный с использованием Lactobacillus fermentum, показал противораковые эффекты на 3D-культурах клеток колоректального рака (CRC)12. Мы предположили, что CFS является подходящей альтернативной стратегией для тестирования пробиотических эффектов на 3D-сфероидах12.

Здесь мы представляем подход, который может приспособить многоклеточные типы 3D-колоректального рака для анализа терапевтических эффектов пробиотического бесклеточного супернатанта (CFS) на нескольких системах 3D-мимикрии колоректального рака. Этот метод предоставляет средства для анализа связанных пробиотических и противораковых эффектов in vitro.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Бактериальные клеточные культуры и получение безклеточного супернатанта Lactobacillus (LCFS)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 1.2 – 1.9 проводятся в анаэробной камере.

  1. Готовят агаровую пластину MRS и бульон, содержащий L-цистеин, и стерилизуют автоклавированием.
  2. Предварительно инкубируют агарную пластину MRS в анаэробной камереH2, поддерживаемой при 37 °C с кислородом 20 ppm.
  3. Оттаивайте бактериальный запас Lactobacillus и прививайте агаровую пластину бактериальной культурой(рисунок 1A (i)).
  4. Инкубировать бактерии в течение 2 - 3 дней в анаэробной камереH2 при 37 °C и 20 ppm кислорода до получения отдельных бактериальных колоний.
  5. Промыть и высушить анеробную культурную трубку типа Hungate. Автоклав культуральная трубка при 121 °C в течение 15 мин.
  6. Затем инкубируют трубку в анаэробной камереH2 при 37 °C и 20 ppm кислорода для удаления кислорода.
  7. Поместите 2 - 3 мл бульона MRS в пробирку. Запечатайте трубку пробкой из бутилкаучука и прикрутите колпачок.
  8. Получите одну колонию с петлей и поместите ее в культурную трубку 1,5 мл с 500 мкл 1x PBS. (Рисунок 1А ii)).
  9. Приостановить колонию с помощью шприца 1 мл(рисунок 1А (iii)). Сделайте это, вставив иглу шприца 1 мл в центр крышки трубки, аспирируя взвешенную колонию, а затем повторно идуцируя ее обратно в пластовую жиму для бульона MRS. (Рисунок 1А iv)).
  10. Инкубировать мрс-отвар в шейкерном инкубаторе в течение 2 дней (37 °C, 5% CO2,200 об/мин).
  11. Измерьте оптическую плотность (OD) с помощью спектрофотометра для мониторинга кривых роста бактерий до тех пор, пока поглощение ПРИ OD620 не достигнет 2,0.
  12. Отделите бактериальные гранулы и кондиционированную жиму путем центрифугирования при 1000 х г в течение 15 мин. Вымойте собранные бактериальные гранулы 1x PBS и повторно суспендируем в 4 мл RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычий сыворотки. Не включайте антибиотики в среду.
  13. Выдерживают бактериальные гранулы в RPMI и инкубируют в шейкерном инкубаторе в течение 4 ч при 37 °C с 5% CO2 со скоростью 100 об/мин.
  14. Для получения пробиотического супернатанта удаляют бактериальную гранулу путем центрифугирования при 1000 х г,в течение 15 мин при 4 °C. Стерильно-фильтруйте восстановленное супернатант с помощью фильтра 0,22 мкм и храните при −80 °C до использования.

2. Генерация сфероидов

  1. Подготовка линий клеток колоректального рака
    1. Выращивайте клеточные линии DLD-1, HT-29 и WiDr в качестве монослоев до 70-80% слияния и инкубирует пластину при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2 (Питательнаясреда: RPMI, содержащая 10% фетальной бычий сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицин).
    2. Для клеток, выращенных в 100 мм чашке Петри, дважды вымойте пластину 4 мл 1x PBS. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубируют чашку Петри в течение 2 мин при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2 для диссоциации клеток.
    3. После инкубации проверьте диссоциацию клеток под микроскопом и нейтрализуйте трипсин-ЭДТА 5 мл питательной среды.
    4. Переложите диссоциированные клетки в коническую трубку 15 мл и центрифугу в течение 3 мин при 300 х г.
    5. Отбросьте супернатант и осторожно повторно суспендируйте с 3 мл питательных сред.
    6. Подсчитайте клетки с трипановым синим цветом, чтобы определить жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра. (Рисунок 1B (i))
  2. Сфероидная формация
    1. В конической пробирке 15 мл разбавляют ячейки от 2,1,5 до получения 1 - 2 х 105 клеток/мл(рисунок 1B (ii))
    2. Добавьте конечную концентрацию 0,6% метилцеллюлозы в клеточную суспензию и перенесите разбавленные клетки в стерильный резервуар.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой клеточной линии необходимое количество метилцеллюлозы должно быть титровано и определено соответствующим образом.
    3. Используйте многоканальную пипетку для дозирования 200 мкл клеток в каждую скважину сверхнизкой прикрепленной 96-скважинной круглой нижней микропластины. (Рисунок 1В iii))
    4. Инкубируют пластину при 37 °C в 5% CO2 инкубаторе в течение 24 - 36 ч.
    5. Через 24 - 36 ч наблюдают за пластиной под световым микроскопом, чтобы обеспечить образование сфероидов.

3. Лечение 3D-клеток колоректального рака с помощью LCFS

  1. Создайте сфероиды, как описано в шагах 2 и 3.
  2. Перед выполнением процедуры LCFS разморозить замороженный LCFS при комнатной температуре (RT) в течение 10 - 20 мин.
  3. Инокулируйте раствор запасов LCFS в питательную среду. Последовательно разбавляют до 25%, 12,5% и 6% в питательной среде (т.е. 25% LCFS = 150 мкл питательной среды + 50 мкл LCFS).
  4. Извлеките из инкубатора пластину для культивации клеток, содержащую сфероиды, и удалите как можно больше питательной среды из каждой скважины с помощью пипетки 200 мкл.
  5. Добавьте среду роста с LCFS на клетки и инкубируют при 37 °C в 5% CO2 инкубаторе в течение 24 - 48 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем, который будет использоваться, будет зависеть от размера пластины следующим образом: 2 мл для 6-скважинных пластин клеточных культур; 200 мкл для 96-скважинных пластин для культивированных клеток.

4. Жизнеспособность клеток для сфероидов

  1. Приготовьте 8 - 10 обработанных LCFS сфероидов колоректального рака в непрозрачных многосквазных пластинах (анализы жизнеспособности клеток проводят через 48 ч после лечения LCFS).
  2. Разморозить реагент жизнеспособности клеток (см. Таблицу материалов)при 4 °C на ночь.
  3. Уравновешивают жизнеспособность клеточного реагента до комнатной температуры перед использованием.
  4. Перед выполнением анализа удалите 50% ростовых сред из сфероидов.
  5. Добавьте 100 мкл реагента жизнеспособности клеток в каждую скважину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем, который будет использоваться, будет зависеть от размера пластины следующим образом: 100 мкл для 96-скважинных пластин клеточной культуры.
  6. Энергично перемешайте реагент в течение 5 мин, чтобы способствовать лизису клеток.
  7. Инкубировать в течение 30 мин – 2 ч при 37 °C.
  8. Запишите люминесценцию.

5. Количественный анализ полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для сфероидов

  1. Для каждого состояния подготовьте 10 - 15 сфероидов в пробирке 2 мл и центрифуге в течение 3 мин при 400 х г.
  2. Выбросьте супернатант и промыть сфероиды дважды в 1 мл ледяного 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте центрифугирования, дайте сфероидам успокоиться.
  3. Аспирировать как можно больше из 1x PBS и изолировать РНК с помощью коммерчески доступного комплекта.
  4. Синтезировать кДНК из 1 мкг РНК с помощью коммерчески доступного комплекта в соответствии с протоколом производителя.
  5. Подготовьте мастер-микс для запуска всех образцов в трехместном формате (см. Таблицу 1 и Таблицу 2).
  6. Выполните усиление в 20 мкл шаблона мастер-микса в каждую пластину qPCR.
  7. Хорошо перемешайте реакции и при необходимости раскрутите.
  8. Запуск образцов в соответствии с рекомендациями производителя прибора(табл. 3).

6. Вестерн-блоттинг из сфероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе сфероидов используйте пипетку 200 мкл и обрежьте конец наконечников, чтобы не нарушить их структуру.

  1. Для каждого состояния подготовьте 30 - 40 сфероидов в трубке 2 мл.
  2. Поместите трубку на лед и дайте сфероидам осесть на дно трубки 2 мл.
  3. Выбросьте супернатант и дважды промыте сфероиды в 1 мл ледяного холода 1x PBS
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте центрифугирования, дайте сфероидам успокоиться.
  4. Аспирировать как можно больше из 1x PBS и добавить буфер RIPA с коктейлем ингибитора протеазы (10 сфероидов = 30 мкл буфера RIPA).
  5. Различает клетки путем пипетки вверх и вниз и выполняет ультразвук в течение 30 с с 30 с отдыха на льду в течение 10 циклов.
  6. Центрифугируют лизаты белка при 15000 х г в течение 15 мин при 4 °C.
  7. Определите концентрацию белка для каждой клетки лизата.
  8. Перед загрузкой вскипятите каждую клетку лизата в буфере образца при 100 °C в течение 10 мин.
  9. Загрузите равное количество белка в колодцы геля SDS-PAGE и запустите гель в течение 1 - 2 ч при 100 В.
  10. Перенесите белок из геля на мембрану PVDF.
  11. После переноса блокируют мембрану на 1 ч при комнатной температуре с помощью блокирующего буфера (5% обезжиренного молока + TBS с 0,05% Tween-20).
  12. Инкубировать мембрану с 1:1000 разведениями первичных антител(таблица 4)в 1x TBST с 5% буфером BSA при 4 °C в течение ночи.
  13. Промывайте мембрану три раза с помощью TBST, 15 мин для каждой стирки.
  14. Инкубируют мембрану с разведениями вторичных антител 1:2 500 в блокирующий буфер при комнатной температуре в течение 2 ч (см. Таблицу материалов).
  15. Промывайте мембрану три раза с помощью TBST, 15 мин для каждой стирки.
  16. Подготовьте мембрану для обнаружения HRP с помощью хемилюминесцентного субстрата.
  17. Получайте хемилуминесцентные изображения.

7. Окрашивание сфероидов йодидом пропидия (PI)

  1. Подготовьте 5-10 сфероидов, как описано на этапе 4.1, и поместите сфероиды в инкубатор при 37 °C и 5% CO2.
  2. Разбавить 1 мг/мл запаса PI 1:100 в 1x PBS.
  3. Удалите 50% среды из каждой скважины плиты из 96 скважин.
  4. Добавляют 100 мкл раствора PI в каждую скважину и помещают скважины в инкубатор при 37 °C и 5% CO2 в течение 10 - 15 мин.
  5. Вымойте раствор PI с помощью 1x PBS.
  6. Добавьте 200 мкл питательной среды и сделайте снимок с помощью флуоресцентного микроскопа. Проанализируйте интенсивность флуоресценции с помощью изображения J, чтобы получить показатель жизнеспособности сфероида.

8. FACS анализ сфероидов

  1. Создавайте сфероиды, как описано выше.
  2. Для каждого состояния подготовьте 30 - 40 сфероидов в трубке FACS и центрифуге в течение 3 мин при 400 х г и RT.
  3. Аспирировать супернатант и промыть сфероиды в 3 мл 1x PBS, затем центрифугу при 400 х г в течение 3 мин при 4 °C.
  4. Аспирировать супернатант и добавить 200 мкл 0,25% трипсина-ЭДТА, затем инкубировать на RT в течение 2-3 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации зависит от размера сфероида и типа клетки.
  5. Добавьте 1 мл буфера FACS и аккуратно диссоциируйте сфероиды с помощью пипетки 200 мкл.
  6. Центрифугируют диссоциированные ячейки при 400 х г и 4 °C в течение 3 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер FACS = 1x PBS + 2,5% FBS, отфильтрованный с помощью верхнего фильтра 0,22 мкм.
  7. Откажитесь от супернатанта и добавьте реагент 7-AAD/Annexin V (7AAD (5 мкл), Annexin V (5 мкл)/образец).
  8. Осторожно вихрь клетки и насиживают в течение 13 - 30 мин при РТ в темноте.
  9. Добавьте 500 мкл буфера FACS и отфильтруйте ячейки с помощью конических полистирольных пробирок для удаления заполнителей.
  10. Центрифуга при 400 х г и 4 °C в течение 3 мин.
  11. Добавьте 500 мкл буфера связывания Annexin V в каждую трубку и повторно суспендировать.
  12. Анализ с помощью проточного цитометра.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Описан протокол получения сфероидов из разнообразных линий клеток колоректального рака. Добавки с метилцеллюлозой требовались для получения сфероидов. Также представлен метод получения LCFS и представлена модель для изучения корреляции между пробиотиками и колоректальным раком. Протоколы формирования сфероидов и подготовки LCFS схематически проиллюстрированы на рисунке 1A,B. Как показано на рисунке 2А,концентрация метилцеллюлозы 0,6% превращает ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Микроокружение тканей, включая соседние клетки и внеклеточный матрикс (ECM), имеет основополагающее значение для генерации тканей и имеет решающее значение для контроля роста клеток и развития тканей13. Однако 2D-культуры имеют ряд недостатков, таких как нарушение клеточных взаимодействий, а также изменения в морфологии клеток, внеклеточной среде и приближении деления14. Системы 3D-клеточных культур были тщательно изучены для лучшего воспроизведения эффектов in vivo и были ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют соответствующей финансовой информации.

Благодарности

Это исследование было поддержано «Установлением эталонов для химии и радиации», номер гранта KRISS-2020-GP2020-0003 и «Разработка стандартов измерений и технологий для биоматериалов и медицинской конвергенции», грант No KRISS-2020-GP2020-0004, финансируемый Корейским научно-исследовательским институтом стандартов и науки. Это исследование также было поддержано Министерством науки и ИКТ (MSIT), Национальным исследовательским фондом Кореи (NRF-2019M3A9F3065868), Министерством здравоохранения и социального обеспечения (MOHW), Корейским институтом развития индустрии здравоохранения (KHIDI, HI20C0558), Министерством торговли, промышленности и энергетики (MOTIE) и Корейским институтом оценки промышленных технологий (KEIT, 20009350). ORCID ID (Хи Мин Ю: 0000-0002-5951-2137; Дукджин Кан: 0000-0002-5924-9674; Сейл Ким: 0000-0003-3465-7118; Джу-Ын Ли: 0000-0002-2495-1439; Джина Ли: 0000-0002-3661-3701). Благодарим Чанг Ву Парк за помощь в проведении экспериментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии

10% Mini-PROTEAN TGX Сборные протеиновые гели, 15-луночные, 15 и микро; l		Biorad4561036шт 10
Applied Biosystems MicroAmp Оптическая адгезивная пленкаThermo Fisher Scientific4311971100 крышек
10x Трансферный буферIntronIBS-BT031A1 л
10X Трис-глицин (с SDS)IntronIBS-BT0141 л
Axygen 2,0 мл MaxyClear Snaplock микроцентрифужная пробирка, полипропилен, прозрачный, нестерильный, 500 пробирок/упаковка, 10 упаковок/коробкаCorningSCT-200-C500 туб/пачка, 10 упаковок/коробка
BD Difco Bacto AgarBD214010500 г
BD Difco Lactobacilli MRS BrothBDDF0881-17-5500 г
CellTiter-Glo 3D Анализ жизнеспособности клетокPromegaG9681100μ l/анализ в 96-луночных планшетах
Полный коктейль ингибиторов протеазыSigma-Aldrich11697498001флакон из 20 таблеток
Corning Фосфат-Буферный Солевой Раствор, 1X без кальция и магния, PH 7.4 ± 0.1Corning21-040-CV500 мл
EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer MembranesFisher ScientificIPVH00010рулон 26,5 см x 3,75 м; Размер пор: 0,45 мкм
Falcon 5 мл Пробирка из полистирола с круглым дном, с сетчатым фильтром Snap CapCorning35223525 мкм в упаковке, 500 мкм в упаковке
Фетальная бычья сыворотка, сертифицированная, американское происхождениеThermo Fisher Scientific16000044500 мл iScript
cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 & микро; l rxns #1708890Biorad170889025 x 20 &микро; L rxns
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad17251215 x 1 мл
Lactobacillus fermentumКорейская коллекция для типовых культурKCTC 3112
L-цистеина гидрохлорида моногидратSigma-AldrichC6852-25G25 г
метилцеллюлозы (3500-5600mPa· s, 2% в воде при 20°С; C)TCIM0185500 г
MicroAmp Fast Optical 96-луночный реакционный планшет со штрих-кодом, 0,1 млApplied Biosystems434690620 планшетов
Millex-GS Шприцевой фильтрующий блок, 0,22 &; m, смешанные эфиры целлюлозы, 33 мм, этиленоксид стерилизованныйMilliporeSLGS033SB250
PE Аннексин V Набор для обнаружения апоптоза с 7-AADBiolegend640934100 тестами
Пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл)Thermo Fisher Scientific15140122100 мл
интрогенайодида пропидиумаP1304MP100 мг
RIPA Лизис и экстракционный буферThermo Fisher Scientific89901250 мл
RNeasy Mini Kit (250)Qiagen74106250
RPMI-1640Gibco11875-119500 мл
Трипсин-ЭДТА (0,25%), феноловый красныйThermo Fisher Scientific25200056100 мл
Название материалов/оборудования/программного обеспеченияCompanyКаталожный номерComments/Description
anti - p-Iκ Bα (В-9)Santa cruzesc-8404200 µ г/мл
анти-BclxL (H-5)Santa cruzesc-8392200 µ г/мл
анти-PARP 1 (C2-10)Santa cruzesc-5364350 &микро; l асцит
анти-&бета;-актин (C4)Santa cruzesc-47778200 µ g/mL
BD FACSVerseBD BiosciencesСан-Диего, Калифорния, США
Synergy HTX Многорежимный считыватель микропланшетовBioTS1LFA
CO2инкубатор Thermo fisherHERAcell 150i
Коническая трубка 15 млSPL50015
Коническая трубка 50 млSPL50050
Corning Costar Ultra-Low Attachment Многолуночная пластинаSigma-AldrichCLS7007
Corning Costar Сверхнизкое вложение Многолуночная пластинаSigma-AldrichCLS3471
Costar 50 мл Резервуары для реагентов, 5 / пакет, стерильныйCostar4870
Камера для подсчета клеток Countess ГоркиThermofisherC10228
Countess II FL Автоматизированный счетчик клетокinvitrogen
Многорежимный считыватель EnSpirePerkin Elmer Enspire2300
Многоканальный дозатор Eppendorf Research Plus, 8-канальныйEppendorf3122000051
программное обеспечение FlowJoTreeStarAshland, OR, США
Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson immunoresearch115-035-0621,5 мл
Goat Anti-rabbit IgG (H+L)Jackson immunoresearch111-035-1442,0 мл
GraphPad Prism 5GraphPad SoftwareInc., Сан-Диего, Калифорния, США
ImageJNIH
ImageQuant LAS 4000 miniFujifilmТокио,
Япония Инкубационный шейкер ЛабораторныйкомпаньонSIF-6000R
Multi Gauge Ver. 3.0,FujifilmТокио, Япония
Спектрофотометры оптической плотности (OD)УФ/ВИД спектрофотометрыPerkin ElmerWaltham, MA, США
Фазово-контрастный микроскопOlympusTokyo, Япония
SPL Микроцентрифужная трубка 1,5 млSPL60015
SPL Многоканальные резервуары, 12-канальные, PS, стерильныеSPL21012
StepOnePlus Системадля ПЦР в реальном времениThermo Fisher ScientificУолтем, Массачусетс, США
Ультразвуковые жидкостные процессоры Vibra-cellSONICS-vibra cellVC505 500 Вт ультразвуковой
процессор Виниловая анаэробная камераCOY LAB PRODUCTS
AMQAF1000

Ссылки

  1. Bron, P. A., Van Baarlen, P., Kleerebezem, M. Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa. Nature Reviews Microbiology. 10 (1), 66-78 (2012).
  2. Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., Sánchez, B., Margolles, A. Bifidobacteria and their molecular communication with the immune system. Frontiers in Microbiology. 8, 1-9 (2017).
  3. Sanders, M. E., Merenstein, D. J., Reid, G., Gibson, G. R., Rastall, R. A. Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (10), 605-616 (2019).
  4. Pandey, K. R., Naik, S. R., Vakil, B. V. Probiotics, prebiotics and synbiotics- a review. Journal of Food Science and Technology. 52 (12), 7577-7587 (2015).
  5. Harish, K., Varghese, T. Probiotics in humans-evidence based review. Calicut Medical Journal. 4 (4), 3(2006).
  6. Routy, B., et al. The gut microbiota influences anticancer immunosurveillance and general health. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (6), 382-396 (2018).
  7. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. Most of the cell-based data-harvesting efforts that drive the integration of cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  8. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  9. Jong, B. K. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
  10. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103(2016).
  11. Anton, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: A breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 5517-5527 (2015).
  12. Lee, J. E., et al. Characterization of the Anti-Cancer Activity of the Probiotic Bacterium Lactobacillus fermentum Using 2D vs. 3D Culture in Colorectal Cancer Cells. Biomolecules. 9 (10), 557(2019).
  13. Koledova, Z. 3D cell culture: An introduction. Methods in Molecular Biology. 1612, (2017).
  14. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  15. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 1-14 (2018).
  16. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  17. Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8, 2886(2018).
  18. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  19. Thirumala, S., Gimble, J., Devireddy, R. Methylcellulose Based Thermally Reversible Hydrogel System for Tissue Engineering Applications. Cells. 2 (3), 460-475 (2013).
  20. Chandrashekran, A., et al. Methylcellulose as a scaffold in the culture of liver-organoids for the potential of treating acute liver failure. Cell and Gene Therapy Insights. 4 (11), 1087-1103 (2018).
  21. Lee, W., Park, J. 3D patterned stem cell differentiation using thermo-responsive methylcellulose hydrogel molds. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  22. Fan, H., Demirci, U., Chen, P. Emerging organoid models: Leaping forward in cancer research. Journal of Hematology and Oncology. 12 (1), 1-10 (2019).
  23. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  24. Liou, C. S., et al. A Metabolic Pathway for Activation of Dietary Glucosinolates by a Human Gut Symbiont. Cell. 180 (4), 717-728 (2020).
  25. Sherwin, E., Bordenstein, S. R., Quinn, J. L., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Microbiota and the social brain. Science. 366 (6465), 2016(2019).
  26. Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
  27. Bárcena, C., et al. Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice. Nature Medicine. 25 (8), 1234-1242 (2019).
  28. Michalovich, D., et al. Obesity and disease severity magnify disturbed microbiome-immune interactions in asthma patients. Nature Communications. 10, 5711(2019).
  29. Ansaldo, E., et al. Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis. Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Сфероиды колоректального ракасупернатант Lactobacillus3D-культивирование клетоканализ гибели клетокпроточная цитометриявестерн-блоттингОТ-ПЦР в реальном времениобработка метилцеллюлозойсверхнизкая адгезиямаркеры апоптоза
Оценка гибели клеток с использованием бесклеточного супернатанта пробиотиков в трехмерных сфероидных культурах колоректальных раковых клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.