Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Рентгеновская кристаллография для изучения олигомерского государства Переход Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

3.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61288

⸱

13 мая 2020 г.

 ,  ,  , 
1Laboratory of Microbiology, Department of Molecular Biology, Université Libre de Bruxelles, 2Labiris Institut de Recherche

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол был разработан для изучения димер-додекамер переход TmPep1050, M42 аминоптидазы, на структурном уровне. Это простой трубопровод, начиная от очистки белка и обработки рентгеновских данных. Кристалллогенез, индексация набора данных и молекулярная замена были подчеркнуты в ходе исследования, tmPep1050H60A H307A вариант.

Аннотация

Аминопептиды M42 образуют функционально активные комплексы из 12 подразделений. Их процесс сборки, как представляется, регулируется их металлических ионных кофакторов запуска димер-додекамер перехода. При связывании металлических ионов в активном месте и интерфейсе взаимодействия происходит несколько структурных модификаций, формирующих димеры для содействия самосожасыву. Для наблюдения за такими изменениями, стабильные олигомеры должны быть изолированы до структурного исследования. Сообщается, что здесь метод, который позволяет очистки стабильных додекамеров и димеров TmPep1050, M42 aminopeptidase T. maritima, и их структура определения рентгеновской кристаллографии. Димеры были подготовлены из додекамеров путем удаления металлических ионов с хелатирующим агентом. Без кофактора додекамеры стали менее стабильными и были полностью разобщены при нагревании. Олигомерные структуры были решены с помощью простого молекулярного подхода к замене. Чтобы проиллюстрировать методологию, представлена структура варианта TmPep1050, полностью нарушенного в металлической ионой привязке, не показывающей дальнейшего разбивки димеров на мономеры.

Введение

Олигомеризация является преобладающим процессом, который диктует биологические функции многих белков. В Escherichia coli, подсчитано, что только 35% белков мономерных1. Некоторые белки, называемые морфиинами, могут даже принять несколько олигомерных состояний с субъединицами, имеющих различную структуру в каждом олигомеромсостоянии 2. Переход между их олигомерными состояниями часто является способом регулирования белковой активности, поскольку каждое олигомерное состояние может иметь различную специфическую активность или функцию. Несколько примеров морфиены были хорошо документированы в литературе, в частности, porphobilinogenсинтазы 3, HPr киназы /фосфатазы 4, Лон протеазы5, лактатдегидрогеназы 6, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы7, пируваткиназы 8, цитратсинтазы 9, и рибонуклеаза10. Недавно мы описали M42 aminopeptidase TmPep1050, еще один пример фермента с морфеином, как поведение, чья активность зависит от его олигомерныхсостояний 11. Переход между олигомерными состояниями опосредован его металлическими кофакторами, которые вызывают несколько структурных модификаций подразделений.

Семейство аминопептидазы M42 принадлежит к клану MH12,13, и широко распространено среди бактерий и Archaea14. M42 aminopeptidases являются подлинными динуклеарными ферментами, унижающими пептиды до 35 аминокислотных остатков в длину15. Они принимают своеобразную тетраэдрообразную структуру из 12 подразделений с их активными участками, ориентированными на внутреннюю полость. Такое расположение часто описывается как нано-разобщение деятельности, чтобы избежать неконтролируемого протеолиза. Физиологическая функция M42 aminopeptidases может быть связана с протеасомой, гидролизующих пептидов в результатедеградации белка 16,17. Pyrococcus horikoshii обладает четырьмя аминоптидами M42, каждая из которых представляет различные, новзаимодополняющие особенности 18,19,20,21. Сингулярно, гетерокомплексы из двух различных типов подразделений были описаны в P. horikoshii, предполагая существование пептидасомныхкомплексов 22,23.

Несколько структур M42 aminopeptidases были описаны влитературе 11,16,18,19,20,24,25,26. Подразделение состоит из двух различных областей, каталитический домен и домен димеризации. Каталитический домен принимает общий α/β, сохраненный во всем клане MH, архетипический каталитический домен является аминокислотой Ap1 из Vibrio proteolyticus27. Домен димеризации принимает PD-как раз16 и может иметь, в дополнение к своей роли в олигомеризации, роль в управлении доступом к субстрату и связывания во внутренней полости11. Поскольку основной строительный блок является более тусклым, dodecamer часто описывается как объединение шести димеров, каждый димер, расположенный на каждом краю тетраэдр16. Олигомеризация аминопептидас M42 зависит от наличия его металлических кофакторов. Ионы металла Divalent, часто«n 2» и Co2, каталитически участвуют в пептидной привязке и гидролизе. Они находятся в двух различных связывающих участках, а именно на участках М1 и М2. Два металлических ионов также диск и тонко настроить олигомеризации, как попродемонстрировано для PhTET2, PhTET3, PfTET3, и TmPep105011,24,28,29. Когда металлические кофакторы истощаются, dodecamer разбирает на димеры, как в PhTET2, PhTET3, и TmPep105011,16,28, или даже мономеры, как в PhTET2 и PfTET324,29.

Здесь представлен протокол, используемый для изучения структур олигомеров TmPep1050. Этот протокол представляет собой набор распространенных методов, включая очищение белка, скрининг протеолитической активности, кристаллизацию, рентгеновскую дифракцию и молекулярную замену. Подчеркиваются тонкости, присущие работе с металлоконструкцимами, олигомеризацией белка, кристаллизацией белка и молекулярной заменой. Пример исследования также представлен, чтобы показать, может ли tPep1050 dodecamers еще больше разобщиться на мономеры или нет. Для решения этого вопроса, вариант TmPep1050, TmPep1050H60A H307A, был изучен, чьи металлические связывающие сайты нарушаются путем мутации Его-60 (M2 сайт) и его-307 (M1 сайт) в Ала остатков. Этот протокол может быть размещен для изучения других M42 aminopeptidases или любые metalloenzymes с морфеином, как поведение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Производство и очистка рекомбинантных TmPep1050

ПРИМЕЧАНИЕ: В дальнейшем описаны процедуры клонирования и очистки дикого типа TmPep1050 адаптированы из предыдущего исследования11. Кроме того, клонирование может быть сделано с помощью синтетического гена. Для генерации вариантов TmPep1050, сайт направленного мутагенеза может быть выполнен следующие, например, одно-праймер реакции в параллельном протоколе (SPRINP)метод 30. Протокол очистки может быть использован для вариантов TmPep1050. Следует избегать использования Его тега, поскольку он мешает связыванию металлических ионов.

  1. Конструкция вектора выражения
    1. Приобретение геномной ДНК Thermotoga maritima MSB8 (ATCC 43589) или TmCD00089984 (Совместный центр структурной геномики).
    2. Увеличь TM_1050 рамки чтения (ORF) с помощью геномной ДНК или плазмиды шаблона, полимераза ДНК высокой точности, и следующие грунтовки: ocej419 (5'- TTTAACTTTAAGAAGGACATACATACCCATGAAGGAACTGAACTGAGAAGGAAGCTG) и ocej420 (5'- ATCCGCCAAACACCCAAGCTGGGGGGGGGGCCCCCCCAGATGATGATGATGAGGAG). Вы запустите скрининг полимеразной цепной реакции (ПЦР) по следующей схеме: 5 мин при 95 градусов по Цельсию, 30 циклов по 3 шага (30 с при 95 градусов по Цельсию, 30 с при 55 градусов по Цельсию, 90 с при 72 градусах по Цельсию) и 10 минут при 72 градусов по Цельсию в качестве заключительного шага.
    3. Клонировать фрагмент ПЦР в подходящий векторэкспрессии (Таблица материалов)путем гомологичной рекомбинации(рисунок 1) в кишечной палочке в соответствии с протоколом SLiCE31. До 50 нг линейного вектора добавьте фрагмент ПЦР в молярное соотношение 10:1 фрагмента к вектору, 1 л экстракта штамма PPY, 50 мМ Трис-HCl pH 7.5, 100 mM MgCl2, 10 mM ATP, и 10 mM дитиотрейтол (DTT) для объема реакции 10 л. Инкубация в течение 1 ч при 37 градусах По Цельсию.
    4. Преобразование химически компетентных E. coli XL1 синий штамм (или любой recA- подходящий штамм) с 1 йл рекомбинации реакции. Плита клеток на СРЕДЕ LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Инкубировать пластины на ночь при 37 градусов по Цельсию.
    5. Выберите колонии на свежих пластинах LB с ампициллином 100 мкг/мл. Инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию, по крайней мере 8 ч.
    6. Экран для положительных кандидатов колонии ПЦР с использованием подходящей грунтовки пары (5'- ATGCCATAGCATTTTTATCC и 5'- ATTTAATCTGTATCAGGC при использовании рекомендуемого вектора, перечисленного в таблице материалов). С концом microtip, поцарапать выбранную колонию и перенести клетки к 20 l смеси реакции содержа 0.5 qM каждой грунтовки и 10 qL коммерчески смешивания полимеразы дна Taq.
    7. Вы запустите скрининг ПЦР по следующей схеме: 5 мин при 95 градусов по Цельсию в качестве шага денатурации, 30 циклов по 3 шага (30 с при 95 градусов по Цельсию, 30 с при 55 градусов по Цельсию, 90 с при 72 градусах по Цельсию) и 10 минут при 72 градусе по Цельсию в качестве заключительного шага.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реакции ПЦР могут храниться на ночь в машине ПЦР при 12 градусах Цельсия.
    8. Загрузите 10 мкл каждой реакции ПЦР на 0,8% агарозного геля, приготовленного в буфере Tris-acetate-EDTA (TAE). Вы запустите электрофорез в течение 25 минут при 100 В.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается 1,1 кбп ампликона.
    9. Извлекайте плазмиды у кандидатов, использующих коммерческий комплект(Таблица материалов)и последовательность их, используя ту же грунтовую пару, используемую в шаге 1.1.6.
  2. Культура клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда подходящий кандидат был определен путем последовательности, клон может быть непосредственно использован в качестве выражения при использовании рекомендуемого вектора(Таблица материалов). В этом случае выражение контролируется арабинозным PBAD промоутер 32.
    1. Прививка 10 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина с кандидатом и инкубировать прекультуры ночь при 37 градусов по Цельсию под орбитальной тряски. Добавьте 5 мл прекультуры в 1 л среды LB со 100 мкг/мл ампициллина. Ум уважать соотношение воздуха к жидкости 3.
    2. Пусть клетки растут при 37 градусов по Цельсию под орбитальной тряской. Мониторинг оптической плотности на уровне 660 нм (OD660).
    3. Когда OD660 достиг 0,5–0,6, быстро охладив культуру в течение 5 минут на льду и перенесите ее в инкубатор, установленный до 18 градусов по Цельсию.
    4. Добавьте 0,2 г/л арабинозы, чтобы вызвать экспрессию генов и инкубировать в течение 12–18 ч при 18 градусах Цельсия.
    5. Урожай клеток путем центрифугирования культуры на 6000 х г в течение 30 мин при 4 градусов по Цельсию. Откажитесь от супернатантов и промыть клетки 100 мл 0,9% (w/v) NaCl.
    6. Центрифуга снова при 6000 х г в течение 15 мин при 4 градусов по Цельсию и отбросить супернатант.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные гранулы можно использовать непосредственно для извлечения белка или хранить при -80 градусов по Цельсию.
  3. Очищение белка
    1. Повторное производство клеточных гранул в 40 мл 50 мМ MOPS, 1 мМ CoCl2, рН 7,2. Добавьте 1 МКЛ из 25 U/L ДНК/эндонуклеазы РНК и одну таблетку ингибитора протеазы коктейль, который не содержит ЭДТА. Sonicate подвески в импульсном режиме под охлаждением в течение 30 мин.
    2. Центрифуга сырой экстракт при 20000 х г в течение 30 мин при 4 градусов по Цельсию. Соберите супернатант и нагрейте его на водяной бане при температуре 70 градусов по Цельсию в течение 10 минут.
    3. Центрифуга экстракт денатурированных клеток на 20000 х г в течение 30 мин при 4 градусов по Цельсию и собирать супернатант для очистки.
    4. Используйте подходящую смолуанионные обмены (Таблицаматериалов), упакованную в колонку объемом 15 мл. Обратитесь к рекомендациям производителя по скорости рабочего потока и пределу давления столбца. Эквилибрировать смолу с 50 мММ MOPS, 1 мМм CoCl2, рН 7,2.
    5. Загрузите супернатант, собранный из шага 1.3.3, в столбец. Мониторинг поглощения элуата при 280 нм. Когда он достиг базового уровня, перейти к elution.
    6. Применить градиент от 0 до 0,5 М. NaCl в 50 мММ MOPS, 1 мМ CoCl2, рН 7,2 для 5 объемов колонки (CV). Подождите, пока проводимость стабилизируется и поглощение достигло базового уровня.
    7. Применить окончательный градиент от 0,5 до 1 М NaCl в 50 мММ MOPS, 1 мМ CoCl2, рН 7,2 за 1 резюме.
    8. Проанализируйте некоторые фракции (см. рисунок 2A для руководства) по натриевому додекиловому полиакриламиниду гель электрофореза (SDS-PAGE).
      ПРИМЕЧАНИЕ: TmPep1050 появляется как 36 kDa группы после Coomassie окрашивания. Кроме того, наличие TmPep1050 может быть подтверждено анализом активности (см. раздел 2.1). На этом этапе фракции могут храниться при 4 градусах Цельсия в течение ночи.
    9. Бассейн фракций, содержащих TmPep1050 и добавить мелко молотый порошок (NH4)2SO4, чтобы получить концентрацию 1,5 М (NH4)2SO4. Смешайте осторожно, инвертирование трубки вверх дном до полного растворения.
    10. Используйте гидрофобнуюсмолу взаимодействия (Таблицаматериалов), упакованную в колонку объемом 30 мл. Обратитесь к рекомендациям производителя по скорости рабочего потока и пределу давления столбца. Эквилибрировать смолу с 50 мММ MOPS, 1,5М(NH 4 )2SO4, 1 мМ CoCl2, рН 7,2.
    11. Загрузите образец на столбец и отслеживайте абсорбт eluate на 280 nm. Когда абсорбация достигла базового уровня, элют связанных белков, применяя градиент от 1,5 М до 0М(NH 4 )2SO4 в 50 мММ MOPS, 1 мММ CoCl2, рН 7,2 для 5 резюме.
    12. Проанализируйте некоторые фракции (см. рисунок 2B для руководства) SDS-PAGE.
      ПРИМЕЧАНИЕ: TmPep1050 появляется как 36 kDa группы после Coomassie окрашивания. Кроме того, наличие TmPep1050 может быть подтверждено анализом активности (см. раздел 2.1). На этом этапе фракции могут храниться при 4 градусах Цельсия в течение ночи.
    13. Бассейн фракций, содержащих TmPep1050 и сосредоточиться на 2 мл с использованием ультрафильтрационных единиц с 30 kDa отсечения (Таблица материалов). Перейти к разделу 1.4, чтобы определить молекулярный вес.
  4. Хроматография исключения размера
    1. Используйте смолу исключенияразмера (Таблица материалов),упакованную в колонку объемом 120 мл. Обратитесь к рекомендациям производителя по скорости рабочего потока и пределу давления столбца. Эквилибрировать смолу с 50 мММ MOPS, 0,5М(NH 4 )2SO4, 1 мМ CoCl2, рН 7,2.
    2. Загрузите образец на столбец и отслеживайте абсорбт eluate на 280 nm. Фракционо из столбца мертвого тома (0,33 CV) до конца элюции (1 CV).
    3. Измерьте объем элюции для каждого наблюдаемого пика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для руководства, dodecameric TmPep1050 elutes на 82 мл (Рисунок 3A) в нынешних экспериментальных условиях, в то время как димерик TmPep1050, таких как TmPep1050H60A H307A вариант, elutes на 95 мл (Рисунок 3B). Некоторые TmPep1050 могут принять обе олигомерные формы, такие как TmPep1050H60A (Рисунок 3C).
    4. Анализ фракций, соответствующих максиме и хвостам наблюдаемых пиков с помощью SDS-PAGE.
      ПРИМЕЧАНИЕ: TmPep1050 появляется как 36 kDa группы после Coomassie окрашивания.
    5. Бассейн фракций каждого пика и сосредоточиться с помощью ультрафильтрационных единиц с 30 kDa отсечения (Таблица материалов), чтобы получить концентрацию в 300 мкМ.
    6. Измерьте абсорбанс в 280 нм на нанообумном спектрофотометре и рассчитайте концентрацию с помощью молекулярного коэффициента вымирания 18 910М -1 см -1.
    7. Храните очищенный белок при -18 градусов по Цельсию.
    8. Чтобы определить молекулярный вес, откалибровать столбец хроматографии исключения размера (SEC) с использованием молекулярных стандартов веса(Таблица материалов). Проанализируйте стандарты с использованием 50 мММ MOPS,0,5 М(NH 4 )2SO4, 1 мМ CoCl2 рН 7,2 в качестве бегущего буфера.

2. Анализ активности и препарат апо-фермента

ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначально апо-фермент был подготовлен путем разбавления 1 тома TmPep1050 в 10 томах 2,1 М малой кислоты рН 7.0 и концентрации обратно до 1 тома додиализа 11. Ниже представлена альтернативная процедура с использованием 1,10-фенантролина, металлического ионового хелатора. Эта процедура уменьшает потерю белка и дает те же результаты, что и ранее опубликованный метод.

  1. Анализ деятельности
    1. Приготовьте запас раствора 100 мМ Л-Лейцин-р-нитроанилид(таблица материалов)в метаноле.
    2. Добавьте 25 л 100 мМ L-Лейцин-р-нитроанилид в 965 МКЛ из 50 мММ MOPS, 250 МКМ CoCl2, рН 7,2, 10% метанола. Предустановить смесь реакции при 75 градусов по Цельсию в сухой ванне.
    3. Разбавить фермент в 50 мММ MOPS рН 7,2 до концентрации 1 МКМ. Добавить 10 йл в смесь реакции, вихрь, и инкубировать при 75 градусов по Цельсию либо до тех пор, пока он стал желтоватым или в течение 1 ч.
    4. Остановите реакцию, добавив 1 мл 20% уксусной кислоты. Вихрь хорошо и дайте ему остыть до комнатной температуры.
    5. Перенесите смесь реакции в спектрофотометрическую ячейку. Прочитайте абсорбанс на 410 нм против отрицательного контроля (инкубационная смесь реакции без фермента).
  2. Препарат Апо-фермента
    1. Подготовка запасного раствора 1 М 1,10-фенантролина в этаноле. Добавьте 10 МКЛ из 1,10-фенантролового раствора запасов в 890 МЛ 50 ММ MOPS, 0,5 М (NH4)2SO4, pH 7.2. Добавьте 100 мкл очищенной концентрации TmPep1050 (300 МКМ-1 мМ).
    2. Проверьте потерю активности, используя анализ активности, описанный в разделе 2.1, не добавляя CoCl2 в смесь реакции.
    3. Перенесите образец в диализную трубку. Диализ против 200 мл 50 мММ MOPS, 0,5 М (NH4)2SO4, рН 7,2 при 4 градусов по Цельсию. Обмен трижды диализ со свежим буфером во время 48 h диализа.
    4. Соберите образец из трубки диализа и сконцентрироваться обратно до 100 йл с помощью ультрафильтрационных блоков с 30 kDa отсечения (Таблица материалов). Проверьте концентрацию, читая абсорбанс на 280 нм с помощью нанообумного спектрофотометра.
  3. Димер подготовки
    1. Разбавить апо-фермент концентрацией 1 МКМ в 50 мММ MOPS, 0,5 М (NH4)2SO4, рН 7,2. Инкубировать в течение 2 ч при температуре 75 градусов по Цельсию в сухой ванне, а затем дайте образцу остыть до комнатной температуры.
    2. Сосредоточьте образец на концентрацию фермента не менее 50 МКМ. Проверьте молекулярный вес SEC (см. раздел 1.4). Пик элюции должен сместиться с 82 мл до 95 мл (в нынешних экспериментальных условиях).

3. Кристаллизация TmPep1050

ПРИМЕЧАНИЕ: Кристаллизация белка остается эмпирической наукой, поскольку она является многофакторным явлением33. В то время как некоторые параметры могут быть определены и контролируются (например, температура, рН, концентрация агента осадков), другие могут оказывать неуловимое влияние на кристаллизацию (например, белок и химическая чистота, протеолиз, история образцов). В настоящее время кристаллизация белка решается рациональным и систематическим образом благодаря куче коммерческих условий скрининга кристаллизации и автоматизации. Однако оптимизация состояния кристаллизации основывается главным образом на подходе проб и ошибок. Далее описан план кристаллизации белков и несколько советов по оптимизации условий кристаллизации.

  1. Скрининг кристаллизации
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используя коммерческие наборы кристаллизации, кристаллы додекамерика TmPep1050 были получены в 2.2 M DL-malic кислоты рН 7.0, 0.1 M Bis-Tris пропан рН 7.0 и 0.18 M три-аммоний цитрат, 20% полиэтиленгликоль (PEG) 3350. Кристаллы димерика TmPep1050 были получены в 0,1 М цитрат натрия рН 5,6, 0,2 М аммония ацетата, 30% PEG4000. Кристаллы додекамеров появляются в течение недели и достигают их полного размера в месяц. Кристаллы димеров обычно появляются в пределах 24 ч и вырастают до полного размера в неделю.
    1. Приобрети несколько комплектов коммерческой кристаллизации (см. таблицу материалов для примеров).
    2. Настройка кристаллизации пластин (Таблицаматериалов) дляметода подвешивной капли. Заполните скважины по 500 мкл каждого раствора комплекта для скрининга кристаллизации.
    3. Для каждого хорошо, создать поддержку кристаллизации. При поддержке откладывается капля очищенного белка в 1 л (обычно 10 мг/мл).
    4. Сразу же трубы 1 йл кристаллизации раствора из хорошо. Добавить его тщательно к капле белка и аккуратно перемешать, трубы вверх дном трижды. Капля должна оставаться полусферической без пузырьков.
    5. Винт поддержки на вершине соответствующего хорошо. Повторите операцию для всего комплекта.
    6. После настройки пластин, наблюдать каждую каплю с биноклем. Обратитесь к руководству пользователя комплекта кристаллизации для интерпретации (ясное падение, разделение фазы, осадок, иглы и т.д.).
    7. Инкубировать пластины при 20 градусов по Цельсию. Проверьте тарелки один раз в день в течение первой недели и один раз в неделю после этого.
    8. Оценка каждого хорошо, используя счет листа и руководство пользователя при условии, с кристаллизации комплектов.
  2. Оптимизация кристаллизации
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальные условия кристаллизации додекамерика TmPep1050 были оптимизированы до 2,1 М DL-малой кислоты рН 6,75 и 0,18 М триаммония цитрат рН 7,5, 40% (w/v) PEG3350, в то время как состояние кристаллизации димерика TmPep1050 было перенесено на 0,1 М цитрат натрия рН 6,0, 10% (w/v) PEG3350. Один цикл посева был необходим для улучшения кристаллизации. Далее описывается, как была оптимизирована кристаллизация вариантаTmPep1050 H60A H307A.
    1. Подготовка фондовых растворов буфера цитратов натрия 0,5 М при разном рН (4,5, 5,2 и 6,0) и 50% (w/v) растворе PEG3350.
    2. Настройка кристаллизации пластины в качестве матрицы рН против осадков агента (см. рисунок 4A).
    3. Инкубировать пластину при 20 градусов по Цельсию. Наблюдайте каждый хорошо с биноклем один раз в день в течение недели.
    4. Оценка каждого хорошо в соответствии с размером кристалла и формы. Выберите условие, дая кристаллы, по крайней мере 50 мкм. Приступайте к микросеям.
  3. Микросеяное осязание
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микросеяние является мощным методом для улучшения формы, размера и кристалличность кристаллов белка34. Более быстрый подход посева полоса посева с помощью кошки усы. Смотрите рисунок 4 в качестве примера того, как оптимизация кристаллизации и микросеяное катание улучшили форму и размер кристалла для TmPep1050H60A H307A.
    1. Подготовка семян с использованием выбранного хорошо в шаге 3.2.4.
    2. Увеличьте объем капли, содержащей кристаллы, до 10 мкл, добавив раствор кристаллизации из колодец. Труба капли и добавить 90 йл кристаллизации раствора из хорошо. Вихрь тщательно и держать семена на льду.
    3. Приготовьте несколько разбавлений семян: 1x, 10x, 25x и 100x. Vortex хорошо семена перед пипетки. Держите разбавления на льду.
    4. Для каждого разбавления семян, создать кристаллизацию пластины в качестве матрицы рН против осадков агента (см. рисунок 4B). Используйте фондовые решения, подготовленные в шаге 3.2.1.
    5. При падении добавьте 0,2 мл семян для капли 2 мл. Инкубировать пластину при 20 градусов по Цельсию. Наблюдайте каждый хорошо с биноклем один раз в день в течение недели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Распределение и форма размера кристалла должны быть улучшены, см. Рисунок 4C в качестве примера для TmPep1050H60A H307A. Для дальнейшего использования семена могут храниться при -20 градусов по Цельсию.

4. Рентгеновская дифракция

  1. Сбор кристаллов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка образцов зависит от рентгеновского источника объекта (домашний объект против синхротрона). Используйте устройства хранения (флаконы и корзину держателей флаконов) соответственно. Добавление криопротектора (например, глицерола) может потребоваться в зависимости от концентрации вещества соли/осадков. Для кристаллов TmPep1050 криопротектор не нужен, так как КОНЦЕНТРАЦИЯ ПЭГ или буфера достаточно высока, чтобы избежать кристаллов воды.
    1. Приготовьте ванну, наполненную жидким азотом, окунитесь в любые флаконы или корзину, используемую для обработки образцов.
    2. Настройка циклов сбора образцов разных размеров: 100, 150 и 200 мкм(таблица материалов). Выберите размеры в зависимости от размера кристалла.
    3. Используя бинокль, проверьте каплю, содержащую кристаллы и определить изолированные кристаллы (самый простой в использовании). С петлей, аккуратно выбрать кристалл снизу. Немедленно окунить петлю в жидкий азот и поместить петлю в подходящий флакон.
  2. Сбор данных
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор данных может сильно варьироваться в зависимости от источника рентгеновского излучения (домашний объект против синхротрона) и чувствительности детектора. Стратегия сбора также может сильно отличаться от выборки к другой, в зависимости от разрешения, интенсивности пятна, космической группы и т.д. Тема была широко рассмотрена Dauter35.
    1. Намонтировать петлю, несущую кристалл на гониометре головы дифрактометра.
    2. Настройте головку гониометра вдоль осей XY, чтобы выровнять кристалл с траекторией рентгеновского луча.
    3. Установите длину волны до 0,98 евро и переместите детектор, чтобы получить разрешение 2 К.
    4. Начните короткий сбор данных, приобретая изображения, по крайней мере, в двух различных кристаллических ориентациях. Возьмите 10 изображений (1 изображение на 0,1 ")) при 0 "и 90".
    5. Проверьте собранные изображения с помощью подходящего программного обеспечения (например, ADXV, XDS-Viewer или Albula Viewer). Определите интенсивность пятна и самое высокое разрешение, где видны пятна. Проверьте также монокристаллность и спот разделения.
    6. В конце концов, повторите шаги 4.2.3'4.2.5, изменив положение детектора на более высокое или нижнее разрешение и время экспозиции в соответствии с наблюдением.
    7. Начало сбора данных около 360 "с 1 изображение, принятое на 0,1 ". Не забудьте оптимально установить положение детектора и время экспозиции.

5. Индексация, молекулярная замена и модель здания

  1. Индексация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Индексация является методом измерения интенсивности дифракционных пятен, придавая амплитуды структурных факторов36. Четыре пакета программного обеспечения обычно используются для обработки собранныхизображений:Mosflm 37 , HKL200038, DIALS39, и XDS40. Последний был использован для индексации наборов данных, полученных из TmPep1050 кристаллической дифракции.
    1. Установите пакет XDS и XDSME41. При обработке файлов HDF5 установите плагин XDS Neggia (доступен на веб-сайте Dectris). Для получения дополнительной информации посетите веб-страницу XDS wiki https://strucbio.biologie.uni-konstanz.de/xdswiki/index.php/Main_Page и веб-страницу XDSME https://github.com/legrandp/xdsme.
    2. Перед обработкой данных создайте папку, из которой будет работать XDS. Найдите путь к изображениям.
    3. Для запуска XDSME введите xdsme /path_to_images/image.extension в окне терминала.
    4. После того, как XDS закончил работу, проверьте CORRECT. LP файл. Обратите внимание на вероятность определения космической группы, полноту данных, наивысшее разрешение, кристаллическую мозаику и качество данных. Проверьте также XDS_pointless.log, чтобы получить вероятность космических групп.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите рисунок 5 в качестве примера вывода.
    5. Повторное запуск XDSME с различными решениями космической группы, предложенными XDS в отдельной папке, чтобы избежать перезаписи предыдущего процесса. Тип xdsme -s space_group_name -c "unit_cell_parameters" /path_to_images/image.extension (например, xdsme -s P21 -c "43.295 137.812 61.118 90.000 110.716 90.000).
    6. Проверьте CORRECT. LP файлы и выбрать лучшее решение на основе статистики данных.
    7. Вы запустите XSCALE, введя xscale.py XDS_ASCII. HKL. Вы запустите XDSCONV, введя xdsconv.py XSCALE. HKL ccp4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых случаях XDSME не удается определить космическую группу или не удается сократить диапазон разрешения должным образом или генерирует странные статистические данные. Если такая проблема возникает, стоит запустить XDS на родном языке. В XDS необходимо ввести несколько параметров. Файл инициации INP (см. страницу вики XDS). При использовании XDS вероятность возможных космических групп может быть проверена с помощью Pointless, части пакета CCP442. Чтобы сократить разрешение набора данных, Rmeas lt; 60% и I/σ No2 обычно принимаются для определения наивысшего разрешения43. Однако молекулярная замена и уточнение модели могут быть улучшены путем расширения разрешения до I/σ 0,5–1,5 и CC1/2 до 0,2–0,444.
  2. Молекулярная замена
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальные данные дают доступ к амплитуде структурных факторов, но, не зная фазы, они бесполезны. Фаза может быть определена экспериментально различными методами, опираясь на аномальный сигнал (от тяжелого атома, например)45. Молекулярная замена является еще одним методом определения фазы без аномального рассеянияатома 46,47. Этот метод использует координаты связанной молекулы, чтобы найти и улучшить фазу итеративно. Мы используем Phaser48 в Phenix GUI49 для молекулярной замены.
    1. Подготовь стартовую модель для молекулярной замены с использованием координат 4P6Y. Из файла pdb извлекайте мономер А и усейте его аминокислоты в аланине с помощью файлового редактора PDB в Phenix (под вкладкой инструментов Model).
    2. Вы запустите Xtriage в Фениксе (под вкладкой анализа данных) с файлом отражения, генерируемым XDSCONV (5.1.9) и последовательностью в качестве входных данных.
    3. Проверьте файл журнала из Xtriage. Обратите внимание на полноту, количество подразделений в асимметричном блоке, анисотропию, наличие ледяных колец и побратимство.
    4. Вы запустите Phaser-MR в Фениксе (под вкладкой молекулярной замены) для молекулярной замены с использованием файла отражения, последовательности и стартовой модели 4P6Y, усеченной в поли аланине (шаг 5.2.1).
    5. По завершении, проверьте, если модель была найдена и оценка молекулярной замены. Коэффициент перевода no-score (TF) по крайней мере 8 указывает на то, что решение является окончательно правильным.
  3. Модель здания
    ПРИМЕЧАНИЕ: После определения фазы молекулярной заменой модель должна быть построена и усовершенствована. Этот протокол использует Phenix GUI49 для автоматического строительства и итеративных уточнений, и Coot50 для ручного построения и уточнения структуры.
    1. После молекулярной замены с помощью Фазы-MR в Фениксе, выберите Run Autobuild. Все необходимые файлы будут добавлены автоматически. Просто нажмите Run, чтобы начать автозастроение.
    2. По завершении проверки модели в Куте. Создавайте и совершенствуйте модель вручную в соответствии с картой плотности электронов в Куте.
    3. Уточните вручную кураторную модель в Phenix (во вкладке Уточнение) с помощью модели, последовательности и данных дифракции в качестве входных данных. Обратитесь к Phenix помочь выбрать правильную стратегию.
    4. После уточнения проверьте результаты: Rfree и R работадолжны уменьшиться, индикаторы Molprobity51 должны соблюдаться, а выбросы с низкой корреляцией реального пространства должны быть ограничены.
    5. Повторите шаги 5.3.2'5.3.4 до тех пор, пока не будет создана лучшая усовершенствованная модель.
    6. Запустите Molprobity на сервере: http://molprobity.biochem.duke.edu/. Проверьте любые выбросы, выявленные Molprobity.
    7. В конце концов повторите шаги 5.3.2'5.3.6 до тех пор, пока не будет получена лучшая усовершенствованная модель.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для изучения возможной диссоциации додекамера в мономеры в TmPep1050, его-60 и его-307 кодоны были заменены аланином кодоном с использованием синтетического гена. Затем этот ген был клонирован в векторе PBAD для выражения и очистки соответствующего варианта TmPep1050, впоследствии названного TmPep1050H60A H307A. Хроматография исключения размера(рисунок 3B) показала что очищенный протеин имел явно молекулярный вес 56 kDa (молекулярный вес monomer 36.0 kDa). Аналогичный видимый моле...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный в настоящем настоящем протоколе позволяет понять переход TmPep1050 на структурном уровне. Методология была испытана ранее для определения структуры обоих TmPep1050 олигомеров11. Наиболее сложным шагом было найти условия, способствующие разобщению додекамеров в стабильные димеры. Такие условия должны были быть достаточно мягкими, чтобы позволить реассоциацию димеров в додекамеры, когда был добавлен кофактор ионов металла. Разделение олигомеров было также критическим шагом, поскольку оно о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Мартину Руверс за то, что она корректировал этот документ и давал конструктивные комментарии. Доступ к лучей Proxima 2 (SYNChrotron SOLEIL) был в пределах групп распределения блоков 20151139.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,10-фенантролинSigma-Aldrich13, 137-7
Amicon Ultra 0,5 мл Центробежные фильтры Ultracel 30KMerck MilliporeUFC503096
Amicon Ultra 15 Центробежные фильтры Ultracel 30KMerck MilliporeUFC903024
бензоназа нуклеазаMerck Millipore70664-3
CCP4N/Aпосетить http://www.ccp4.ac.uk/
cOmplete EDTA-freeRoche5056489001
CootN/Aпосетить https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Crystal Screen IHamptonResearch HR2-110
Crystal Screen IIHampton ResearchHR2-112
DreamTaq Green PCR Master MixThermoFisher ScientificK1082
EasyXtal 15-луночный инструментNeXtal132007
Escherichia coli штамм PPY Н/Дсм. ссылку 31
Escherichia coli XL1 синий штаммAgilent200249
Гель Фильтрация Калибровочный набор HMWGE Здравоохранение Медико-биологические науки28-4038-42
Набор для калибровки фильтрации геля LMWGE Здравоохранение Медико-биологические науки28-4038-41
Стандарт фильтрации геляBiorad1511901
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermoFisher ScientificK0503
IndexHampton ResearchHR2-144
LitholoopsМолекулярные размеры
L-лейцин--нитроанилидBachem AG
Natrix 1Hampton ResearchHR2-116
Natrix 2Hampton ResearchHR2-117
Плагин NeggiaDectrisN/Aпосетить https://www.dectris.com/
NeXtal Tubes JCSG Core Suite INeXtal130724
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IINeXtal130725
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IIINeXtal130726
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IVNeXtal130727
pBAD-TOPOThermoFisher ScientificK430001
PhenixN/AVisit https://www.phenix-online.org/
Phusion High-Fidelity DNA polymeraseThermoFisher ScientificF-530L
Salt RX 1Hampton ResearchHR2-107
Salt RX 2Hampton ResearchHR2-109
Трубка для диализа SnakeSkin, 3.5K MWCOThermoFisher Scientific88242
Источник 15PheGE Healthcare Медико-биологическиенауки 17014702
Источник 15QGE Healthcare Медико-биологические науки17094705
Superdex 200 подготовительный классGE Healthcare Life Sciences17104301
штамм Thermotoga maritima MSB8American Type Culture CollectionATCC 43589
TmCD00089984DNASU Плазмидный репозиторийН/Д
XDSН/Дпосещение http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsmeН/Дпосещение https://github.com/legrandp/xdsme
40010720025

Ссылки

  1. Levy, E. D., Teichmann, S. A. Structural, Evolutionary, and Assembly Principles of Protein Oligomerization. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 117, 25-51 (2013).
  2. Selwood, T., Jaffe, E. K. Dynamic dissociating homo-oligomers and the control of protein function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 131-143 (2012).
  3. Jaffe, E. K. The Remarkable Character of Porphobilinogen Synthase. Accounts of Chemical Research. 49 (11), 2509-2517 (2016).
  4. Ramström, H., et al. Properties and Regulation of the Bifunctional Enzyme HPr Kinase/Phosphatase in Bacillus subtilis. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 1174-1185 (2003).
  5. Rudyak, S. G., Brenowitz, M., Shrader, T. E. Mg2+-Linked Oligomerization Modulates the Catalytic Activiy of the Lon (La) Protease from Mycobacterium smegmatis. Biochemistry. 40 (31), 9317-9323 (2001).
  6. Yamamoto, S., Storey, K. B. Dissociation-Association of lactate dehydrogenase Isozymes: Influences on the formation of tetramers vs. dimers of M4-LDH and H4-LDH. International Journal of Biochemistry. 20 (11), 1261-1265 (1988).
  7. Sirover, M. A. Structural analysis of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase functional diversity. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 57, 20-26 (2014).
  8. Gupta, V., Bamezai, R. N. K. Human pyruvate kinase M2: A multifunctional protein: Multifunctional Human PKM2. Protein Science. 19 (11), 2031-2044 (2010).
  9. Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: Structure, Control, and Mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
  10. Libonati, M., Gotte, G. Oligomerization of bovine ribonuclease A: structural and functional features of its multimers. Biochemical Journal. 380 (2), 311-327 (2004).
  11. Dutoit, R., et al. How metal cofactors drive dimer-dodecamer transition of the M42 aminopeptidase TmPep1050 of Thermotoga maritima. Journal of Biological Chemistry. 294 (47), 17777-17789 (2019).
  12. Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 624-632 (2018).
  13. Neuwald, A. F., Liu, J. S., Lipman, D. J., Lawrence, C. E. Extracting protein alignment models from the sequence database. Nucleic Acids Research. 25 (9), 1665-1677 (1997).
  14. Dutoit, R., Brandt, N., Legrain, C., Bauvois, C. Functional Characterization of Two M42 Aminopeptidases Erroneously Annotated as Cellulases. PLoS ONE. 7 (11), 50639(2012).
  15. Franzetti, B., et al. Tetrahedral aminopeptidase: a novel large protease complex from archaea. The EMBO Journal. 21 (9), 2132-2138 (2002).
  16. Borissenko, L., Groll, M. Crystal Structure of TET Protease Reveals Complementary Protein Degradation Pathways in Prokaryotes. Journal of Molecular Biology. 346 (5), 1207-1219 (2005).
  17. Appolaire, A., et al. TET peptidases: A family of tetrahedral complexes conserved in prokaryotes. Biochimie. 122, 188-196 (2016).
  18. Russo, S., Baumann, U. Crystal Structure of a Dodecameric Tetrahedral-shaped Aminopeptidase. Journal of Biological Chemistry. 279 (49), 51275-51281 (2004).
  19. Schoehn, G., et al. An Archaeal Peptidase Assembles into Two Different Quaternary Structures: A tetrahedron and a giant octahedron. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 36327-36337 (2006).
  20. Durá, M. A., et al. The structural and biochemical characterizations of a novel TET peptidase complex from Pyrococcus horikoshii reveal an integrated peptide degradation system in hyperthermophilic Archaea: Characterization of P. horikoshii TET3 peptidase. Molecular Microbiology. 72 (1), 26-40 (2009).
  21. Basbous, H., Appolaire, A., Girard, E., Franzetti, B. Characterization of a Glycyl-Specific TET Aminopeptidase Complex from Pyrococcus horikoshii. Journal of Bacteriology. 200 (17), 00059(2018).
  22. Appolaire, A., et al. Small-angle neutron scattering reveals the assembly mode and oligomeric architecture of TET, a large, dodecameric aminopeptidase. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 70 (11), 2983-2993 (2014).
  23. Appolaire, A., et al. The TET2 and TET3 aminopeptidases from P yrococcus horikoshii form a hetero-subunit peptidasome with enhanced peptide destruction properties: TET aminopeptidase multi-subunit complex. Molecular Microbiology. 94 (4), 803-814 (2014).
  24. Colombo, M., Girard, E., Franzetti, B. Tuned by metals: the TET peptidase activity is controlled by 3 metal binding sites. Scientific Reports. 6 (1), 20876(2016).
  25. Petrova, T. E., et al. Structure of the dodecamer of the aminopeptidase APDkam598 from the archaeon Desulfurococcus kamchatkensis. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (3), 277-285 (2015).
  26. Kim, D., et al. Structural basis for the substrate specificity of PepA from Streptococcus pneumoniae, a dodecameric tetrahedral protease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391 (1), 431-436 (2010).
  27. Chevrier, B., et al. Crystal structure of Aeromonas proteolytica aminopeptidase: a prototypical member of the co-catalytic zinc enzyme family. Structure. 2, 283-291 (1994).
  28. Rosenbaum, E., Ferruit, M., Durá, M. A., Franzetti, B. Studies on the parameters controlling the stability of the TET peptidase superstructure from Pyrococcus horikoshii revealed a crucial role of pH and catalytic metals in the oligomerization process. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1814 (10), 1289-1294 (2011).
  29. Macek, P., et al. Unraveling self-assembly pathways of the 468-kDa proteolytic machine TET2. Science Advances. 3 (4), 1601601(2017).
  30. Edelheit, O., Hanukoglu, A., Hanukoglu, I. Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies. BMC Biotechnology. 9 (1), 61(2009).
  31. Zhang, Y., Werling, U., Edelmann, W. SLiCE: a novel bacterial cell extract-based DNA cloning method. Nucleic Acids Research. 40 (8), 55(2012).
  32. Schleif, R. AraC protein, regulation of the l-arabinose operon in Escherichia coli, and the light switch mechanism of AraC action. FEMS Microbiology Reviews. 34 (5), 779-796 (2010).
  33. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).
  34. Bergfors, T. Seeds to crystals. Journal of Structural Biology. 142 (1), 66-76 (2003).
  35. Dauter, Z. Collection of X-Ray Diffraction Data from Macromolecular Crystals. Protein Crystallography. 1607, 165-184 (2017).
  36. Powell, H. R. X-ray data processing. Bioscience Reports. 37 (5), 0227(2017).
  37. Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 271-281 (2011).
  38. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  39. Clabbers, M. T. B., Gruene, T., Parkhurst, J. M., Abrahams, J. P., Waterman, D. G. Electron diffraction data processing with DIALS. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (6), 506-518 (2018).
  40. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  41. Legrand, P. legrandp/xdsme: March 2019 version working with the latest XDS version. , Jan 26, 2018. Zenodo (2019).
  42. Evans, P. Scaling and assessment of data quality. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (1), 72-82 (2006).
  43. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for non-crystallographers, or how to get the best (but not more) from published macromolecular structures: Protein crystallography for non-crystallographers. FEBS Journal. 275 (1), 1-21 (2008).
  44. Karplus, P. A., Diederichs, K. Assessing and maximizing data quality in macromolecular crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 34, 60-68 (2015).
  45. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  46. Rossmann, M. G., Blow, D. M. The detection of sub-units within the crystallographic asymmetric unit. Acta Crystallographica. 15, 24-31 (1962).
  47. Rossmann, M. G. The molecular replacement method. Acta Crystallographica Section A Foundations of Crystallography. 46 (2), 73-82 (1990).
  48. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  49. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).
  50. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  51. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (1), 12-21 (2010).
  52. Zwart, P. H., Grosse-Kunstleve, R. W., Lebedev, A. A., Murshudov, G. N., Adams, P. D. Surprises and pitfalls arising from (pseudo)symmetry. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 99-107 (2008).
  53. Yeates, T. O. Detecting and overcoming crystal twinning. Methods in Enzymology. 276, 344-358 (1997).
  54. Terwilliger, T. C. Using prime-and-switch phasing to reduce model bias in molecular replacement. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 60 (12), 2144-2149 (2004).
  55. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 61-69 (2008).
  56. Krissinel, E., Henrick, K. Inference of Macromolecular Assemblies from Crystalline State. Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Очистка додекамераподготовка димераэксклюзионная хроматографиямолекулярная заменауточнение структуры в Phenixнативная масс-спектрометрия
Рентгеновская кристаллография для изучения олигомерского государства Переход Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.